本發(fā)明涉及與經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人cfp-elk1基因間區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸。這些反義寡核苷酸可以引起細(xì)胞中elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平降低。本發(fā)明進(jìn)一步涉及其綴合物、鹽和藥物組合物；以及用于治療與elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平增加相關(guān)聯(lián)的疾病包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥的方法。

背景技術(shù)：

1、tar?dna結(jié)合蛋白43(tdp-43)由tardbp編碼，并且在轉(zhuǎn)錄阻遏、前體mrna剪接和翻譯調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。這還包括rna轉(zhuǎn)錄物的聚腺苷酸化。因此，去除或降低tdp-43的表達(dá)可能引起poly(a)尾脫離前體mrna轉(zhuǎn)錄物。

2、tdp-43耗竭在一系列疾病中表現(xiàn)出來，稱為tdp-43病理，并包括諸如以下的疾?。杭∥s性側(cè)索硬化癥(als)、額顳葉變性(ftld)、進(jìn)行性核上麻痹(psp)、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、進(jìn)行性肌萎縮、阿爾茨海默病、帕金森病、孤獨(dú)癥、海馬硬化性癡呆、唐氏綜合征、亨廷頓病、多聚谷氨酰胺疾病，諸如脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3、肌病和慢性創(chuàng)傷性腦病。

3、als也稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病或葛雷克氏癥。它是神經(jīng)退行性的，并且導(dǎo)致腦和脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸喪失。tardbp突變與als相關(guān)聯(lián)，c9orf72、sod1和fus基因突變也與als相關(guān)聯(lián)(edgar等人2021,neurobiol?aging,108)。目前，尚無已知als治愈，并且它可以影響任何年齡的人。它可能發(fā)生在有該病史的家族中，但也可能偶發(fā)于無家族病例的受試者中。典型的治療涉及輔助通氣形式，這可以延長(zhǎng)受試者的生命，但不能治愈該疾病。目前可用的藥物，例如利魯唑(us?5,527,81)，同樣只能短期延長(zhǎng)生命，而不能提供治愈。

4、本發(fā)明旨在設(shè)計(jì)用于神經(jīng)退行性疾病(諸如als)的新治療。

5、cfp基因編碼備解素，這是一種血漿糖蛋白，在活化先天免疫系統(tǒng)的補(bǔ)體系統(tǒng)中發(fā)揮作用。cfp的表達(dá)會(huì)觸發(fā)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，并且其通常僅在肝臟中表達(dá)。備解素允許通過與人細(xì)胞膜結(jié)合來形成穩(wěn)定的c3和c5轉(zhuǎn)化酶攻擊復(fù)合物。然后，攻擊復(fù)合物的形成可以引起垂死細(xì)胞的裂解。cfp在身體其他部位的過度表達(dá)可能與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。特別地，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中補(bǔ)體活化的增加已與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)(等人2018,mol.immun.102)。

6、本發(fā)明尋求提供通過靶向cfp來改善tdp-43耗竭的影響的反義寡核苷酸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及與經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人cfp-elk1基因間區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸。

2、elk1基因編碼ets樣-1蛋白，該蛋白起到轉(zhuǎn)錄活化因子的作用。它與補(bǔ)體因子備解素基因(cfp)相鄰。本發(fā)明人已驚人地確定，tdp-43的缺乏引起elk1前體mrna轉(zhuǎn)錄物的poly(a)尾脫離。這又引起elk1的轉(zhuǎn)錄繼續(xù)前往相鄰的cfp基因，從而引起單個(gè)組合的前體mrnaelk1-cfp轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄。該轉(zhuǎn)錄物包括來自兩個(gè)基因以及它們之間的基因間區(qū)域的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mrna。

3、由于終止密碼子下游超過50個(gè)堿基處存在外顯子-外顯子剪接連接，所以預(yù)計(jì)組合的前體mrna?elk1-cfp轉(zhuǎn)錄物將經(jīng)歷無義介導(dǎo)的(nmd)衰變。然而，本發(fā)明人已驚人地確定這可能并不總是發(fā)生，而是可能引起cfp表達(dá)增加。

