本公開內(nèi)容提供了包含核酸雙鏈夾板銜接子的組合物以及使用雙鏈夾板銜接子的方法。雙鏈夾板銜接子可以與文庫(kù)分子部分雜交以形成具有缺口的文庫(kù)-夾板復(fù)合物，其中缺口可以連接以形成共價(jià)閉合環(huán)狀分子，其可以進(jìn)行下游擴(kuò)增和測(cè)序工作流程。

背景技術(shù)：

1、本公開內(nèi)容涉及從共價(jià)閉合環(huán)狀分子文庫(kù)制備多核苷酸并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。二代測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)極大地提高了測(cè)序速度和數(shù)據(jù)輸出，從而導(dǎo)致當(dāng)前測(cè)序平臺(tái)的高樣品通量。有效制備具有靶序列的閉合環(huán)狀文庫(kù)分子對(duì)于下游擴(kuò)增和測(cè)序工作流程非常重要。提高測(cè)序通量的另一個(gè)方面是在文庫(kù)制備過(guò)程中向dna片段添加唯一索引序列，這允許在每次測(cè)序運(yùn)行期間匯集大量文庫(kù)并同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。因此，需要用于產(chǎn)生和測(cè)序含有靶序列和唯一索引序列的環(huán)狀文庫(kù)分子的替代方法，其與下游二代測(cè)序技術(shù)兼容。本文提供了滿足這種需要的組合物、方法和試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開內(nèi)容提供了一種文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，其包含：(i)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)，其包括目的序列(110)，該目的序列在一側(cè)上側(cè)接至少第一左通用銜接子序列(120)且在另一側(cè)上側(cè)接至少第一右通用銜接子序列(130)；和(ii)雙鏈夾板銜接子(200)，其包括第一夾板鏈(長(zhǎng)夾板鏈(300))和第二夾板鏈(短夾板鏈(400))，其中該雙鏈夾板銜接子(200)包括雙鏈區(qū)和兩個(gè)側(cè)接單鏈區(qū)，其中第一夾板鏈包含第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)；其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交，其中第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與文庫(kù)分子的至少第一左通用銜接子序列(120)雜交，并且其中第一夾板鏈的第二區(qū)(330)與文庫(kù)分子的至少第一右通用序列(130)雜交，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以產(chǎn)生文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)。

2、在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第二左通用銜接子序列(140)。在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第二右通用銜接子序列(150)。在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一左索引序列(160)。在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一右索引序列(170)。在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一左唯一識(shí)別序列(180)。在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一右唯一識(shí)別序列(190)。

3、在一些實(shí)施例中，所述核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含以下任意一者或者兩者或更多者的任意組合：(i)第二左通用銜接子序列(140)；(ii)第二右通用銜接子序列(150)；(iii)第一左索引序列(160)；(iv)第一右索引序列(170)；(v)第一左唯一識(shí)別序列(180)；和/或(vi)第一右唯一識(shí)別序列(190)。

4、在一些實(shí)施例中，第一左通用銜接子序列(120)和/或第二左通用銜接子序列(140)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

5、在一些實(shí)施例中，第一右通用銜接子序列(130)和/或第二右通用銜接子序列(150)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

6、在一些實(shí)施例中，所述第二夾板鏈(400)包括至少兩個(gè)子區(qū)：第一子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；和第二子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，其中第一和第二子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。

7、在一些實(shí)施例中，第二夾板鏈(400)進(jìn)一步包含任選的第三子區(qū)，其包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)。

8、在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)包含至少兩個(gè)子區(qū)：第四子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且第四子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第一子區(qū)雜交；和第五子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，并且第五子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第二子區(qū)雜交；其中第四和第五子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)進(jìn)一步包含第六子區(qū)，所述第六子區(qū)包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)，其中第六子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第三子區(qū)雜交。

9、本公開內(nèi)容提供了一種文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，其包含：a)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)，其包含以5'至3'順序排列的組分：(i)第一左通用銜接子序列(120)，其具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)；(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)目的序列(110)；(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；以及(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)；b)第一夾板鏈(300)，其包含以5'至3'順序排列的組分：第一區(qū)(320)；內(nèi)部區(qū)(310)；和第二區(qū)(330)；以及c)第二夾板鏈(400)，其包含以3'至5'順序排列的子區(qū)：具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列的第一子區(qū)；和第二子區(qū)，其具有針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列；其中第一夾板鏈(300)與文庫(kù)分子(100)的部分雜交，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以產(chǎn)生文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，使得第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)雜交，并且第一夾板鏈的第三區(qū)(330)與針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)雜交，其中第二夾板鏈(400)與第一夾板鏈(300)的內(nèi)部區(qū)(310)雜交，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈的3'端之間的第一缺口，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在第二夾板鏈的5'端與文庫(kù)分子的3'端之間的第二缺口，并且其中第一和第二缺口是可酶促連接的。

10、在一些實(shí)施例中，文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)進(jìn)一步包含多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，其中多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物中的各個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物的目的序列(110)包含相同的目的序列或不同的目的序列。

11、本公開內(nèi)容提供了包含本公開內(nèi)容的多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)以及t4多核苷酸激酶的反應(yīng)混合物。本公開內(nèi)容提供了包含本公開內(nèi)容的多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)以及連接酶的反應(yīng)混合物。本公開內(nèi)容提供了包含本公開內(nèi)容的多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)、t4多核苷酸激酶和連接酶的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施例中，連接酶包含t7?dna連接酶、t3連接酶、t4連接酶或taq連接酶。

12、本公開內(nèi)容提供共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，其包含：目的序列(110)、至少第一左通用銜接子序列(120)、至少第一右通用銜接子序列(130)和第二夾板鏈序列(400)。

13、在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第二左通用銜接子序列(140)。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第二右通用銜接子序列(150)。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第一左索引序列(160)。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第一右索引序列(170)。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第一左唯一識(shí)別序列(180)。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：第一右唯一識(shí)別序列(190)。

14、在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含：以下任意一者或者兩者或更多者的任意組合：(i)第二左通用銜接子序列(140)；(ii)第二右通用銜接子序列(150)；(iii)第一左索引序列(160)；(iv)第一右索引序列(170)；(v)第一左唯一識(shí)別序列(180)；和/或(vi)第一右唯一識(shí)別序列(190)。

15、在一些實(shí)施例中，第一左通用銜接子序列(120)和/或第二左通用銜接子序列(140)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

16、在一些實(shí)施例中，第一右通用銜接子序列(130)和/或第二右通用銜接子序列(150)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

17、在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的閉環(huán)文庫(kù)分子(600)與第一夾板鏈(長(zhǎng)夾板鏈(300))雜交，第一夾板鏈包含第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，其中共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子的第二夾板鏈序列(400)與第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)雜交，其中第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與文庫(kù)分子的至少第一左通用銜接子序列(120)雜交，并且其中第一夾板鏈的第二區(qū)(330)與文庫(kù)分子的至少第一右通用序列(130)雜交。

