本發(fā)明涉及疫苗，具體涉及一種呼吸道合胞病毒重構(gòu)多肽、由其形成的呼吸道合胞病毒重組抗原、包含其的免疫原性組合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

1、人類呼吸道合胞病毒（rsv）是全球嬰兒和早產(chǎn)兒中下呼吸道感染的主要原因之一。目前，全球?qū)Π踩行У膔sv疫苗的需求日益迫切。

2、rsv融合蛋白（f蛋白）是rsv病毒粒子與宿主細(xì)胞融合的關(guān)鍵介質(zhì)，其在病毒粒子與宿主細(xì)胞融合前的狀態(tài)中表現(xiàn)出極高的免疫原性，被認(rèn)為是rsv疫苗研發(fā)的理想靶標(biāo)。已經(jīng)鑒定出融合前構(gòu)象中穩(wěn)定的rsv?f蛋白產(chǎn)生比融合后構(gòu)象中的rsv?f蛋白觀察到更強(qiáng)的中和免疫應(yīng)答。

3、目前已經(jīng)有大量關(guān)于rsv?f蛋白融合前構(gòu)象穩(wěn)定性的研究，但大部分研究側(cè)重于對(duì)rsv?f蛋白特定位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變或在f蛋白c端引入三聚化域。在過(guò)往研究中，在f蛋白c端引入三聚化域的方法是將f蛋白的跨膜域（tm）用三聚化域進(jìn)行替換。然而，在引入三聚化域后，跨膜域的刪除對(duì)于疫苗保護(hù)力的影響并沒(méi)有得到深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種基于呼吸道合胞病毒（rsv）融合前f蛋白的重構(gòu)多肽、編碼其的多核苷酸、包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、包含該核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體、其中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有上述多核苷酸、核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，由該重構(gòu)多肽形成的穩(wěn)定化多聚體，包含前述任一項(xiàng)的免疫原性組合物，及其在制備用于預(yù)防和/或治療呼吸道合胞病毒感染的疫苗中的用途。

2、具體地，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒（rsv）重構(gòu)多肽，所述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽自n端至c端依次包括彼此之間直接連接或通過(guò)連接子連接的以下結(jié)構(gòu)域：rsv?f蛋白的胞外域、三聚化域和rsv?f蛋白的跨膜域；其中，所述三聚化域插入位點(diǎn)是：rsv?f蛋白前體多肽（f0）的氨基酸第513位的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，所述跨膜域?yàn)閞sv?f蛋白的同源跨膜域或異源跨膜域。

4、對(duì)于上述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽，所述rsv?f蛋白可以為源自任何rsv亞型、任何rsv毒株的f0蛋白，例如，可以為rsv?a2株（uniprot編號(hào)：p03420）、b1株（uniprot編號(hào)：o36634）、18537株（uniprot編號(hào)：p13843）、tx-79233株（uniprot編號(hào)：r9tcy6）等的野生型f蛋白。示例性的f0蛋白序列如seq?id?no：1-4所示。

5、此外，所述rsv?f蛋白還可以為f0蛋白的突變體；所述f蛋白的突變體可以是任意保持f蛋白融合前構(gòu)象的（pref）突變體，例如，其可以是以下文獻(xiàn)中記載的pref突變體：“mclellan,?jason?s.,?et?al.?science?342.6158（（2013））：592-598”，“krarup,anders,?et?al.?nature?communications?6.1（（2015））：8143”，“joyce,?m.?gordon,?etal.?nature?structural?&molecular?biology?23.9（（2016））：811-820”，“che,?ye,?etal.?science?translational?medicine?15.693（（2023））：eade6422”。優(yōu)選地，所述rsv?f蛋白是與相應(yīng)的野生型f蛋白之間具有至少80%的氨基酸序列同一性的f蛋白突變體。

