背景技術(shù)：

1、聚乙烯(pe)占合成塑料生產(chǎn)的30％，很大程度上促成了地球上迄今為止的塑料廢物污染。與聚丙烯(polypropylene，pp)、聚苯乙烯(polystyrene，ps)和聚氯乙烯(polyvinylchloride，pvc)一起，pe是最具抗性的聚合物之一，具有以晶體、致密結(jié)構(gòu)組織的非常長的c-c鏈。鑒于數(shù)億噸塑料廢物的累積以及仍在加快的塑料生產(chǎn)速度，塑料剩余物的再利用是減輕塑料污染問題嚴(yán)重性的必要途徑，并同時提供了可獲得的巨大潛在碳儲庫。迄今為止，僅機(jī)械回收正在以大規(guī)模應(yīng)用。數(shù)個因素，例如易于被機(jī)械回收的塑料類型數(shù)目少和次級產(chǎn)物的品質(zhì)低，嚴(yán)重限制了這種解決塑料廢物累積問題的潛力。作為替代操作，化學(xué)回收優(yōu)先以塑料升級再造(例如分解聚烯烴衍生的塑料)為目標(biāo)以利用較小的中間體。數(shù)種技術(shù)已經(jīng)在實驗室規(guī)模上應(yīng)用，但是高的能源成本可能仍然阻礙這些技術(shù)工具的規(guī)模擴(kuò)大。

2、除機(jī)械回收和化學(xué)回收之外，生物降解被廣泛認(rèn)為是處理塑料剩余物的有前景的策略。生物降解是指通過生物劑的環(huán)境降解。iupac將生物降解定義為“物質(zhì)在體外或體內(nèi)通過酶催化的分解”，后來修改“排除非生物酶促過程”。在pe的情況下，生物降解需要將氧引入到聚合物鏈中；這導(dǎo)致羰基的形成和隨后長烴鏈的斷裂并產(chǎn)生較小的分子，然后這些分子可通過微生物進(jìn)行代謝(albertsson，a.c.，andersson，s.o.and?karlsson，s.(1987).polymer?degradation?and?stability?18，73-87；roy，p.k.，hakkarainen，m.，varma，i.k.，and?albertsson，a.c.(2011).environ?sci?technol?45,4217-4227)。該事件鏈的關(guān)鍵的第一步，即pe聚合物的氧化，通常通過非生物因素(例如光或溫度)進(jìn)行。一旦長聚合分子被分解(需要暴露于野外的環(huán)境因素數(shù)年的過程)，細(xì)菌或真菌干擾并繼續(xù)該工作。這是當(dāng)前驅(qū)動生物降解研究領(lǐng)域的范例。在該范例中，數(shù)種細(xì)菌和真菌菌株已被鑒定為能夠進(jìn)行一定程度的pe降解。然而，在大多數(shù)情況下，這樣的降解需要對pe進(jìn)行使氧加速并入到聚合物中的侵入性(aggressive)預(yù)處理(加熱、uv光等)，使得非生物氧化是該反應(yīng)的真正瓶頸(wei，r.，and?zimmermann，w.(2017).microbial?biotechnology?10，1308-1322；restrepo-florez，j.-m.，bassi，a.and?thompson，m.r.(2014).internationalbiodeterioration&biodegradation?88，83-90；amobonye，a.，bhagwat，p.，singh，s.，andpillai，s.(2021).sci?total?environ?759，143536；，t.，et?al.(2021).scienceof?the?total?environment752；walsh，a.n.，et?al.(2021).environ.sci.technol55，12383-12392)。在過去的十年中，數(shù)種微生物已被描述為能夠作用于未經(jīng)處理的pe17-23，但是它們與預(yù)氧化pe情況下的實驗條件相比，需要顯著更長的孵育時間。