18、在一些實(shí)施例中，所述第二夾板鏈(400)包括至少兩個(gè)子區(qū)：第一子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；和第二子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，其中第一和第二子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。

19、在一些實(shí)施例中，第二夾板鏈(400)進(jìn)一步包含任選的第三子區(qū)，其包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)。

20、在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)包含至少兩個(gè)子區(qū)：第四子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且第四子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第一子區(qū)雜交；和第五子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，并且第五子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第二子區(qū)雜交；其中第四和第五子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)進(jìn)一步包含第六子區(qū)，所述第六子區(qū)包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)，其中第六子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第三子區(qū)雜交。

21、本公開內(nèi)容提供了單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子(600)，其包含：(i)具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)的第一左通用銜接子序列(120)；(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)目的序列(110)；(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)；以及(vi)第二夾板鏈(400)，其中共價(jià)閉合環(huán)狀分子(600)任選地與第一夾板鏈(300)雜交。

22、在一些實(shí)施例中，共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)進(jìn)一步包含多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，其中多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子中的各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的目的序列(110)包含相同的目的序列或不同的目的序列。

23、本公開內(nèi)容提供了包含本公開內(nèi)容的多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的反應(yīng)混合物，其中各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與第一夾板鏈(300)雜交。在一些實(shí)施例中，多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)和至少一種核酸外切酶。在一些實(shí)施例中，核酸外切酶包含核酸外切酶i、不耐熱核酸外切酶i或t7核酸外切酶。

24、本公開內(nèi)容提供了一種試劑盒，其包含：雙鏈夾板銜接子(200)，其包括(i)第一夾板鏈(長(zhǎng)夾板鏈(300))和(ii)第二夾板鏈(短夾板鏈(400))，其中第一夾板鏈(300)可以與第二夾板鏈(400)雜交以形成雙鏈區(qū)和兩個(gè)側(cè)接單鏈區(qū)，其中第一夾板鏈(300)包含第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)可以與第二夾板鏈(400)雜交。在一些實(shí)施例中，第一夾板鏈(300)和第二夾板鏈(400)彼此雜交以形成具有雙鏈區(qū)和兩個(gè)側(cè)接單鏈區(qū)的雙鏈夾板銜接子(200)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)可以與第二夾板鏈(400)雜交。

25、在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的試劑盒用于使具有目的序列(110)的單鏈核酸文庫(kù)分子(100)成環(huán)，該目的序列在一側(cè)上側(cè)接至少第一左通用銜接子序列(120)并且在另一側(cè)上側(cè)接至少第一右通用銜接子序列(130)。在一些實(shí)施例中，第一夾板鏈的第一區(qū)(320)可以與文庫(kù)分子(100)的至少第一左通用銜接子序列(120)雜交，并且其中第一夾板鏈的第二區(qū)(330)可以與文庫(kù)分子的至少第一右通用銜接子序列(130)雜交。在一些實(shí)施例中，文庫(kù)分子(100)的至少第一左通用銜接子序列(120)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

26、在一些實(shí)施例中，文庫(kù)分子(100)的至少第一右通用銜接子序列(130)包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

27、在一些實(shí)施例中，所述第二夾板鏈(400)包括至少兩個(gè)子區(qū)：第一子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；和第二子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，其中第一和第二子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，第二夾板鏈(400)進(jìn)一步包含任選的第三子區(qū)，其包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)。

28、在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)包含至少兩個(gè)子區(qū)：第四子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且第四子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第一子區(qū)雜交；和第五子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，并且第五子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第二子區(qū)雜交；其中第四和第五子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)進(jìn)一步包含第六子區(qū)，所述第六子區(qū)包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)，其中第六子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第三子區(qū)雜交。

29、在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的試劑盒進(jìn)一步包含t4多核苷酸激酶。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的試劑盒進(jìn)一步包含連接酶。在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容的試劑盒進(jìn)一步包含t4多核苷酸激酶和連接酶。在一些實(shí)施例中，連接酶包含t7?dna連接酶、t3連接酶、t4連接酶或taq連接酶。

30、本公開內(nèi)容提供了用于形成多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)的方法，其包括：a)提供多個(gè)雙鏈夾板銜接子，其中各個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)包含與第二夾板鏈(400)雜交的第一夾板鏈(300)，其中雙鏈夾板銜接子包括雙鏈區(qū)和兩個(gè)側(cè)接單鏈區(qū)，其中第一夾板鏈包含第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交；以及b)將多個(gè)雙鏈夾板銜接子與多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)雜交，其中各個(gè)文庫(kù)分子包括在一側(cè)上側(cè)接至少第一左通用銜接子序列(120)并且在另一側(cè)上側(cè)接至少第一右通用銜接子序列(130)的目的序列(110)，其中雜交在適用于將第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與文庫(kù)分子的至少第一左通用銜接子序列(120)雜交的條件下進(jìn)行，并且該條件適用于使第一夾板鏈的第二區(qū)(330)與文庫(kù)分子的至少第一右通用序列(130)雜交，由此使多個(gè)文庫(kù)分子成環(huán)以形成多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)。

31、在一些實(shí)施例中，多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物中的各個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈的3'端之間的第一缺口，并且其中多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物中的各個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在第二夾板鏈的5'端與文庫(kù)分子的3'端之間的第二缺口。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第二左通用銜接子序列(140)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第二右通用銜接子序列(150)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一左索引序列(160)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一右索引序列(170)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一左唯一識(shí)別序列(180)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含：第一右唯一識(shí)別序列(190)。

32、在一些實(shí)施例中，多個(gè)核酸文庫(kù)分子中的各個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含以下任意一者或者兩者或更多者的任意組合：(i)第二左通用銜接子序列(140)；(ii)第二右通用銜接子序列(150)；(iii)第一左索引序列(160)；(iv)第一右索引序列(170)；(v)第一左唯一識(shí)別序列(180)；和/或(vi)第一右唯一識(shí)別序列(190)。在一些實(shí)施例中，第一和/或第二左通用銜接子序列包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

33、在一些實(shí)施例中，第一和/或第二右通用銜接子序列包含：(i)針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(ii)針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列；(iii)針對(duì)第一表面引物的通用結(jié)合序列；(iv)針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列；(v)針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；(vi)針對(duì)反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；和/或(vii)針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

34、在一些實(shí)施例中，所述第二夾板鏈(400)包括至少兩個(gè)子區(qū)：第一子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；和第二子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，其中第一和第二子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，第二夾板鏈(400)進(jìn)一步包含任選的第三子區(qū)，其包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)。