4、tdp-43缺乏或水平降低可能引起腦中cfp表達(dá)增加，因?yàn)閭浣馑氐鞍卓赡苁菑慕M合的elk1-cfp轉(zhuǎn)錄物翻譯而來的。通過這種方式，tdp-43缺乏或水平降低已與神經(jīng)退行性疾病(包括als)有關(guān)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供反義寡核苷酸，其通過靶向elk1-cfp基因間區(qū)域來改善tdp-43耗竭的影響。

5、本發(fā)明提供了與elk1-cfp基因間區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸。這些反義寡核苷酸可能能夠降低細(xì)胞中elk1-cfp前體mrna的水平

6、本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過與elk1-cfp前體mrna結(jié)合來降低elk1-cfp前體mrna水平。

7、據(jù)信本發(fā)明的反義寡核苷酸與轉(zhuǎn)錄后的elk1-cfp前體mrna結(jié)合，從而引起rna酶h1的募集，這引起elk1-cfp前體mrna的裂解。據(jù)信裂解的elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物被降解。因此，細(xì)胞中elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平降低。

8、因此，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以用于去除或降低細(xì)胞中elk1-cfp前體mrna的水平。

9、在一方面，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)度為8至40個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸，其包含長(zhǎng)度為至少8個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸序列并且其與經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人cfp-elk1基因間區(qū)域互補(bǔ)。

10、在一些實(shí)施例中，與經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人cfp-elk1基因間區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸可以包含與經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人elk1-cfp基因間區(qū)域至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或完全互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列。

11、在一些實(shí)施例中，經(jīng)轉(zhuǎn)錄的人elk1-cfp基因間區(qū)域在人elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物內(nèi)。

12、在一些實(shí)施例中，連續(xù)核苷酸序列的長(zhǎng)度為8至40個(gè)核苷酸。

13、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸是單鏈的。

14、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷。

15、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸能夠募集rna酶h1。

16、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸為間隔聚體。

17、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸可以包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷間鍵。

18、在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的核苷間鍵中的一者或多者或全部可以包括硫代磷酸酯鍵。

19、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸內(nèi)存在的全部核苷間鍵可以為硫代磷酸酯核苷間鍵。

20、在一些實(shí)施例中，與對(duì)照相比，反義寡核苷酸可能能夠?qū)⒓?xì)胞中elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平降低至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或約100％。

21、在一些實(shí)施例中，對(duì)照可以為尚未暴露于反義寡核苷酸的細(xì)胞。

22、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸可以共價(jià)附接至至少一個(gè)綴合物部分。

23、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸可以呈藥用鹽的形式。

24、在一些實(shí)施例中，鹽可以為鈉鹽或鉀鹽。

25、在一些實(shí)施例中，反義寡核苷酸可以封裝在基于脂質(zhì)的遞送媒介物中、共價(jià)連接至或封裝在樹枝狀聚合物中、或綴合至適體。

26、本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的反義寡核苷酸以及藥用的稀釋劑、載體、鹽和/或輔助劑。

27、在一些實(shí)施例中，藥物組合物可以包含水性稀釋劑或溶劑，諸如磷酸鹽緩沖鹽水。

28、本發(fā)明提供了一種用于降低正在轉(zhuǎn)錄elk1-cfp前體mrna的細(xì)胞中elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平的體內(nèi)或體外方法，該方法包括使所述細(xì)胞暴露于有效量的本發(fā)明的反義寡核苷酸或本發(fā)明的藥物組合物。

29、在一些實(shí)施例中，細(xì)胞可以為人細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

30、在一些實(shí)施例中，與對(duì)照相比，人elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平可以降低至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或約100％。

31、在一些實(shí)施例中，對(duì)照為尚未暴露于反義寡核苷酸的細(xì)胞。

32、本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，該方法包括向患有或易患該疾病的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的反義寡核苷酸或本發(fā)明的藥物組合物。

33、本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明的反義寡核苷酸或本發(fā)明的藥物組合物，其作為用于治療或預(yù)防受試者的疾病的藥物使用。

34、本發(fā)明還提供了本發(fā)明的反義寡核苷酸或本發(fā)明的藥物組合物用于制備藥物的用途，該藥物用于治療或預(yù)防受試者的疾病。

35、在一些實(shí)施例中，疾病可以與人elk1-cfp前體mrna轉(zhuǎn)錄物的水平增加有關(guān)。

36、在一些實(shí)施例中，疾病可以為肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)。