本公開廣泛地涉及通過工程化以包含一個或多于一個目標結(jié)合結(jié)構(gòu)域/觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酶。

背景技術(shù)：

1、細胞和個體中的編碼rna和非編碼rna的水平和表達圖譜提供了有關(guān)生物學(xué)狀態(tài)和疾病狀態(tài)的大量信息。

2、因此，對rna檢測和定量的方法一直是分子生物學(xué)的支柱，并隨著技術(shù)精密度的提高而不斷發(fā)展。傳統(tǒng)的rt-qpcr和原位雜交方法仍在被常規(guī)使用，并輔以最先進的單細胞rna測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法以回答日益復(fù)雜的生物學(xué)問題。現(xiàn)在能精確測定大多數(shù)細胞的rna含量，從而允許探測正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組的分子功能和細胞功能。此外，細胞和系統(tǒng)的rna生物標志物對于疾病診斷和臨床決策指導(dǎo)也很重要。

3、盡管原位rna檢測有許多重要的應(yīng)用，但目前還沒有通用的方法能夠直接感知特定的rna信號，并將其轉(zhuǎn)換為第二功能性非編碼rna讀出(readout)。這種方法可以是基因編碼的，并作為緊湊型基因開關(guān)，將rna環(huán)境轉(zhuǎn)換為功能性輸出。已經(jīng)為一些基因調(diào)控系統(tǒng)開發(fā)了rna感應(yīng)的基因開關(guān)，最值得注意的是crispr。例如，已有向?qū)na被修飾以響應(yīng)向?qū)чg隔區(qū)或其他區(qū)域處的反義阻斷序列，從而能夠通過立足點介導(dǎo)的鏈置換來響應(yīng)rna觸發(fā)因子或rna配體而被激活或失活，并且已有crispr機制被修飾以在微rna發(fā)揮功能時被條件性激活，例如微rna指導(dǎo)的ago2切割和sgrna釋放，以及mirna調(diào)控的cas9?mrna。許多這些系統(tǒng)都有序列限制，因為它們的設(shè)計涉及grna關(guān)鍵區(qū)域的鏈置換或者需要多個rna或蛋白質(zhì)的組件。當(dāng)向?qū)na本身被以這種方式修飾時，需要仔細設(shè)計轉(zhuǎn)換機制，以使sgrna的功能和特異性不受影響。它們也是crispr特異性的，不能被推廣用于將rna信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至其他的功能性非編碼rna途徑，例如shrna、反義轉(zhuǎn)換或剪接轉(zhuǎn)換的寡核苷酸和rna適配體。

4、因此，需要能夠?qū)na信號或其他核酸信號的結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)為功能rna釋放的分子系統(tǒng)。本公開以核酶的形式提供了解決方案，所述核酶通過工程化以能夠在結(jié)合序列互補性觸發(fā)因子時釋放功能rna。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在一個方面中，提供了核酶，其包含：

2、a)一個或多于一個能夠在活性狀態(tài)與非活性狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的催化結(jié)構(gòu)域；

3、b)一個或多于一個可釋放的rna片段，其中所述可釋放的rna片段中的每一個的側(cè)翼有兩個核酶切割位點，其中在每個切割位點處的切割是由一個或多于一個處于活性狀態(tài)的催化結(jié)構(gòu)域中的至少一個所催化的；

4、c)一個或多于一個觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中的每一個都用于結(jié)合觸發(fā)核酸分子；其中一個或多于一個催化結(jié)構(gòu)域中的每一個都與一個或多于一個觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個連接；

5、其中當(dāng)連接到所述催化結(jié)構(gòu)域的觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域未被觸發(fā)核酸分子結(jié)合時，催化結(jié)構(gòu)域處于非活性狀態(tài)，并且其中當(dāng)連接到所述催化結(jié)構(gòu)域的觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域被觸發(fā)核酸分子結(jié)合時，催化結(jié)構(gòu)域處于活性狀態(tài)；并且

6、其中當(dāng)可釋放的rna片段側(cè)翼的兩個切割位點均被切割時，一個或多于一個可釋放的rna片段從核酶中釋放，

7、其中核酶包含具有以下基序的rna鏈

8、基序[a]和基序[a]，其中基序[a]和基序[a]構(gòu)成用于結(jié)合觸發(fā)核酸分子的觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域；

9、基序[b]和基序[b]，其中基序[b]和基序[b]構(gòu)成當(dāng)觸發(fā)核酸被結(jié)合時作為通信模塊以穩(wěn)定催化結(jié)構(gòu)域的接頭，其中基序[b]和基序[b]的長度獨立地為至少1個核苷酸；