35、在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)包含至少兩個(gè)子區(qū)：第四子區(qū)，其包含針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且第四子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第一子區(qū)雜交；和第五子區(qū)，其包含針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，并且第五子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第二子區(qū)雜交；其中第四和第五子區(qū)不與第一和第二表面引物雜交(或至少表現(xiàn)出非常少的雜交)。在一些實(shí)施例中，所述第一夾板鏈(300)包括內(nèi)部區(qū)(310)，該內(nèi)部區(qū)進(jìn)一步包含第六子區(qū)，所述第六子區(qū)包含具有5-20個(gè)堿基的樣品索引序列和/或具有2-10個(gè)或更多個(gè)堿基的唯一識(shí)別序列(例如，nn)，其中第六子區(qū)與第二夾板鏈(400)的第三子區(qū)雜交。

36、本公開內(nèi)容提供了用于形成多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)的方法，其包括：a)提供多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)，其中各個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)包含與第二夾板鏈(400)雜交的第一夾板鏈(300)，其中第一夾板鏈(300)包含以5'至3'順序排列的區(qū)：第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交，其中第二夾板鏈包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)第二子區(qū)，其具有針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，和(ii)第一子區(qū)，其具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；以及b)將多個(gè)雙鏈夾板銜接子與多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)雜交，其中各個(gè)文庫(kù)分子包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)的第一左通用銜接子序列(120)；(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)目的序列(110)；(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；以及(v)具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)的第一右通用銜接子序列(130)，其中雜交在適用于使第一夾板鏈(300)的部分與文庫(kù)分子(100)的部分雜交的條件下進(jìn)行，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以產(chǎn)生文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，使得第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)雜交，并且第一夾板鏈的第三區(qū)(330)與針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)雜交，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈(300)的3'端之間的第一缺口，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在第二夾板鏈(300)的5'端與文庫(kù)分子(100)的3'端之間的第二缺口，并且其中第一和第二缺口是可酶促連接的。

37、在一些實(shí)施例中，多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含第一左唯一識(shí)別序列(180)和/或第一右唯一識(shí)別序列(190)。

38、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和/或多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的5'端磷酸化的條件下，使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與t4多核苷酸激酶接觸。

39、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適用于酶促連接第一和第二缺口的條件下，使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與連接酶接觸，由此生成多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，每個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子與第一夾板鏈(300)雜交。

40、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括進(jìn)行以下連續(xù)步驟：a)在適用于使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的5'端磷酸化的條件下，使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與t4多核苷酸激酶接觸；以及b)在適用于酶促連接第一和第二缺口的條件下，使磷酸化的雙鏈夾板銜接子(200)和磷酸化的單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與連接酶接觸，由此生成多個(gè)共價(jià)閉合的環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，每個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子與第一夾板鏈(300)雜交。

41、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括，進(jìn)行以下基本上同時(shí)發(fā)生的步驟：在適用于使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的5'端磷酸化的條件下，并且所述條件適用于酶促連接第一和第二缺口，使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與(i)t4多核苷酸激酶和(ii)連接酶接觸，由此生成多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，每個(gè)文庫(kù)分子與第一夾板鏈(300)雜交。

42、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括使多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與至少一種核酸外切酶接觸，以移除多個(gè)第一夾板鏈(300)，并保留多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)。在一些實(shí)施例中，至少一種核酸外切酶包含核酸外切酶i、不耐熱核酸外切酶i和/或t7核酸外切酶。

43、在一些實(shí)施例中，多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子中的各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)包含第二夾板鏈區(qū)(400)，其包括針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且其中該方法進(jìn)一步包括：在適用于使各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與各個(gè)固定的第三表面引物雜交的條件下，將保留的多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)分布到支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第三表面引物，由此固定多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)。

44、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合于使用多個(gè)第三表面引物作為固定的擴(kuò)增引物，并使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使所述多個(gè)固定的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

45、在一些實(shí)施例中，多個(gè)文庫(kù)分子中的各個(gè)文庫(kù)分子的第一(120)或第二(140)左通用銜接子序列包含針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：a)使多個(gè)可溶性正向擴(kuò)增引物與第一或第二左通用銜接子序列雜交，該第一或第二左通用銜接子序列包含針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；以及b)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此生成多個(gè)核酸多聯(lián)體分子。

46、在一些實(shí)施例中，多個(gè)文庫(kù)分子中的各個(gè)文庫(kù)分子的第一(130)或第二(150)右通用銜接子序列包含針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：a)使多個(gè)可溶性正向擴(kuò)增引物與第一或第二右通用銜接子序列雜交，該第一或第二右通用銜接子序列包含針對(duì)正向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列；以及b)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此生成多個(gè)核酸多聯(lián)體分子，每個(gè)核酸多聯(lián)體分子與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交。

47、在一些實(shí)施例中，多個(gè)多聯(lián)體分子中的各個(gè)多聯(lián)體分子包含具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列的第二夾板鏈區(qū)(400)，其中各個(gè)多聯(lián)體分子與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交，并且該方法進(jìn)一步包括：在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將多個(gè)多聯(lián)體分子分布到支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第三表面引物，由此固定多個(gè)多聯(lián)體分子。

48、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使固定的多個(gè)多聯(lián)體分子(其與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

49、在一些實(shí)施例中，多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子中的各個(gè)文庫(kù)分子(600)與第一夾板鏈(300)雜交，并且該方法進(jìn)一步包括：在適合于使用第一夾板鏈(300)作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)多聯(lián)體分子。

50、在一些實(shí)施例中，多個(gè)多聯(lián)體分子中的各個(gè)多聯(lián)體分子包含第二夾板鏈區(qū)(400)，該第二夾板鏈包括針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子分布到支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第三表面引物，由此固定與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子。

51、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。在一些實(shí)施例中，支持物進(jìn)一步包含固定在支持物上的多個(gè)第四表面引物。

52、在一些實(shí)施例中，多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子包含至少兩個(gè)第二夾板鏈區(qū)(400)，每個(gè)第二夾板鏈區(qū)具有針對(duì)第三和第四表面引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：在適用于使至少一個(gè)多聯(lián)體分子的至少一個(gè)第二夾板鏈區(qū)(400)與固定的第四表面引物雜交的條件下，孵育多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，由此將固定的多聯(lián)體分子的至少一部分固化至支持物。

