本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有改變的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)翻譯、產(chǎn)生和/或活性；和/或改變的l-抗壞血酸(asa)含量的植物的多核苷酸、基因構(gòu)建體和方法；以及由該方法產(chǎn)生的植物和植物細胞。

背景技術(shù)：

1、l-抗壞血酸(asa)是植物中最豐富的可溶性抗氧化劑，并且也是人類和少數(shù)其他動物的必需營養(yǎng)素。asa顯著有助于人類飲食中“自由基清除劑”或“抗氧化代謝物”的總攝入量。目前有令人信服的證據(jù)表明，這些代謝物無論是單獨使用還是組合使用，都有益于健康，可作為抗癌劑并預(yù)防冠心病。對于發(fā)達國家和發(fā)展中國家的人們來說，攝入足夠數(shù)量的水果和蔬菜以持續(xù)維持最佳的asa濃度仍然是一個挑戰(zhàn)。

2、人類中幾乎全部膳食asa攝入都源自植物產(chǎn)品。然而，植物組織的asa含量是顯著變化的。雖然葉asa含量在草本植物和木本植物中通常較高且相對均勻，但在非綠色可食用植物組織中發(fā)現(xiàn)asa含量的巨大且無法解釋的可變性。

3、了解asa生物合成是如何被調(diào)控的可能為操縱植物中的生物合成提供工具。了解基因表達的調(diào)控以及控制這種表達的因子/元件也為遺傳操作提供了有價值的工具。已知酶gdp-l-半乳糖磷酸化酶(ggp)在asa生物合成中起關(guān)鍵作用。ggp表達和活性的調(diào)控尚未完全解決。

4、期望增加植物的asa含量。

5、本發(fā)明的目的是提供用于操縱植物中asa的表達和含量的新的、改進的和/或替代的工具，和/或至少為公眾提供有用的選擇。

6、在本說明書中，在已經(jīng)參考外部信息源(包括專利說明書和其他文獻)的情況下，這通常是為了提供用于討論本發(fā)明的特征的上下文的目的。除非另有說明，否則在任何管轄范圍內(nèi)，對這些信息源的引用不應(yīng)被解釋為承認這些信息源是現(xiàn)有技術(shù)或形成本領(lǐng)域公知常識的一部分。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在第一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生具有增加的l-抗壞血酸(asa)含量的植物細胞或植物的方法，該方法包括用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞，多核苷酸編碼具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少約70％序列同一性的多肽的變體。

2、在第二方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)翻譯、產(chǎn)生和/或活性的植物細胞或植物的方法，該方法包括用編碼具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽或與具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少約70％序列同一性的多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞。

3、在第三方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的l-抗壞血酸(asa)含量的植物細胞或植物的方法，該方法包括用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞，多核苷酸包括seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列，或與具有seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列的核苷酸具有至少約70％序列同一性的其變體。

4、在第四方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)翻譯、產(chǎn)生和/或活性的植物細胞或植物的方法，該方法包括用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞，多核苷酸包括seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列，或與具有seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列的核苷酸具有至少約70％序列同一性的其變體。

5、在第五方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生具有增加的l-抗壞血酸(asa)含量或增加的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)翻譯、產(chǎn)生和/或活性的植物細胞或植物的方法，該方法包括在植物細胞中上調(diào)或在植物中表達具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性的多肽的變體。

6、在第六方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的l-抗壞血酸(asa)含量或增加的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)翻譯、產(chǎn)生和/或活性的植物細胞或植物的方法，該方法包括在植物細胞中上調(diào)或在植物中表達多核苷酸，多核苷酸包括選自序列seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列或與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的變體的核苷酸序列。

7、在第七方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼具有seq?id?no：1-4和102中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：1-4和102中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽的變體。

8、在第八方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼具有seq?id?no：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-183、185、186、188-190、192-200、202-204和206-209中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-183、185、186、188-190、192-200、202-204和206-209中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽的變體。

9、在第九方面，本發(fā)明涉及包括多核苷酸的基因構(gòu)建體，多核苷酸編碼具有seq?idno：1-4和102中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：1-4和102中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽的變體。