3、鑒定來自能夠降解未經(jīng)處理pe的微生物的酶已被證明是困難的任務(wù)。實際上，尚未鑒定出這樣的酶，這證實了氧化在整個生物降解鏈中的關(guān)鍵限制作用。已報道的能夠作用于聚烯烴衍生塑料的酶需要對塑料材料進(jìn)行預(yù)處理(wei，r.，and?zimmermann，w.(2017).microbial?biotechnology?10，1308-1322；amobonye，a.，bhagwat，p.，singh，s.，and?pillai，s.(2021).sci?total?environ?759,143536.)。例如，兩種已報道的能夠?qū)e進(jìn)行化學(xué)改性的漆酶，需要非生物預(yù)處理、或添加氧化還原介質(zhì)例如1-羥基苯并三唑。

4、這種情況確定了化合物的合成性質(zhì)以及疏水性和不可及性特征，使得塑料對于動物、真菌或微生物來源的酶促活性而言成為困難的靶標(biāo)。然而，一些鱗翅目和鞘翅目昆蟲顯示出降解未經(jīng)處理的pe和ps的出乎意料的能力，例如yang，y.，wang，j.，and?xia，m.(2020).sci?total?environ?708，135233中所述的。

5、然而，仍然需要鑒定來自微生物的能夠使未經(jīng)處理的pe生物降解，特別是使未經(jīng)處理的pe聚合物氧化的酶，從而因此避免對pe使用非生物因素，例如光或溫度、長孵育時間或侵入性預(yù)處理。

6、wo?2021/183867公開了使用來自假單胞菌(pseudomonas)屬的微生物、和/或酶(例如來自云芝(trametes?versicolor)的漆酶)來降低聚乙烯的分子量。然而，wo?2021/183867未給出來源于蠟蟲(大蠟螟(galleria?mellonella)幼蟲)的酶的公開內(nèi)容。

7、bombelli，p.，howe，c.j.，&bertocchini，f.(2017).current?biology，27(8)，r292-r293，kong，h.g.，kim，h.h.，chung，j.h.，jun，j.，lee，s.，kim，h.m.，...&ryu，c.m.(2019).cellreports，26(9)，2451-2464andpeydaei，a.，bagheri，h.，gurevich，l.，dejonge，n.，&nielsen，j.l.(2020).comparativebiochemistryandphysiology?part?d：genomics?and?proteomics，34,100678

8、公開了蠟蟲大蠟螟的幼蟲對聚乙烯的降解。然而，這些文獻(xiàn)未公開對這樣的酶的分離：其具有使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物生物降解、氧化和/或解聚的能力。

9、de?100?41?541公開了與seq?id?no.1具有一些序列同一性的蛋白質(zhì)，xp026756396.1是具有以下seq?id?no.1序列的酶的數(shù)據(jù)庫條目。然而，這些公開內(nèi)容未提供針對具有這樣的活性的蛋白質(zhì)的教導(dǎo)：使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解或者氧化和/或解聚。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經(jīng)從蠟蟲(大蠟螟幼蟲)唾液中分離出這樣的酶，其具有在室溫(roomtemperature，rt)、中性ph和短孵育時間下使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物例如聚乙烯(pe)氧化和解聚的出乎意料的能力。本發(fā)明人通過對蠟蟲唾液進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析和尺寸排阻色譜(size?exclusion?chromatography，sec)來實現(xiàn)這一點，獲得了一種鑒定為芳基貯存蛋白亞基α樣的酶，重命名為demetra，登錄號為xp_026756396.1，seq?id?no:1(本發(fā)明的酶)。在pe膜上測試了這種酶使聚烯烴衍生聚合物氧化/降解的能力(參見本專利申請的實施例以及圖5和6)，顯示出高的降解活性。這為解決塑料廢物污染問題的可能性開辟了高速途徑(highway)。

2、在室溫和生理條件(中性ph)下僅數(shù)小時的暴露之后，實現(xiàn)了這種關(guān)于pe降解的作用。因此，不再需要長的孵育時間或侵入性預(yù)處理。本發(fā)明中提供的酶的確可克服pe生物降解中的瓶頸步驟，即初始氧化步驟。使用氣相色譜-質(zhì)譜(gas?chromatography-massspectrometry，gc-ms)鑒定了降解產(chǎn)物，例如小的氧化脂族鏈，進(jìn)一步確定了聚合物斷裂成較短的分子。