53、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的多聯(lián)體分子進(jìn)行測(cè)序，該方法包括：a)使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與(i)多個(gè)測(cè)序聚合酶和(ii)多個(gè)可溶性測(cè)序引物接觸，其中所述接觸在適合形成多個(gè)復(fù)合聚合酶的條件下進(jìn)行，每個(gè)復(fù)合聚合酶包含與核酸雙鏈體結(jié)合的測(cè)序聚合酶，其中所述核酸雙鏈體包含與可溶性測(cè)序引物雜交的多聯(lián)體分子；b)在適用于將至少一個(gè)核苷酸與復(fù)合測(cè)序聚合酶結(jié)合的條件下，使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，其中所述多個(gè)核苷酸包括至少一個(gè)用熒光團(tuán)標(biāo)記并在糖3'位置處具有可移除鏈終止部分的核苷酸類似物；c)將至少一個(gè)核苷酸摻入到雜交的測(cè)序引物的3'端中，由此生成多個(gè)新生的延伸測(cè)序引物；以及d)檢測(cè)摻入的核苷酸并識(shí)別摻入的核苷酸的核堿基。

54、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的多聯(lián)體分子進(jìn)行測(cè)序，該方法包括：a)使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與(i)多個(gè)測(cè)序聚合酶和(ii)多個(gè)可溶性測(cè)序引物接觸，其中所述接觸在適合形成多個(gè)第一復(fù)合聚合酶的條件下進(jìn)行，每個(gè)第一復(fù)合聚合酶包含與核酸雙鏈體結(jié)合的測(cè)序聚合酶，其中所述核酸雙鏈體包含與可溶性測(cè)序引物雜交的多聯(lián)體分子；b)在適用于將多價(jià)分子的互補(bǔ)核苷酸單元與多個(gè)第一復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)結(jié)合以形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶的條件下，使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子接觸，由此形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶，并且所述條件抑制互補(bǔ)核苷酸單元摻入到多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中，其中多個(gè)多價(jià)分子中的各個(gè)多價(jià)分子包含附接至多個(gè)核苷酸臂的核心，并且每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元；c)檢測(cè)多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶；以及d)識(shí)別與所述多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶中的多個(gè)第一復(fù)合聚合酶結(jié)合的互補(bǔ)核苷酸單元的核堿基，由此確定核酸模板的序列。

55、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：e)解離多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶并移除多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和其結(jié)合的多價(jià)分子，并保留多個(gè)核酸雙鏈體；f)使步驟(e)的多個(gè)保留的核酸雙鏈體與多個(gè)第二測(cè)序聚合酶接觸，其中所述接觸在適合使多個(gè)第二測(cè)序聚合酶與多個(gè)保留的核酸雙鏈體結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成與保留的核酸雙鏈體結(jié)合的第二測(cè)序聚合酶的多個(gè)第二復(fù)合聚合酶；g)使多個(gè)第二復(fù)合聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，其中接觸在適用于使多個(gè)核苷酸中的互補(bǔ)核苷酸與步驟(f)的第二復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個(gè)核苷酸-復(fù)合聚合酶，并且該條件適用于促進(jìn)結(jié)合的互補(bǔ)核苷酸摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括至少一個(gè)用熒光團(tuán)標(biāo)記并在糖3'位置處具有可移除鏈終止部分的核苷酸類似物。

56、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：h)檢測(cè)摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：h)檢測(cè)摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸；以及i)識(shí)別摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸的核堿基。

57、本公開內(nèi)容提供了形成至少一種親和力復(fù)合物的方法，其包括：a)將第一通用核酸引物、第一dna聚合酶和第一多價(jià)分子與權(quán)利要求80、85、89或92中任一項(xiàng)的任意多聯(lián)體分子的第一部分結(jié)合，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，其中該第一多價(jià)分子的第一核苷酸單元結(jié)合第一dna聚合酶；以及b)將第二通用核酸引物、第二dna聚合酶和第一多價(jià)分子與同一多聯(lián)體模板分子的第二部分結(jié)合，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第二核苷酸單元結(jié)合第二dna聚合酶，其中包括同一多價(jià)分子的第一和第二結(jié)合復(fù)合物形成親和力復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子包含附接至多個(gè)核苷酸臂的核心，并且每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元，并且其中多聯(lián)體分子包含目的序列(110)的兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列以及結(jié)合第一和第二通用核酸引物的通用引物結(jié)合位點(diǎn)。

58、本公開內(nèi)容提供了通過(guò)形成至少一個(gè)親和力復(fù)合物進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括：a)將第一通用核酸引物、第一dna聚合酶和第一多價(jià)分子與本公開內(nèi)容的任意多聯(lián)體分子的第一部分結(jié)合，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第一核苷酸單元結(jié)合第一dna聚合酶；b)將第二通用核酸引物、第二dna聚合酶和第一多價(jià)分子與同一多聯(lián)體模板分子的第二部分結(jié)合，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第二核苷酸單元結(jié)合第二dna聚合酶，其中包括同一多價(jià)分子的第一和第二結(jié)合復(fù)合物形成親和力復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子包含附接至多個(gè)核苷酸臂的核心并且每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元，其中多聯(lián)體分子包含目的序列(110)的兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列以及結(jié)合第一和第二通用核酸引物的通用引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其中接觸在適合抑制結(jié)合的第一和第二核苷酸單元聚合酶催化摻入第一和第二結(jié)合復(fù)合物中的條件下進(jìn)行；c)檢測(cè)同一多聯(lián)體模板分子上的第一和第二結(jié)合復(fù)合物，和d)識(shí)別第一結(jié)合復(fù)合物中的第一核苷酸單元，由此確定多聯(lián)體模板分子的第一部分的序列，并識(shí)別第二結(jié)合復(fù)合物中的第二核苷酸單元，由此確定多聯(lián)體模板分子的第二部分的序列。

59、本公開內(nèi)容提供了一種用于制備從多個(gè)樣品源分離的目的序列的多重混合物的方法，其包括：a)提供單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的兩個(gè)或更多個(gè)群體，每個(gè)文庫(kù)分子(100)群體包含在單獨(dú)的區(qū)室中，其中給定群體中的核酸文庫(kù)分子包含(i)第一左通用銜接子序列(120)，其具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列，(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)從樣品源分離的目的序列(110)，(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列，和(vii)第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)，其中左(160)和/或右(170)索引的序列單獨(dú)地或組合地識(shí)別從中分離出目的序列(110)的樣品源；b)提供多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)，其中各個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)包含與第二夾板鏈(400)雜交的第一夾板鏈(300)，其中第一夾板鏈(300)包含以5'至3'順序排列的區(qū)：第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交，其中第二夾板鏈包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)具有針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列的第二子區(qū)，和(ii)具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列的第一子區(qū)；c)在單獨(dú)的區(qū)室中使單鏈核酸文庫(kù)分子(100)群體與多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)接觸，其中所述接觸在適用于使部分第一夾板鏈(300)與文庫(kù)分子(100)的部分雜交的條件下進(jìn)行，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以生成文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)群體，使得各個(gè)第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與各個(gè)文庫(kù)分子(100)的針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)雜交，并且各個(gè)第一夾板鏈的第三區(qū)(330)與各個(gè)文庫(kù)分子(100)的針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)雜交，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)中的每一者包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈(300)的3'端之間的第一缺口，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)中的每一者包含在第二夾板鏈(300)的5'端與文庫(kù)分子(100)的3'端之間的第二缺口，并且其中第一和第二缺口是可酶促連接的；d)在單獨(dú)的區(qū)室中，在適用于酶促連接第一和第二缺口的條件下，使文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)群體與連接酶接觸，由此生成共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的兩個(gè)或更多個(gè)群體，各個(gè)分子群體與第一夾板鏈(300)雜交；以及e)將來(lái)自單獨(dú)區(qū)室的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的兩個(gè)或更多個(gè)群體匯集在一起，以生成共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的多重混合物，其包含從多個(gè)樣品源分離的目的序列的多重混合物。