10、在第十方面，本發(fā)明涉及包括多核苷酸的基因構(gòu)建體，多核苷酸編碼具有seq?idno：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-183、185、186、188-190、192-200、202-204和206-209中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-183、185、186、188-190、192-200、202-204和206-209中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽的變體。

11、在各種實施方案中，基因構(gòu)建體可以進一步包括第二多核苷酸

12、a)其編碼具有seq?id?no：109-209中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?idno：109-209中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽的變體；和/或

13、b)其具有seq?id?no：210的核苷酸序列，或與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的核苷酸的變體。

14、在第十一方面，本發(fā)明涉及包括多核苷酸的基因構(gòu)建體，多核苷酸包括seq?idno：103-108中的任一個的核苷酸序列，或與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性，優(yōu)選至少約75％序列同一性的多肽變體。

15、在第十二方面，本發(fā)明涉及包括多核苷酸的基因構(gòu)建體，多核苷酸包括seq?idno：210的核苷酸序列，或與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的多肽變體。

16、在第十三方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括本文所述第九或第十一方面的第一基因構(gòu)建體；和本文所述第十或第十二方面的第二基因構(gòu)建體。

17、在第十四方面，本發(fā)明提供了包括本文所述的一種或多種基因構(gòu)建體的宿主細胞。

18、在第十五方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因修飾以表達多核苷酸的宿主細胞，多核苷酸編碼具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性的多肽的變體。

19、在第十六方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因修飾以表達多核苷酸的宿主細胞，多核苷酸包括seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列，或與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的其變體。

20、在第十七方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因修飾以表達多核苷酸的植物細胞，多核苷酸編碼具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽或與具有seq?idno：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的變體。

21、在第十八方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因修飾以表達多核苷酸的植物細胞，多核苷酸包括選自seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列或與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的其變體。

22、在第十九方面，本發(fā)明提供了包括本文所述的植物細胞的植物。

23、在第二十方面，本發(fā)明提供了用于選擇具有改變的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)活性的植物的方法，該方法包括測試植物的多核苷酸的改變的表達，多核苷酸編碼具有seqid?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽或與具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的變體。

24、在另一方面，本發(fā)明提供了用于選擇具有改變的gdp-l-半乳糖磷酸化酶3(ggp)活性的植物的方法，該方法包括測試植物的多核苷酸的改變的表達，多核苷酸包括選自序列seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列或其變體，其中變體包括與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列。

25、在另一方面，本發(fā)明提供了用于選擇具有改變的l-抗壞血酸(asa)含量的植物的方法，該方法包括測試植物的多核苷酸的改變的表達，多核苷酸編碼具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽或與具有seq?id?no：1-102和348-356中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的變體。

26、在另一方面，本發(fā)明提供了用于選擇具有改變的l-抗壞血酸(asa)含量的植物的方法，該方法包括測試植物的多核苷酸的改變的表達，多核苷酸包括選自序列seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列或包括與seq?id?no：103-108中的任一個的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的其變體。

27、在另一方面，本發(fā)明提供了通過本文所述的任何方法產(chǎn)生的植物細胞或植物。

28、在另一方面，本發(fā)明提供了通過本文所述的任何方法選擇的植物細胞或植物。

29、在另一方面，本發(fā)明提供了通過本文所述的任何方法產(chǎn)生的植物組或群體。

30、在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生asa的方法，該方法包括從本所述文的宿主細胞中提取asa。

31、在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生asa的方法，該方法包括從本文所述的植物細胞或植物中提取asa。

32、以下實施例可以涉及任何或所有上述方面。

33、在各種實施方案中，方法可以進一步包括用多核苷酸轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化第二多核苷酸，第二多核苷酸編碼具有seq?id?no：109-209中的任一個的氨基酸序列的多肽或與seqid?no：109-209中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性的多肽的變體。

34、在各種實施方案中，方法可以進一步包括用多核苷酸轉(zhuǎn)化第二多核苷酸或共轉(zhuǎn)化第二多核苷酸，第二多核苷酸具有seq?id?no：210的核苷酸序列，或與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的其變體。在各種實施方案中，變體與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約75、80、85、90、95、96、97、98、99％或100％序列同一性。