3、本發(fā)明的酶屬于hexamerin/酚氧化酶原家族。這種酶不僅能夠在室溫下施加數(shù)小時之后使pe氧化，而且能夠使pe物理劣化并釋放與用完整唾液獲得的那些類似的降解副產(chǎn)物。

4、這種酶能夠在rt下和在非常短的時間內(nèi)在pe膜上起作用來產(chǎn)生這樣的改性，體現(xiàn)了塑料非生物氧化(降解過程中的第一步驟并且是最困難的步驟)的有前景的替代方案。鑒定能夠在數(shù)小時內(nèi)使pe氧化的無脊椎動物酶代表了塑料降解領(lǐng)域以及更廣泛的塑料廢物管理領(lǐng)域中的全新范例，并且開辟了設(shè)計用于合成聚合物生產(chǎn)的新的配方/路徑的高速途徑。

5、在一個方面中，本發(fā)明涉及包含編碼酶的核苷酸序列的表達(dá)載體，所述酶包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解或者氧化和/或解聚。

6、在一個方面中，本發(fā)明涉及：

7、包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的酶(下文稱為“本發(fā)明的酶或蛋白質(zhì)”)或其功能等同片段，或者

8、包含編碼所述酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞或包含編碼所述酶的核苷酸序列的載體(下文稱為“本發(fā)明的宿主細(xì)胞”)，或者

9、包含所述酶或其功能等同片段或者所述宿主細(xì)胞的組合物(下文稱為“本發(fā)明的組合物”)，

10、其用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚。

11、例如，優(yōu)選地，所述酶對于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚具有活性。

12、在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的分離的酶、以及包含所述分離的酶的組合物。

13、在一些實施方案中，本發(fā)明的酶不是數(shù)據(jù)庫登記號ncbi:xp026756396.1的酶。

14、在一些實施方案中，本發(fā)明的酶不是數(shù)據(jù)庫登記號gsp:abb77350的酶。

15、在一些實施方案中，本發(fā)明的酶是包含與seq?id?no:1的氨基酸序列具有1％變化的序列的酶。在一些實施方案中，所述酶包含與seq?id?no:1的序列具有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％變化的序列。在一些實施方案中，所述酶包含與seq?id?no:1的氨基酸序列相差1個氨基酸的序列。在一些實施方案中，所述酶包含與seq?id?no:1的氨基酸序列相差2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300個氨基酸的序列。

16、優(yōu)選地，所述酶對使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚具有活性。

17、在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的酶或其功能等同片段、或者本發(fā)明的宿主細(xì)胞、以及優(yōu)選地至少一種另外的組分。

18、在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物含有一種或更多種聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料。

19、在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種或更多種氧化的聚烯烴衍生聚合物。

20、在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含選自以下的組中的一種或更多種：丁烷、2，3-丁二醇、三甲基甲硅烷基(trimethylslyl，tms)衍生物、癸二酸、c10至c22?2-酮、苯丙酸。

21、在本發(fā)明的一些實施方案中，酶或組合物可配制成酶顆粒。優(yōu)選地，本發(fā)明的酶或組合物可配制為水溶液。

22、在一些實施方案中，組合物包含緩沖溶液。例如，hepes緩沖液。更優(yōu)選地，所述組合物包含150mm?nacl、20mm?hepes、5％甘油。

23、鑒于前述內(nèi)容，在一個方面中，本發(fā)明涉及：

24、包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的酶或其功能等同片段，或者

25、包含編碼所述酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞或包含編碼所述酶的核苷酸序列的載體，或者

26、包含所述酶或其功能等同片段或者所述宿主細(xì)胞的組合物，用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚的用途(下文稱為“本發(fā)明的用途”)。本發(fā)明的酶優(yōu)選從大蠟螟幼蟲(也稱為蠟蟲(wax?worm，ww))的唾液中分離。其涉及被重命名為demetra的芳基貯存蛋白亞基α樣的酶，包含與序列seq?id?no:1(登記號ncbi:xp_026756396.1)具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