60、在一些實(shí)施例中，步驟(e)的多重混合物中的各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)包含第二夾板鏈區(qū)(400)，其包括針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：a)在適用于使各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與各個(gè)固定的第三表面引物雜交的條件下，將共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的多重混合物分布到具有固定在支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第三表面引物，由此固定多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)；以及b)在適合于使用多個(gè)第三表面引物作為固定的擴(kuò)增引物，并使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使固定的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的多重混合物與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

61、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：通過(guò)以下方式進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)：a)在適合移除多個(gè)第一夾板鏈(300)并保留共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體的條件下，使與步驟(d)或(e)的第一夾板鏈(300)雜交的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的兩個(gè)或更多個(gè)群體與至少一種核酸外切酶接觸；以及b)在適合進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使保留的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的兩個(gè)或更多個(gè)群體與多個(gè)可溶性擴(kuò)增引物、多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

62、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：a)在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將多個(gè)多聯(lián)體分子分布到其上固定有多個(gè)第三表面引物的支持物上，由此固定多個(gè)多聯(lián)體分子；以及b)在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使固定的多個(gè)多聯(lián)體分子(其與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

63、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，通過(guò)使各與步驟(d)或(e)的第一夾板鏈(300)雜交的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的兩個(gè)或更多個(gè)群體與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，來(lái)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此生成多個(gè)多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

64、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：a)在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子分布到其上固定有多個(gè)第三表面引物的支持物上，由此固定與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子；和b)在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

65、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子的插入?yún)^(qū)(110)和第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)進(jìn)行測(cè)序，其中插入?yún)^(qū)的序列(110)以及第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)可用于識(shí)別目的序列的樣品源。

66、在一些實(shí)施例中，測(cè)序反應(yīng)包含：a)在適用于將可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物摻入到測(cè)序引物的3'端中的條件下，將多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序引物、多個(gè)測(cè)序聚合酶和多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物結(jié)合，每個(gè)核苷酸類似物包含2'或3'鏈終止部分；b)檢測(cè)結(jié)合的可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物；以及c)識(shí)別可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物的核堿基。在一些實(shí)施例中，測(cè)序反應(yīng)采用兩階段測(cè)序反應(yīng)，其中第一階段包含：a)在適用于使各個(gè)多聯(lián)體分子與測(cè)序引物、第一測(cè)序聚合酶和可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子結(jié)合的條件下，將多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序引物、多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子結(jié)合(例如，形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶)；b)檢測(cè)結(jié)合的可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子；以及c)識(shí)別可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子的核堿基。在一些實(shí)施例中，可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子與多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子的結(jié)合，形成至少一種親和力復(fù)合物。

67、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括進(jìn)行第二階段，其包含：d)從多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子中移除多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)結(jié)合的多價(jià)分子，并保留各自與測(cè)序引物雜交的固定的多聯(lián)體分子(核酸雙鏈體)；以及e)在適用于將核苷酸摻入到測(cè)序引物的3'端中的條件下，使保留的固定的多聯(lián)體分子和雜交的測(cè)序引物與多個(gè)第二聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸。

68、本公開內(nèi)容提供了一種用于制備從多個(gè)樣品源分離的目的序列的多重混合物的方法，其包括：a)提供單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的兩個(gè)或更多個(gè)群體，每個(gè)文庫(kù)分子(100)群體、每個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子群體包含在單獨(dú)的區(qū)室中，其中給定群體中的核酸文庫(kù)分子包含(i)第一左通用銜接子序列(120)，其具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列，(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)從樣品源分離的目的序列(110)，(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列，和(vi)第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)，其中左(160)和/或右(170)索引序列單獨(dú)地或組合地識(shí)別從中分離出目的序列(110)的樣品源；b)將單鏈核酸文庫(kù)分子(100)的兩個(gè)或更多個(gè)群體匯集到同一區(qū)室中；c)向步驟(b)的區(qū)室添加多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)，其中各個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)包含與第二夾板鏈(400)雜交的第一夾板鏈(300)，其中第一夾板鏈(300)包含以5'至3'順序排列的區(qū)：第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交，其中第二夾板鏈包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)第二子區(qū)，其具有針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，和(ii)第一子區(qū)，其具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；d)在適用于使第一夾板(300)的部分與文庫(kù)分子(100)的部分雜交的條件下，在步驟(c)的同一區(qū)室中，孵育單鏈核酸文庫(kù)分子(100)群體和多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以生成文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)群體，使得各個(gè)第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與各個(gè)文庫(kù)分子(100)的針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列(120)雜交，并且各個(gè)第一夾板鏈的第三區(qū)(330)與各個(gè)文庫(kù)分子(100)的針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列(130)雜交，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)中的每一者包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈(300)的3'端之間的第一缺口，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)中的每一者包含在第二夾板鏈(300)的5'端與文庫(kù)分子(100)的3'端之間的第二缺口，并且其中第一和第二缺口是可酶促連接的；以及e)在適用于酶促連接第一和第二缺口的條件下，使步驟(d)的區(qū)室中的文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)群體與連接酶接觸，由此生成各自與第一夾板鏈(300)雜交的共價(jià)閉合的環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體，由此生成共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)的多重混合物，其包含從多個(gè)樣品源分離的目的序列的多重混合物。

69、在一些實(shí)施例中，步驟(e)的多重混合物中的各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)包含第二夾板鏈區(qū)(400)，其包括針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：a)在適用于使各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與各個(gè)固定的第三表面引物雜交的條件下，將多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)分布到支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第三表面引物，由此固定多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)；以及b)在適合于使用多個(gè)第三表面引物作為固定的擴(kuò)增引物，使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)固定的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

70、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：通過(guò)以下方式進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)：a)在適合移除多個(gè)第一夾板鏈(300)并保留共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體的條件下，使與步驟(d)或(e)的第一夾板鏈(300)雜交的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體與至少一種核酸外切酶接觸；b)在適合進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使保留的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體與多個(gè)可溶性擴(kuò)增引物、多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