35、在各種實施方案中，宿主細胞或植物細胞可以被基因修飾以表達第二多核苷酸，第二多核苷酸編碼具有seq?id?no：109-209中的任一個的氨基酸序列的多肽，或與seq?idno：109-209中的任一個的氨基酸序列具有至少約70％序列同一性的多肽的變體。

36、在各種實施方案中，宿主細胞或植物細胞可經(jīng)基因修飾以表達具有seq?id?no：210的核苷酸序列的第二多核苷酸，或與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％序列同一性的其變體。

37、在各種實施方案中，多核苷酸可以編碼具有以下氨基酸序列的多肽，或可以編碼與以下氨基酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽變體：

38、a)seq?id?no：1-102和348-356中的任一個；

39、b)seq?id?no：1-50、52-60、62-83、85-95、97-102、348-350和352-354中的任一個；

40、c)seq?id?no：1-49、53-56、58-60、62、64-66、70-79、82、83、85-87、89-91、93-95、98、102、348-350、352和353中的任一個；

41、d)seq?id?no：1-49、53-56、58、60、62、64、66、70、71、74-76、78、79、83、85-87、89-91、93-95、98、102、348-350、352和353中的任一個；

42、e)seq?id?no：1-49、53-56、58、60、62、64、66、70、71、74-76、78、79、83、85-87、89-90、93、94、98、102、348-350、352和353中的任一個；

43、f)seq?id?no：1-5、7-10、12-19、21-24、28-31、33、35、36、38-45、48、49、53、55、56、58、60、62、64、66、71、74-76、79、83、85、87、89、90、93、94、98、102、350、352中的任一個；

44、g)seq?id?no：1-4、38、41-45、48、49、51、52、56、60、63、66、79、80、85、89、90、92、96、97、100-102和348-356中的任一個；

45、h)seq?id?no：1-4、49、51、66、80、85、90、92、96、102和348-356中的任一個；

46、i)seq?id?no：1-4和102中的任一個；

47、j)seq?id?no：1-4中的任一個；

48、k)seq?id?no：1或102；

49、l)seq?id?no：1；或

50、m)seq?id?no：102。

51、在各種實施方案中，多核苷酸可以具有以下核苷酸序列或可以編碼與以下核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸變體：

52、a)seq?id?no：103-108中的任一個，

53、b)seq?id?no：103或105，或

54、c)seq?id?no：103。

55、在各種實施方案中，多核苷酸或第二多核苷酸可以編碼具有以下氨基酸序列的多肽，或可以編碼與以下氨基酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽變體：

56、a)seq?id?no：109-209中的任一個；

57、b)seq?id?no：109-174、176-178和180-209中的任一個；

58、c)seq?id?no：109-159、162-164、166-174、176、178、180-186、188-190、192-204和206-209中的任一個；

59、d)seq?id?no：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-186、188-190、192-204和206-209中的任一個；

60、e)seq?id?no：109-153、155-157、159、162-164、166-174、176、178、180-183、185、186、188-190、192-200、202-204和206-209中的任一個；

61、f)seq?id?no：109-114、125、126、142、177、179、187、191和205中的任一個；

62、g)seq?id?no：109-114和179中的任一個；

63、h)seq?id?no：109-114中的任一個；或

64、i)seq?id?no：109。

65、在各種實施方案中，多核苷酸或第二多核苷酸可以具有與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸的變體的核苷酸序列，或可以編碼與seq?id?no：210的核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸的變體。

66、在各種實施方案中，多肽或多肽變體可包括一個或多個sant/myb結(jié)構(gòu)域。在各種實施方案中，多肽或多肽變體可包括兩個sant/myb結(jié)構(gòu)域。

67、在各種實施方案中，上調(diào)可包括基因工程。

68、在各種實施方案中，轉(zhuǎn)化包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在各種實施方案中，方法包括用多核苷酸或其變體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細胞。在各種實施方案中，宿主細胞或植物細胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和/或穩(wěn)定基因修飾。

69、在各種實施方案中，方法可以包括用本文所述的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞。在各種實施方案中，方法可以包括用本文所述的基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細胞。

70、在各種實施方案中，宿主細胞或植物細胞包括內(nèi)源ggp基因，優(yōu)選功能性ggp基因。例如，在一些實施方案中，宿主細胞或植物細胞先前已經(jīng)用功能性ggp基因轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，方法包括用ggp基因轉(zhuǎn)化宿主細胞或植物細胞。