27、seq?id?no:1(demetra，本發(fā)明的酶)

28、

29、或者，本發(fā)明的酶可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)重組產(chǎn)生。例如，使用公認(rèn)的化學(xué)合成技術(shù)，可使用單個氨基酸或者包含兩個或更多個氨基酸殘基的肽從n端或更通常地從c端構(gòu)建所述酶。用于合成酶的特定技術(shù)包括經(jīng)典方法、逐個氨基酸的經(jīng)典化學(xué)合成和固相肽合成，其中酶與樹脂(例如merrifield樹脂)連接來構(gòu)建。在這些合成操作中，氨基酸上的基團(tuán)將通常為使用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基(例如叔丁氧基羰基)的經(jīng)保護(hù)形式。如果需要的話，一旦合成完成，這些保護(hù)基就被切割?；瘜W(xué)合成方法，例如固相的肽合成、溶液合成、固相合成與溶液或酶促合成的方法的組合，是本領(lǐng)域?qū)＜乙阎?。本發(fā)明的酶也可以通過本領(lǐng)域已知的重組dna程序來產(chǎn)生。修飾可以在酶合成期間或之后引入，例如以包含用于純化的連接的標(biāo)記、純化標(biāo)簽。

30、在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的酶由包含在表達(dá)載體中的核苷酸序列編碼和表達(dá)。

31、在本發(fā)明中，術(shù)語“同一性”或“序列同一性”被理解為意指通過比對兩個序列所獲得的兩個核苷酸或氨基酸序列之間的相似性程度。根據(jù)比對序列之間共有殘基的數(shù)目，將獲得表示為百分比的不同程度的同一性。兩個氨基酸序列之間的同一性程度可通過常規(guī)方法來確定，例如，通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)序列比對算法例如如blast[altschul?s.f.etal.basic?local?alignment?search?tool.j?mol?biol.1990oct?5；215(3):403-10]來確定。blast程序例如blastn、blastx和tblastx、blastp和tblastn在國家生物技術(shù)信息中心(national?center?for?biotechonology?information，ncbi)網(wǎng)站處的公共域。

32、本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在對于蛋白質(zhì)功能性非關(guān)鍵的位置處導(dǎo)致保守氨基酸替換的基因的核苷酸序列中的突變是進(jìn)化上的中性突變，該突變不影響其整體結(jié)構(gòu)或其功能性，從而產(chǎn)生盡管包含不同氨基酸序列但表現(xiàn)出相同活性的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是序列seq?id?no:1的“功能等同變體”并落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文中使用的術(shù)語“功能等同變體”意指這樣的酶：該酶通過其氨基酸序列內(nèi)的位點處一個或更多個氨基酸的一個或更多個缺失、插入和/或替換而來源于天然酶(本發(fā)明中的seq?id?no:1)并且表現(xiàn)出相同的活性，即該酶保持了在室溫下使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物例如聚乙烯(pe)氧化的能力?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變程序，例如定點誘變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機(jī)誘變、混編等來制備變體。與seq?id?no:1的氨基酸序列具有至少60％序列同一性并且能夠使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物氧化的所有蛋白質(zhì)被認(rèn)為是本發(fā)明上下文中的功能等同變體。本專利申請的實例中公開了用于檢查是否給定蛋白質(zhì)是seq?id?no:1的酶的功能等同變體的測定的實例。本發(fā)明的功能等同變體具有seq?id?no:1的天然蛋白質(zhì)的至少20％氧化活性，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％氧化活性。

33、本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明的酶的功能等同片段。術(shù)語“功能等同片段”意指具有一個或更多個(例如數(shù)個)從天然蛋白質(zhì)(在本發(fā)明中為序列seq?id?no:1)的氨基端和/或羧基端缺失的氨基酸并且顯示出與天然蛋白質(zhì)相同的活性/功能(在本發(fā)明中為在室溫下使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物氧化的能力)的多肽/蛋白質(zhì)。本專利申請的實例中公開了用于檢查是否本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段是seq?id?no:1的功能等同片段的測定的實例。本發(fā)明的功能等同片段具有天然蛋白質(zhì)seq?id?no:1的至少20％氧化活性，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％氧化活性。