71、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：c)在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將多個(gè)多聯(lián)體分子分布到其上固定有多個(gè)第三表面引物的支持物上，由此固定多個(gè)多聯(lián)體分子；以及d)在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使固定的多個(gè)多聯(lián)體分子(其與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

72、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，通過(guò)將各自與步驟(d)或(e)的第一夾板鏈(300)雜交的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)群體與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，來(lái)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此生成多個(gè)多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

73、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：c)在適用于使多聯(lián)體的至少一部分與多個(gè)固定的第三表面引物的至少一部分雜交的條件下，將與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子分布到其上固定有多個(gè)第三表面引物的支持物上，由此固定與共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)雜交的多個(gè)多聯(lián)體分子；以及d)在適合于使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此延伸多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子，其中所述多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

74、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子的插入?yún)^(qū)(110)和第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)進(jìn)行測(cè)序，其中插入?yún)^(qū)序列(110)以及第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)可用于識(shí)別目的序列的樣品源。

75、在一些實(shí)施例中，測(cè)序反應(yīng)包含：a)在適用于將可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物摻入到測(cè)序引物的3'端中的條件下，將多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序引物、多個(gè)測(cè)序聚合酶和多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物結(jié)合，每個(gè)核苷酸類似物包含2'或3'鏈終止部分；b)檢測(cè)結(jié)合的可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物；以及c)識(shí)別可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸類似物的核堿基。

76、在一些實(shí)施例中，測(cè)序反應(yīng)采用兩階段測(cè)序反應(yīng)，其中第一階段包含：a)在適用于使各個(gè)多聯(lián)體分子與測(cè)序引物、第一測(cè)序聚合酶和可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子結(jié)合的條件下，將多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序引物、多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子結(jié)合(例如，形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶)；b)檢測(cè)結(jié)合的可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子；以及c)識(shí)別可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子的核堿基。在一些實(shí)施例中，可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子與多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子形成至少一種親和力復(fù)合物。

77、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括進(jìn)行第二階段，其包含：d)從多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子中移除多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)結(jié)合的多價(jià)分子，并保留各自與測(cè)序引物雜交的固定的多聯(lián)體分子(核酸雙鏈體)；以及e)在適用于將核苷酸摻入到測(cè)序引物的3'端中的條件下，使保留的固定的多聯(lián)體分子和雜交的測(cè)序引物與多個(gè)第二聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸。

78、本公開內(nèi)容提供了一種用于將額外的通用銜接子測(cè)序附加到核酸文庫(kù)分子的方法，其包括：a)提供多個(gè)核酸文庫(kù)分子(100)，每個(gè)核酸文庫(kù)分子包含以5'至3'順序排列的序列：(i)第一左通用銜接子序列(120)、(ii)第二左通用銜接子序列(140)、(iii)目的序列(110)、(iv)第二右通用銜接子序列(150)和(v)第一右通用銜接子序列(130)；b)將步驟(a)的各個(gè)文庫(kù)分子與第一有尾引物雜交，并進(jìn)行第一引物延伸反應(yīng)(或第一pcr)，其中第一有尾引物包含攜帶第三左通用銜接子序列的5'區(qū)和與文庫(kù)分子(100)的第一左通用銜接子序列(120)的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第一引物延伸反應(yīng)(或第一pcr)生成多個(gè)第一修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第一修飾文庫(kù)分子在一個(gè)末端附加有第三左通用銜接子序列，其中第一有尾引物的第三左通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列；以及c)將步驟(a)的各個(gè)第一修飾文庫(kù)分子與第二有尾引物雜交并進(jìn)行第二引物延伸反應(yīng)(或第二pcr)，其中第二有尾引物包含攜帶第三右通用銜接子序列的5'區(qū)和與第一修飾文庫(kù)分子的第一右通用銜接子序列(130)的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第二引物延伸反應(yīng)(或第二pcr)生成多個(gè)第二修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第二修飾文庫(kù)分子在一個(gè)末端附加有第三右通用銜接子序列，其中第二有尾引物的第三右通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

79、在一些實(shí)施例中，核酸文庫(kù)分子各自包含以5'至3'順序排列的序列：(i)第一左通用銜接子序列(120)，其具有針對(duì)第一表面引物的結(jié)合序列，(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列，(iii)目的序列(110)，(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列，和(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第二表面引物的結(jié)合序列。

80、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d)將步驟(c)的各個(gè)第二修飾文庫(kù)分子與第三有尾引物雜交并進(jìn)行第三引物延伸反應(yīng)(或第三pcr)，其中第三有尾引物包含攜帶第四左通用銜接子序列的5'區(qū)和與第二修飾文庫(kù)分子的第三左通用銜接子序列的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第三引物延伸反應(yīng)(或第三pcr)生成多個(gè)第三修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第三修飾文庫(kù)分子在一個(gè)末端附加有第四左通用銜接子序列，其中第三有尾引物的第四左通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列；以及e)將步驟(d)的各個(gè)第三修飾文庫(kù)分子與第四有尾引物雜交并進(jìn)行第四引物延伸反應(yīng)(或第四pcr)，其中第四有尾引物包含攜帶第四右通用銜接子序列的5'區(qū)和與第三修飾文庫(kù)分子的第三右通用銜接子序列的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第四引物延伸反應(yīng)(或第四pcr)生成多個(gè)第四修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第四修飾文庫(kù)分子在一個(gè)末端附加有第四右通用銜接子序列，其中第四有尾引物的第四右通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

81、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：f)將步驟(e)的各個(gè)第四修飾文庫(kù)分子與第五有尾引物雜交并進(jìn)行第五引物延伸反應(yīng)(或第五pcr)，其中第五有尾引物包含攜帶第五左通用銜接子序列的5'區(qū)和與第四修飾文庫(kù)分子的第四左通用銜接子序列的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第五引物延伸反應(yīng)(或第五pcr)生成多個(gè)第五修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第五修飾文庫(kù)分子在一端附加有第五左通用銜接子序列，其中第五有尾引物的第五左通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列；以及g)將步驟(f)的各個(gè)第五修飾文庫(kù)分子與第六有尾引物雜交并進(jìn)行第六引物延伸反應(yīng)(或第六pcr)，其中第六有尾引物包含攜帶第六右通用銜接子序列的5'區(qū)和與第五修飾文庫(kù)分子的第四右通用銜接子序列的至少一部分互補(bǔ)的3'區(qū)，其中第六引物延伸反應(yīng)(或第六pcr)生成多個(gè)第六修飾文庫(kù)分子，每個(gè)第六修飾文庫(kù)分子在一個(gè)末端附加有第六右通用銜接子序列，其中第六有尾引物的第六右通用銜接子序列包含針對(duì)正向或反向測(cè)序引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)第一或第二表面引物的通用結(jié)合序列、針對(duì)正向或反向擴(kuò)增引物的通用結(jié)合序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的通用結(jié)合序列。