10、基序[c]和基序[c]，其中基序[c]和基序[c]構(gòu)成催化結(jié)構(gòu)域；

11、基序[d]，其中基序[d]包含當(dāng)被催化結(jié)構(gòu)域催化時能夠被切割的第一切割位點；

12、基序[d']，其中基序[d']包含當(dāng)被催化結(jié)構(gòu)域催化時能夠被切割的第二切割位點；

13、基序[e]，其中基序[e]包含可釋放的rna片段；

14、基序[e]，其中基序[e]包含與基序[e]的序列部分互補或完全互補的序列；

15、并且其中基序之間通過一個或多于一個任選的接頭區(qū)域連接。

16、在一些實施例中，基序[c]與基序[d]之間的接頭選自雙通道接頭、三通道接頭、四通道接頭、莖、單核苷酸凸起、二核苷酸凸起、三核苷酸凸起、多核苷酸凸起及其組合。

17、在一些實施例中，基序[c]與基序[d]之間的接頭包括三通道接頭和莖。

18、在一些實施例中，將接頭連接至基序[d]的莖序列的長度為4個至12個核苷酸。

19、在一些實施例中，將基序[c]和基序[c]連接至接頭的莖序列的長度為4個至12個核苷酸。

20、在一些實施例中，觸發(fā)核酸分子包含與觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域互補的區(qū)域，其中所述區(qū)域的長度超過10個核苷酸，任選地一個或多于一個觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合相同的觸發(fā)核酸分子。

21、在一些實施例中，可釋放的rna片段的長度為6個至150個核苷酸。

22、在一些實施例中，可釋放的rna片段包含與一個或多于一個觸發(fā)rna分子中的至少一種相同的序列。

23、在一些實施例中，可釋放的rna片段是選自小向?qū)na(sgrna)、向?qū)na(grna)、短發(fā)夾rna(shrna)和rna適配體的功能rna。

24、在一些實施例中，基序[b]和基序[b]的長度獨立地為1個或多于1個核苷酸，任選地為3個或多于3個核苷酸。

25、在一些實施例中，基序[b]和基序[b]具有選自seq?id?no:1(5’-acg/cgu-3’)、seqid?no:2(5’-acg/cga-3’)、seq?id?no:449(5’-acg/uga-3’)、seq?id?no:450(5’-aug/cga-3’)、seq?id?no:451(5’-aug/uga-3’)、seq?id?no:452(5’-cg/cg-3’)、seq?id?no:453(5’-uug/ugg-3’)、seq?id?no:454(5’-uau/aua-3’)、seq?id?no:455(5’-acu/aga-3’)、seq?idno:456(5’-aug/caa-3’)、seq?id?no:457(5’-cu/ag-3’)和seq?id?no:458(5’-ug/ca-3’)的序列。

26、在一些實施例中，如果基序[e]和基序[e]彼此部分互補，則基序[e]和基序[e]之間的互補性的特征在于交替的互補區(qū)和非互補區(qū)。

27、在一些實施例中，基序[d]包含與核苷酸n+3配對的核苷酸n7的突變。

28、在一些實施例中，任選的接頭區(qū)域獨立地或共同地形成一個或多于一個二級結(jié)構(gòu)，任選地一個或多于一個二級結(jié)構(gòu)選自：單核苷酸凸起、二核苷酸凸起、三核苷酸凸起、多核苷酸凸起、莖、莖環(huán)、t-rna型結(jié)構(gòu)、三葉草型結(jié)構(gòu)、四環(huán)、假結(jié)、對稱內(nèi)環(huán)、不對稱內(nèi)環(huán)、三莖接頭(3通道接頭)、四莖接頭(4通道接頭)、二莖接頭(2通道接頭)或同軸堆積或其組合。

29、在一些實施例中，核酶復(fù)合物包含seq?id?no:3至seq?id?no:448中的任意一個或多于一個的序列。

30、在一些實施例中，核酶還包含一個或多于一個修飾。

31、在一些實施例中，觸發(fā)核酸包含一個或多于一個經(jīng)修飾的核苷酸。

32、在其他方面中，提供了檢測樣品中存在目標核酸分子/觸發(fā)核酸分子的方法，其中方法包括：

33、在允許目標核酸分子/觸發(fā)核酸分子與包含在所述核酶中的一個或多于一個目標結(jié)合結(jié)構(gòu)域/觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的溫度t1下，用如本文所公開的核酶孵育樣品；

34、在允許核酸分子和rna片段從所述核酶中釋放的溫度t2下孵育樣品；

35、檢測可釋放的rna片段從所述核酶中的釋放。

36、在另一其他方面中，提供了檢測樣品中目標核酸上的目標序列或目標突變的存在的方法，其中方法包括：

37、用如本文所公開的核酶孵育樣品，從而允許目標核酸分子與所述核酶中包含的一個或多于一個目標結(jié)合結(jié)構(gòu)域/觸發(fā)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合；

38、孵育樣品，以允許核酸分子與可釋放的rna片段從所述核酶中釋放；

39、檢測可釋放的rna片段從所述核酶中的釋放；

40、其中可釋放的rna片段是sgrna或shrna；其中對樣品中的目標序列或目標突變的檢測導(dǎo)致信號生成。

41、在一些實施例中，觸發(fā)核酸分子是病毒基因組或其片段。

42、在另一其他方面中，提供了包含如本文所公開的核酶的試劑盒。