34、在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的酶的氨基酸序列包含序列seq?id?no:1或由序列seq?id?no:1組成。

35、編碼本發(fā)明的酶的本發(fā)明的核苷酸序列還可包含除編碼序列之外的其他元件，例如內(nèi)含子、3’和/或5’末端中的非編碼序列、核糖體結(jié)合位點等。本發(fā)明的核苷酸序列也可包含編碼另外的氨基酸的序列，所述另外的氨基酸可用于提高酶的穩(wěn)定性或允許更有效的酶純化。

36、可將本發(fā)明的核苷酸序列引入到載體或遺傳構(gòu)建體例如克隆載體或表達(dá)載體中以獲得包含所述核苷酸序列的載體。優(yōu)選地，所述載體是用于表達(dá)和純化本發(fā)明的酶的合適載體。

37、本文中使用的術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”或“載體”是指分離和修飾以包含以自然界中不可能存在的方式的核酸區(qū)段的單鏈(monocatenary)或雙鏈(bicatenary)核酸分子。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列所需的控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”或“遺傳構(gòu)建體”與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。因此，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體也可包含一個或更多個基因表達(dá)的控制序列或調(diào)節(jié)序列，例如但不限于啟動子序列、前導(dǎo)序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、信號序列、調(diào)節(jié)子、增強(qiáng)子等。

38、“表達(dá)載體”是包含至少本發(fā)明的核苷酸序列的直鏈或環(huán)狀dna分子，本發(fā)明的核苷酸序列與為其表達(dá)所提供的另外的核苷酸可操作地連接。包含本發(fā)明的核酸序列的這種載體可以以這樣的方式引入到宿主細(xì)胞中，即該載體維持為染色體組分或作為自復(fù)制的染色體外載體。

39、本發(fā)明中所指的表達(dá)載體可以是這樣的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?：其可方便地經(jīng)受重組dna程序，并且可產(chǎn)生包含在其中的本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常取決于載體與載體待被引入至的宿主細(xì)胞的相容性。表達(dá)載體可以是，例如但不限于，質(zhì)粒、黏粒、噬菌體、病毒或病毒載體、人工細(xì)菌染色體(artificial?bacterial?chromosome，bac)、人工酵母染色體(artificial?yeast?chromosome，yac)或者類似物。本發(fā)明上下文中的載體可以是直鏈或封閉環(huán)狀的。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體是桿狀病毒表達(dá)載體，更優(yōu)選p2桿狀病毒載體。

40、本文中使用的“宿主細(xì)胞”包括易于用如上所述的本發(fā)明的核苷酸序列或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。宿主細(xì)胞可以是原核生物或真核生物，優(yōu)選真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是原核生物，優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌(escherichia?coli)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞，更優(yōu)選sf9細(xì)胞。

41、因此，本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含至少本發(fā)明的核酸序列，優(yōu)選通過本發(fā)明的載體以重組的方式包含本發(fā)明的核酸序列。本發(fā)明的核苷酸或本發(fā)明的載體并非天然存在于該細(xì)胞中，而是通過遺傳改造程序有意引入的。本發(fā)明的核苷酸序列可編碼本發(fā)明的成熟的酶或由與成熟的酶連接的信號肽組成的蛋白質(zhì)前體，該蛋白質(zhì)前體必須隨后被加工以產(chǎn)生成熟的酶。

42、本發(fā)明的酶在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中的表達(dá)可通過本領(lǐng)域已知的任何程序誘導(dǎo)，例如用至少一種本發(fā)明的核苷酸序列或用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，并在誘導(dǎo)該核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以獲得分泌的和功能性的酶。用于誘導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的優(yōu)選條件是將宿主細(xì)胞在27℃下孵育48至72小時。

43、在一些方面中，本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中表達(dá)與seq?id?no:1具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的酶的方法，所述方法包括在誘導(dǎo)表達(dá)載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞以獲得酶。