82、在一些實(shí)施例中，第一有尾引物、第三有尾引物和/或第五有尾引物進(jìn)一步包含左索引序列。在一些實(shí)施例中，第一有尾引物、第三有尾引物和/或第五有尾引物進(jìn)一步包含左唯一識(shí)別序列。在一些實(shí)施例中，第二有尾引物、第四有尾引物和/或第六有尾引物進(jìn)一步包含右索引序列。在一些實(shí)施例中，第二有尾引物、第四有尾引物和/或第六有尾引物進(jìn)一步包含右唯一識(shí)別序列。在一些實(shí)施例中，步驟(b)的附加第三左通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第一區(qū)(320)。在一些實(shí)施例中，步驟(c)的附加第三右通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第二區(qū)(330)。在一些實(shí)施例中，步驟(d)的附加第四左通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第一區(qū)(320)。在一些實(shí)施例中，步驟(e)的附加第四右通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第二區(qū)(330)。

83、在一些實(shí)施例中，步驟(f)的附加第五左通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第一區(qū)(320)。在一些實(shí)施例中，步驟(g)的附加第五右通用銜接子序列可以結(jié)合第一夾板鏈的第二區(qū)(330)。

84、本公開內(nèi)容提供了用于形成多個(gè)文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)的方法，其包括：a)提供多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)，其中各個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)包含與第二夾板鏈(400)雜交的第一夾板鏈(300)，其中第一夾板鏈(300)包含以5'至3'順序排列的區(qū)：第一區(qū)(320)、內(nèi)部區(qū)(310)和第二區(qū)(330)，并且其中第一夾板鏈的內(nèi)部區(qū)(310)與第二夾板鏈(400)雜交，其中第二夾板鏈包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)第二子區(qū)，其具有針對(duì)第四表面引物的通用結(jié)合序列，和(ii)第一子區(qū)，其具有針對(duì)第三表面引物的通用結(jié)合序列；以及b)將多個(gè)雙鏈夾板銜接子與多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)雜交，其中各個(gè)文庫(kù)分子包含以5'至3'順序排列的區(qū)：(i)第一左通用銜接子序列(120)，其具有針對(duì)第三表面引物的結(jié)合序列；(ii)第二左通用銜接子序列(140)，其具有針對(duì)第一測(cè)序引物的結(jié)合序列；(iii)目的序列(110)；(iv)第二右通用銜接子序列(150)，其具有針對(duì)第二測(cè)序引物的結(jié)合序列；以及(v)第一右通用銜接子序列(130)，其具有針對(duì)第四表面引物的結(jié)合序列，其中雜交在適用于使第一夾板鏈(300)的部分與文庫(kù)分子(100)的部分雜交的條件下進(jìn)行，由此使文庫(kù)分子成環(huán)以產(chǎn)生文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)，使得第一夾板鏈的第一區(qū)(320)與針對(duì)第三表面引物的結(jié)合序列(120)雜交，并且第一夾板鏈的第三區(qū)(330)與針對(duì)第四表面引物的結(jié)合序列(130)雜交，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在文庫(kù)分子的5'端與第二夾板鏈(400)的3'端之間的第一缺口，其中文庫(kù)-夾板復(fù)合物(500)包含在第二夾板鏈(400)的5'端與文庫(kù)分子(100)的3'端之間的第二缺口，并且其中第一和第二缺口是可酶促連接的。

85、在一些實(shí)施例中，多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含第一左索引序列(160)和/或第一右索引序列(170)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)進(jìn)一步包含第一左唯一識(shí)別序列(180)和/或第一右唯一識(shí)別序列(190)。

86、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適用于酶促連接第一和第二缺口的條件下，使多個(gè)雙鏈夾板銜接子(200)和多個(gè)單鏈核酸文庫(kù)分子(100)與連接酶接觸，由此生成多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)，每個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子與第一夾板鏈(300)雜交。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括括多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與至少一種核酸外切酶接觸，以移除多個(gè)第一夾板鏈(300)并保留多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)。

87、在一些實(shí)施例中，多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子中的各個(gè)文庫(kù)分子(600)包含第二夾板鏈區(qū)(400)，其包括針對(duì)第二表面引物的通用結(jié)合序列，并且該方法進(jìn)一步包括：在適用于使各個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與各個(gè)固定的第二表面引物雜交的條件下，將保留的多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)分布到支持物上，該支持物具有固定在其上的多個(gè)第二表面引物，由此固定多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)。

88、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：在適合于使用多個(gè)第二表面引物作為固定的擴(kuò)增引物，并使用多個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)作為模板分子，在支持物上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使多個(gè)固定的共價(jià)閉合環(huán)狀文庫(kù)分子(600)與多個(gè)鏈置換聚合酶和多個(gè)核苷酸接觸，由此生成多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp。

89、在一些實(shí)施例中，支持物上的多個(gè)固定的第二表面捕獲引物位于支持物上預(yù)定的或隨機(jī)的位置。在一些實(shí)施例中，支持物上的多個(gè)固定的第二表面捕獲引物彼此流體連通，以允許試劑溶液流動(dòng)到支持物上，使得多個(gè)固定的第二表面引物可以大規(guī)模并行方式基本上同時(shí)與試劑反應(yīng)，任選地其中試劑溶液包含酶、核苷酸和二價(jià)陽(yáng)離子。在一些實(shí)施例中，支持物上的多個(gè)固定的核酸多聯(lián)體分子的密度為104–108個(gè)/mm2。

90、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的多聯(lián)體進(jìn)行測(cè)序，其中測(cè)序包含：a)使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與(i)多個(gè)測(cè)序聚合酶和(ii)多個(gè)可溶性測(cè)序引物接觸，其中所述接觸在適合形成多個(gè)復(fù)合聚合酶的條件下進(jìn)行，每個(gè)復(fù)合聚合酶包含與核酸雙鏈體結(jié)合的測(cè)序聚合酶，其中所述核酸雙鏈體包含與可溶性測(cè)序引物雜交的多聯(lián)體分子；b)在適用于將至少一個(gè)核苷酸與復(fù)合測(cè)序聚合酶結(jié)合的條件下，使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，其中所述多個(gè)核苷酸包括至少一個(gè)用熒光團(tuán)標(biāo)記并在糖3'位置處具有可移除鏈終止部分的核苷酸類似物；c)將至少一個(gè)核苷酸摻入到雜交的測(cè)序引物的3'端中，由此生成多個(gè)新生的延伸測(cè)序引物；以及d)檢測(cè)摻入的核苷酸并識(shí)別摻入的核苷酸的核堿基。