71、在一些實施方案中，ggp基因具有包括一個或多個mybs1結(jié)合位點，優(yōu)選兩個或更多個mybs1結(jié)合位點的啟動子。在一些實施方案中，方法包括基因編輯內(nèi)源ggp基因的啟動子以提供包括一個或多個mybs1結(jié)合位點的啟動子。在一些實施方案中，方法包括修飾內(nèi)源ggp啟動子以提供包括一個或多個mybs1結(jié)合位點的ggp啟動子。在一些實施方案中，方法包括用ggp基因轉(zhuǎn)化植物細胞或宿主細胞。在一些實施方案中，方法包括用具有啟動子的ggp基因轉(zhuǎn)化植物細胞或宿主細胞，啟動子包括一個或多個mybs1結(jié)合位點，優(yōu)選兩個或更多個mybs1結(jié)合位點。

72、在各種實施方案中，上調(diào)可包括與表達多肽的植物雜交，多肽包括與具有seq?idno：1-102和348-356和/或seq?id?no：109-209中的任一個的氨基酸序列的多肽具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的氨基酸序列。

73、根據(jù)某些實施方式，上調(diào)包括與表達多核苷酸的植物雜交，多核苷酸包括選自序列seq?id?no：103至108和210中的任一個的核苷酸序列。

74、在各種實施方案中，基因構(gòu)建體可以包括與啟動子可操作地連接的一個或多個多核苷酸。在各種實施方案中，啟動子是以下中的至少一種：

75、i)在自然界中通常不與多核苷酸相關(guān)的啟動子，

76、ii)源自細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或病毒的啟動子。

77、iii)細菌啟動子，

78、iv)真菌啟動子，

79、v)昆蟲啟動子，

80、vi)哺乳動物啟動子，和

81、vii)病毒啟動子。

82、在各種實施方案中，啟動子可以源自細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或病毒。

83、在各種實施方案中，啟動子可以是組成型啟動子或組織特異性啟動子。在各種實施方案中，啟動子導(dǎo)致葉和/或根中的表達。優(yōu)選地，啟動子導(dǎo)致在葉中表達。更優(yōu)選地，啟動子是導(dǎo)致葉和/或根中的靶向表達的組織特異性啟動子。

84、在各種實施方案中，一種或多種多核苷酸可以通過化合物調(diào)控。在一些實施方案中，化合物是l-抗壞血酸(asa)或相關(guān)代謝物。

85、在各種實施方案中，宿主細胞可以是植物細胞。

86、本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“包括”意指“至少部分由……組成”。當(dāng)解釋本說明書和權(quán)利要求書中包括術(shù)語“包括”的陳述時，除了在每個陳述中以該術(shù)語開頭的特征之外，還可以存在其他特征。相關(guān)術(shù)語諸如“包括(comprise)”和“包括(comprised)”以類似的方式解釋。

87、如本文所用，術(shù)語“和/或”意指“和”或“或”，或兩者。

88、如本文所用，名詞后面的術(shù)語“(s)”意指該名詞的復(fù)數(shù)和/或單數(shù)形式。

89、對本文公開的數(shù)字范圍(例如，1至10)的引用旨在也包括對范圍內(nèi)的所有有理數(shù)(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及范圍內(nèi)的任何有理數(shù)范圍(例如，2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的引用，因此，本文明確公開的所有范圍的所有子范圍在此明確公開。這些僅是具體預(yù)期的實例，并且所列舉的最低值和最高值之間的數(shù)值的所有可能組合被認為在本技術(shù)中以類似的方式明確陳述。

90、本發(fā)明還可以廣義地說包括在本技術(shù)的說明書中單獨地或共同地提及或指示的部件、元件和特征，以及任何兩個或更多個所述部件、元件或特征的任何或所有組合，并且在本文中提及具有本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域中的已知等同物的特定整數(shù)的情況下，這樣的已知等同物被認為并入本文中，如同單獨地闡述一樣。

91、盡管本發(fā)明如上廣泛定義，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明不限于此，并且本發(fā)明還包括以下描述給出示例的實施例。