44、由本發(fā)明的宿主細(xì)胞宿主產(chǎn)生的本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域已知的多種程序純化以獲得基本上純的酶，所述程序包括但不限于色譜(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦(chromatofocus)和尺寸排阻)、電泳程序(例如，制備式等電聚焦)、差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page或提取。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的酶是重組產(chǎn)生的，或者其是從大蠟螟，特別是從大蠟螟(g.mellonella)唾液中分離的。

45、用于從大蠟螟唾液中分離本發(fā)明的酶的方法是，但不限于，從蠟蟲唾液中的色譜技術(shù)(例如尺寸排阻和離子交換色譜)。

46、本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的酶或其功能等同片段、或者本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及任選地這些酶的最佳活性或其儲存所需的其他要素。這些另外的要素可以是，例如，緩沖液(例如hepes)、其他酶(例如可用于使聚烯烴衍生聚合物生物降解的酶)、抗生素等。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包含第二酶，所述第二酶包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選地，這種另外的蛋白質(zhì)包含seq?id?no:2或由seq?id?no:2組成。

47、seq?id?no:2(ceres)

48、

49、優(yōu)選地，第二酶對使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚具有活性。

50、在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的酶或其功能等同片段、或者本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及優(yōu)選地至少一種另外的組分。在一些實施方案中，所述組分是以上公開的另外的要素中的至少一種。

51、優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包含分離的第二酶，所述第二酶包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

52、在一些實施方案中，組合物中的第二酶不是數(shù)據(jù)庫登記號xp_026756396.1的酶。

53、在一些實施方案中，組合物中的第二酶是包含與seq?id?no:2的氨基酸序列具有1％變化的序列的酶。在一些實施方案中，第二酶包含與seq?id?no:2的序列具有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％變化的序列。在一些實施方案中，第二酶包含與seq?id?no:2的氨基酸序列相差1個氨基酸的序列。在一些實施方案中，第二酶包含與seq?id?no:2的氨基酸序列相差2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300個氨基酸的序列。

54、在一個方面中，本發(fā)明涉及用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚的試劑盒，所述試劑盒包含：

55、在第一容器中：

56、包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的酶或其功能等同片段，或者

57、包含編碼所述酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞或包含編碼所述酶的核苷酸序列的載體，或者

58、包含所述酶或其功能等同片段或者所述宿主細(xì)胞的組合物；

59、以及所述酶、所述宿主細(xì)胞或所述組合物與以下一起使用的說明：

60、包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的第二酶或其功能等同片段，或者

61、包含編碼所述第二酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞或包含編碼所述第二酶的核苷酸序列的載體，或者

62、包含所述第二酶或其功能等同片段或者所述宿主細(xì)胞的組合物。

63、在一些實施方案中，試劑盒還包含：

64、在另外的容器中：

65、包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的第二酶或其功能等同片段，或者

66、包含編碼所述第二酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞或包含編碼所述第二酶的核苷酸序列的載體，或者

67、包含所述第二酶或其功能等同片段或者所述宿主細(xì)胞的組合物。

68、在本發(fā)明的一些實施方案中，第二酶是分離的酶。

69、在一些實施方案中，seq?id?no:1的酶、宿主細(xì)胞或組合物用于在與seq?id?no:2的酶、宿主細(xì)胞或組合物分開、順序或同時的步驟中使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、或氧化和/或解聚。

70、在其最一般的方面中，“聚烯烴衍生聚合物”涉及衍生自烯烴單體的任何聚烯烴聚合物。

71、在本發(fā)明的一個方面中，“聚烯烴衍生聚合物”可以是具有通式(ch2chr)n的聚合物類型，其中r是烷基。在一些情況下，r也可以是氫原子。其通常衍生自一小組簡單烯烴(olefin)(烯烴(alkene))。在商業(yè)意義上占主導(dǎo)的是聚乙烯和聚丙烯。更專業(yè)的聚烯烴包括聚異丁烯和聚甲基戊烯。它們都是無色或白色的油或固體。每種聚烯烴的名稱表明了制備它的烯烴；例如，聚乙烯衍生自乙烯，以及聚甲基戊烯衍生自4-甲基-1-戊烯。