91、在一些實(shí)施例中，所述多個(gè)核苷酸在3'糖基處包含可移除鏈終止部分，其中該可移除鏈終止部分包含烷基基團(tuán)、烯基基團(tuán)、炔基基團(tuán)、烯丙基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、疊氮基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、o-疊氮基甲基基團(tuán)、胺基團(tuán)、酰胺基團(tuán)、酮基基團(tuán)、異氰酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、硫代基團(tuán)、二硫基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、脲基團(tuán)或甲硅烷基基團(tuán)，并且其中可以使用化學(xué)化合物裂解可移除鏈終止部分，以在糖基上生成可延伸的3'oh部分。在一些實(shí)施例中，所述多個(gè)核苷酸包括選自由datp、dgtp、dctp、dttp和dutp組成的組的一個(gè)類型的核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述多個(gè)核苷酸包括選自由datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp組成的組的兩個(gè)或更多個(gè)類型的核苷酸的任意組合的混合物。

92、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：對(duì)多個(gè)固定的多聯(lián)體分子進(jìn)行測(cè)序，其中測(cè)序包含：a)使多個(gè)固定的多聯(lián)體分子與(i)多個(gè)測(cè)序聚合酶和(ii)多個(gè)可溶性通用測(cè)序引物接觸，其中所述接觸在適合形成多個(gè)第一復(fù)合聚合酶的條件下進(jìn)行，每個(gè)第一復(fù)合聚合酶包含與核酸雙鏈體結(jié)合的測(cè)序聚合酶，其中所述核酸雙鏈體包含與可溶性測(cè)序引物雜交的多聯(lián)體分子；b)在適用于將多價(jià)分子的互補(bǔ)核苷酸單元與多個(gè)第一復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)結(jié)合以形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶的條件下，使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子接觸，由此形成多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶，并且所述條件抑制互補(bǔ)核苷酸單元摻入到多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中，其中多個(gè)多價(jià)分子中的各個(gè)多價(jià)分子包含附接至多個(gè)核苷酸臂的核心，并且每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元；以及c)檢測(cè)多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶。

93、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d解離多個(gè)多價(jià)-復(fù)合聚合酶并移除多個(gè)第一測(cè)序聚合酶及其結(jié)合的多價(jià)分子，并保留多個(gè)核酸雙鏈體；e)使步驟d)的多個(gè)保留的核酸雙鏈體與多個(gè)第二測(cè)序聚合酶接觸，其中接觸在適用于將多個(gè)第二測(cè)序聚合酶與多個(gè)保留的核酸雙鏈體結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成與保留的核酸雙鏈體結(jié)合的第二測(cè)序聚合酶的多個(gè)第二復(fù)合聚合酶；f)使多個(gè)第二復(fù)合聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，所述多個(gè)核苷酸包括至少一種在糖3'位置處具有可移除鏈終止部分的核苷酸類似物，其中所述接觸在適用于將來(lái)自多個(gè)核苷酸的互補(bǔ)核苷酸與步驟e)的第二復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個(gè)核苷酸-復(fù)合聚合酶，并且該條件適用于促進(jìn)結(jié)合的互補(bǔ)核苷酸摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中。

94、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：g)檢測(cè)摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：g)檢測(cè)摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸；以及h)識(shí)別摻入到核苷酸-復(fù)合聚合酶的測(cè)序引物中的互補(bǔ)核苷酸的核堿基。

95、本公開內(nèi)容提供了通過(guò)形成至少一種親和力復(fù)合物進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括：a)將第一通用測(cè)序引物、第一測(cè)序聚合酶和第一可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子與權(quán)利要求16的多聯(lián)體分子的第一部分結(jié)合，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第一核苷酸單元結(jié)合第一測(cè)序聚合酶；b)將第二通用測(cè)序引物、第二測(cè)序聚合酶和第一可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子與同一多聯(lián)體分子的第二部分結(jié)合，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第二核苷酸單元結(jié)合第二測(cè)序聚合酶，其中包括同一多價(jià)分子的第一和第二結(jié)合復(fù)合物形成親和力復(fù)合物，其中第一可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子包含附接至多個(gè)核苷酸臂的核心，并且每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元，其中多聯(lián)體分子包含目的序列(110)的兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列以及結(jié)合第一和第二通用測(cè)序引物的通用引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其中接觸在適合抑制第一和第二結(jié)合復(fù)合物中結(jié)合的第一和第二核苷酸單元聚合酶催化摻入的條件下進(jìn)行；c)檢測(cè)同一多聯(lián)體分子上的第一和第二結(jié)合復(fù)合物，以及d)識(shí)別第一結(jié)合復(fù)合物中的第一核苷酸單元，由此確定多聯(lián)體模板分子的第一部分的序列，并識(shí)別第二結(jié)合復(fù)合物中的第二核苷酸單元，由此確定多聯(lián)體模板分子的第二部分的序列。

96、在一些實(shí)施例中，附接至各個(gè)多價(jià)分子的核心的多個(gè)核苷酸臂具有相同類型的核苷酸單元，并且其中該核苷酸單元的類型選自由datp、dgtp、dctp、dttp和dutp組成的組。在一些實(shí)施例中，多個(gè)多價(jià)分子包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的多價(jià)分子的任何組合的混合物，每個(gè)類型具有選自由datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp組成的組。

97、在一些實(shí)施例中，所述多個(gè)核苷酸在3'糖基處包含可移除鏈終止部分，其中該可移除鏈終止部分包含烷基基團(tuán)、烯基基團(tuán)、炔基基團(tuán)、烯丙基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、疊氮基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、o-疊氮基甲基基團(tuán)、胺基團(tuán)、酰胺基團(tuán)、酮基基團(tuán)、異氰酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、硫代基團(tuán)、二硫基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、脲基團(tuán)或甲硅烷基基團(tuán)，并且其中可以使用化學(xué)化合物裂解可移除鏈終止部分，以在糖基上生成可延伸的3'oh部分。

98、在一些實(shí)施例中，所述多個(gè)核苷酸包括選自由datp、dgtp、dctp、dttp和dutp組成的組的一個(gè)類型的核苷酸。在一些實(shí)施例中，多個(gè)核苷酸包括選自由datp、dgtp、dctp、dttp和/或dutp組成的組的兩個(gè)或更多個(gè)類型的核苷酸的任意組合的混合物。

99、在一些實(shí)施例中，支持物包括玻璃或塑料基底。在一些實(shí)施例中，支持物用具有不大于45度的水接觸角的至少一層親水性聚合物涂層鈍化。在一些實(shí)施例中，所述至少一層親水性聚合物涂層包含選自由以下組成的組的分子：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚賴氨酸、聚葡萄糖苷、鏈霉親和素和葡聚糖。