6、在可行的實(shí)施方案中，所述rsv?f蛋白為a型或b型rsv病毒的f蛋白，或與其具有至少80%序列同一性的突變體。

7、在可行的實(shí)施方案中，所述三聚化域選自：

8、噬菌體t4次要纖維蛋白折疊子（t4?foldon）及其變體（例如，其序列如seq?id?no：5所示）、mtq（例如，其序列如seq?id?no：6所示）、七肽理想三鏈卷曲螺旋（例如，其序列如seq?id?no：7所示）、異亮氨酸拉鏈（iz）長(zhǎng)鏈（例如，其序列如seq?id?no：8所示）、iz短鏈（例如，其序列如seq?id?no：9所示）、亮氨酸拉鏈gcn4及其變體（例如，其序列如seq?id?no：10所示）、肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白d三聚化域（例如，其序列如seq?id?no：11所示）、膠原蛋白三聚化域（例如，其序列如seq?id?no：12所示）、軟骨基質(zhì)蛋白-1長(zhǎng)鏈三聚化域（例如，其序列如seq?id?no：13所示）或軟骨基質(zhì)蛋白-1短鏈三聚化域（例如，其序列如seq?id?no：14所示）或其他三聚化域。

9、在可行的實(shí)施方案中，所述rsv?f蛋白的跨膜域?yàn)閒蛋白的同源跨膜域f/tm（例如，其序列如seq?id?no：60、72、73所示），或?yàn)楫愒纯缒び?，如hiv-1病毒gp160蛋白的跨膜域gp160/tm（例如，如seq?id?no：61所示）、流感病毒ha蛋白的跨膜域ha/tm（例如，其序列如seq?id?no：62所示）、新型冠狀病毒s蛋白的跨膜域s/tm（例如，其序列如seq?id?no：63所示），或?yàn)槠渌缒び颉?/p>

10、此外，在可行的實(shí)施方案中，所述跨膜域的c端還包含其來(lái)源蛋白的胞內(nèi)域。例如，當(dāng)所述跨膜域?yàn)閞sv?f蛋白的同源跨膜域時(shí)，該同源跨膜域的c端還包含所述rsv?f蛋白的胞內(nèi)域；當(dāng)所述跨膜域?yàn)楫愒纯缒び驎r(shí)，該異源跨膜域的c端還包含其所來(lái)源的異源蛋白的胞內(nèi)域。

11、此外，在可行的實(shí)施方案中，所述連接子具有如seq?id?no：64或seq?id?no：65所示的氨基酸序列。

12、在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽具有選自以下的氨基酸序列：

13、seq?id?no：24、27、30、33、35、37、38、39、40、74。

14、在可行的實(shí)施方案中，所述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽還包含信號(hào)肽，所述信號(hào)肽可以為同源信號(hào)肽，也可以為異源信號(hào)肽；可選地，所述異源信號(hào)肽為ev?prem信號(hào)肽、vsv-g信號(hào)肽、ige重鏈信號(hào)肽、igk輕鏈信號(hào)肽、secrecon信號(hào)肽、cd33信號(hào)肽或組織型纖溶酶原激活劑tpa信號(hào)肽。

15、作為優(yōu)選，所述同源信號(hào)肽具有如seq?id?no：66或67所示的氨基酸序列；

16、作為優(yōu)選，所述異源信號(hào)肽具有如seq?id?no：15-21之一所示的氨基酸序列；

17、作為優(yōu)選，所述信號(hào)肽位于n端。

18、第二方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，其編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽。

19、在具體實(shí)施方案中，所述多核苷酸可以為dna或mrna；優(yōu)選地，所述多核苷酸為經(jīng)人源密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。

20、第三方面，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及與所述多核苷酸可操作地連接的至少一個(gè)表達(dá)調(diào)控元件。

21、在一些實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包括如seq?id?no：43、46、49、52、54、56、57、58、59、75之一所示的dna序列或者與這些序列相對(duì)應(yīng)的rna序列，或由其組成。

22、第四方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體。

23、第五方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體或如上述第四方面所述的表達(dá)載體；

24、可選地，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞；

25、進(jìn)一步可選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293t細(xì)胞，293f細(xì)胞，或cho細(xì)胞；