72、在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中所指的聚烯烴衍生聚合物是聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)。

73、在另一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中所指的聚烯烴衍生聚合物是聚乙烯(pe)。

74、“聚乙烯(polyethylene)(pe)”或聚乙烯(polythene)(縮寫為pe；iupac名稱為聚乙烯或聚(亞甲基))是當(dāng)今使用最普遍的塑料。它是主要用于包裝(塑料袋、塑料膜、土工膜和包括瓶在內(nèi)的容器等)的聚合物。已知許多種類的聚乙烯，其中大多數(shù)具有化學(xué)式(c2h4)n。pe通常是具有不同n值的類似的乙烯聚合物的混合物。它可以是低密度或高密度的：低密度聚乙烯是使用高壓(1000至5000atm)和高溫(520開爾文(kelvin))擠出的，而高密度聚乙烯是使用低壓(6至7atm)和低溫(333至343k)擠出的。聚乙烯通常是熱塑性的，但它可以反之改性為熱固性的，例如交聯(lián)聚乙烯。所有類型的pe都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

75、在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，pe選自由以下組成的列表：超高分子量聚乙烯(ultra-high-molecular-weight?polyethylene，uhmwpe)、超低分子量聚乙烯(ultra-low-molecular-weight?polyethylene，ulmwpe或pe-wax)、高分子量聚乙烯(high-molecular-weight?polyethylene，hmwpe)、高密度聚乙烯(high-density?polyethylene，hdpe)、高密度交聯(lián)聚乙烯(high-density?cross-linked?polyethylene，hdxlpe)、交聯(lián)聚乙烯(pex或xlpe)、中密度聚乙烯(medium-density?polyethylene，mdpe)、直鏈低密度聚乙烯(linearlow-density?polyethylene，lldpe)、低密度聚乙烯(low-density?polyethylene，ldpe)、極低密度聚乙烯(very-low-density?polyethylene，vldpe)和氯化聚乙烯(chlorinatedpolyethylene，cpe)。在一個具體實施方案中，pe是ldpe，更優(yōu)選pe?4000或pe?2000。

76、在另一個具體實施方案中，在通過本發(fā)明的酶、本發(fā)明的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的組合物進(jìn)行生物降解之前，聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料未用非生物因素(例如加熱、uv光等)預(yù)處理，即本發(fā)明的酶能夠使未經(jīng)處理的聚烯烴衍生聚合物或未經(jīng)處理的包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解。

77、在另一個方面中，本發(fā)明是指用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、氧化和/或解聚的方法，下文稱為“本發(fā)明的方法”，其中所述方法包括使以下與聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料接觸：

78、本發(fā)明的酶，或

79、本發(fā)明的宿主細(xì)胞，或

80、本發(fā)明的組合物。

81、在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述方法在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在室溫下在具有中性ph的水溶液中進(jìn)行。

82、“室溫”是15℃至30℃，優(yōu)選22℃。

83、“中性ph”是ph?7至ph?8。

84、在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的酶的量為2至10μl，優(yōu)選5μl，并且濃度為1至5μg/μl。

85、在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的酶、宿主細(xì)胞或組合物與聚烯烴衍生聚合物的孵育時間為至少60至120分鐘，優(yōu)選至少90分鐘。

86、在本發(fā)明方法的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，使用的酶的量為5μl或10μl，濃度為1至5μg/μl，優(yōu)選1.2μg/μl，并且對聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料施加至少8次，優(yōu)選24次，每次90分鐘。

87、在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的酶包含序列seq?id?no:1或由序列seq?id?no:1組成。更優(yōu)選地，本發(fā)明的酶從大蠟螟中分離，特別地從大蠟螟唾液中分離。

88、在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物還包含第二酶，所述第二酶包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選包含seq?idno:2，甚至更優(yōu)選由seq?id?no:2組成。

89、在一些實施方案中，使包含與seq?id?no:2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的第二酶與聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料在與包含與seq?id?no:1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的酶分開、順序或同時的步驟中接觸。

90、在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，聚烯烴衍生聚合物是聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)。

91、在本發(fā)明方法的另一個更優(yōu)選的實施方案中，聚烯烴衍生聚合物是聚乙烯(pe)。

92、在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，pe選自由以下組成的列表：超高分子量聚乙烯(uhmwpe)、超低分子量聚乙烯(ulmwpe或pe-wax)、高分子量聚乙烯(hmwpe)、高密度聚乙烯(hdpe)、高密度交聯(lián)聚乙烯(hdxlpe)、交聯(lián)聚乙烯(pex或xlpe)、中密度聚乙烯(mdpe)、直鏈低密度聚乙烯(lldpe)、低密度聚乙烯(ldpe)、極低密度聚乙烯(vldpe)和氯化聚乙烯(cpe)。在一個具體實施方案中，pe是ldpe，更優(yōu)選pe?4000或pe?2000。

93、本發(fā)明的另一方面涉及用于對聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料進(jìn)行預(yù)處理的方法，所述方法通過使以下與聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料接觸來進(jìn)行以提供氧化的聚合物或材料產(chǎn)品：

94、本發(fā)明的酶，或

95、本發(fā)明的宿主細(xì)胞，或

96、本發(fā)明的組合物。

97、在一些實施方案中，使用本發(fā)明的方法對聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料進(jìn)行預(yù)處理，隨后進(jìn)行進(jìn)一步降解步驟。例如，對氧化的聚合物或材料產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步的降解步驟。在一些實施方案中，使用本發(fā)明的方法對聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料進(jìn)行預(yù)處理，隨后施加一個或更多個微生物降解步驟。

98、本發(fā)明的另一個方面涉及用于獲得來源于聚烯烴衍生聚合物生物降解的副產(chǎn)物的方法，其包括：

99、(a)使聚烯烴衍生聚合物與以下接觸：

100、本發(fā)明的酶，或

101、本發(fā)明的宿主細(xì)胞，或

102、本發(fā)明的組合物，以及

103、(b)分離從由步驟(a)所得的培養(yǎng)物中獲得的副產(chǎn)物。

104、本發(fā)明的另一個方面涉及制備塑料的方法，其包括：

105、(a)使聚烯烴衍生聚合物與以下接觸：

106、本發(fā)明的酶，或

107、本發(fā)明的宿主細(xì)胞，或

108、本發(fā)明的組合物，以及

109、(b)分離從由步驟(a)所得的培養(yǎng)物中獲得的副產(chǎn)物。

110、(c)使步驟(b)中分離的副產(chǎn)物聚合。

111、在本發(fā)明的上下文中，“副產(chǎn)物”是但不限于，丁烷、2，3-丁二醇、三甲基甲硅烷基(tms)衍生物、癸二酸、10至22個碳的2-酮、和可識別為苯丙酸的小的芳族化合物。優(yōu)選地，獲得的副產(chǎn)物包含c10至c22?2-酮。

112、用于與所獲得副產(chǎn)物相關(guān)的方法的條件是以上已經(jīng)解釋的用于使聚烯烴衍生聚合物或包含聚烯烴衍生聚合物的材料生物降解、氧化和/或解聚的方法的條件。例如，在這些方法中可使用第二酶。

113、該方法的步驟(b)中副產(chǎn)物的分離可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)例如氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)進(jìn)行。

114、現(xiàn)在將參考附圖以實例而非限制性的方式描述本發(fā)明的實施方案。然而，鑒于本公開內(nèi)容，本發(fā)明的多種另外的方面和實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。

115、其中本文中使用的“和/或”被認(rèn)為具體公開了在具有或不具有另一者的情況下兩個指出的特征或組分中的每一者。例如，“a和/或b”被認(rèn)為具體公開了(i)a、(ii)b、以及(iii)a和b中的每一者，就像每一者在本文中單獨列出一樣。

116、除非上下文中另外指示，否則對以上列出特征的描述和限定不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨?，并且同等地適用于所描述的所有方面和實施方案。