26、進(jìn)一步可選地，所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。

27、第六方面，本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒（rsv）重組抗原，所述rsv重組抗原包含如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的多聚體，優(yōu)選為三聚體。

28、第七方面，本發(fā)明提供了如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第四方面所述的表達(dá)載體、如上述第五方面所述的宿主細(xì)胞或者如上述第六方面所述的rsv重組抗原在制備用于預(yù)防和/或治療呼吸道合胞病毒感染的疫苗中的應(yīng)用。

29、在可行的實(shí)施方案中，所述疫苗中，如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第四方面所述的表達(dá)載體、如上述第五方面所述的宿主細(xì)胞或者如上述第六方面所述的rsv重組抗原為唯一抗原成分。

30、在其他可行的實(shí)施方案中，除了如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第四方面所述的表達(dá)載體、如上述第五方面所述的宿主細(xì)胞或者如上述第六方面所述的rsv重組抗原以外，所述疫苗還包含其他抗原成分。

31、第八方面，本發(fā)明提供了一種疫苗或免疫原性組合物，其包含如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第四方面所述的表達(dá)載體、如上述第五方面所述的宿主細(xì)胞或者如上述第六方面所述的rsv重組抗原，以及生理學(xué)可接受的媒介物、佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑。

32、在一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為呼吸道合胞病毒重組蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽或如上述第六方面所述的rsv重組抗原，和佐劑；

33、可選地，所述佐劑為選自以下佐劑中的一種或多種：鋁佐劑、mf59佐劑、as01佐劑、matrix?m2佐劑、gla-se佐劑。

34、在另一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為呼吸道合胞病毒dna疫苗，其包括：

35、（i）真核表達(dá)載體，其中包含編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的dna序列；和

36、（ii）dna疫苗佐劑；

37、可選地，所述編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的dna序列為如seqid?no：43、46、49、52、54、56、57、58、59、75之一所示的dna序列；

38、可選地，所述真核表達(dá)載體選自pgx0001、pvax1、pcaggs和pcdna系列載體；

39、可選地，所述dna疫苗佐劑選自：人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落刺激因子、人白細(xì)胞介素-12和/或cpg寡核苷酸。

40、在另一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為呼吸道合胞病毒mrna疫苗，所述mrna疫苗包括：

41、（i）編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的mrna序列；

42、（ii）mrna疫苗佐劑；和

43、（iii）遞送載體，所述遞送載體選自脂質(zhì)納米顆粒、陽(yáng)離子納米乳、多肽、聚合物、陽(yáng)離子多肽聚合物、陽(yáng)離子多肽脂質(zhì)納米顆粒中的一種或一種以上的組合。

44、可選地，所述編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的mrna序列為與如seq?id?no：43、46、49、52、54、56、57、58、59、75之一所示的dna序列對(duì)應(yīng)的mrna序列；

45、可選地，所述mrna疫苗佐劑選自：脂質(zhì)納米顆粒、乳劑、toll樣受體激動(dòng)劑和/或cpg寡核苷酸。

46、在另一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為呼吸道合胞病毒-病毒載體疫苗，其包括：

47、（1）病毒骨架載體；和

48、（2）構(gòu)建入所述病毒骨架載體中的、編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的dna序列；

49、可選地，所述編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽dna序列為如seq?idno：43、46、49、52、54、56、57、58、59、75之一所示的dna序列；

50、可選地，所述病毒骨架載體選自以下病毒載體中的一種或幾種：腺病毒載體、痘病毒載體、流感病毒載體、腺相關(guān)病毒載體。

51、在另一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物為呼吸道合胞病毒納米顆粒疫苗，其包括如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽和納米顆粒載體。

52、可選地，所述納米顆粒載體為鐵蛋白，如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽與鐵蛋白共價(jià)連接并自組裝成納米顆粒，使得所述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽呈現(xiàn)于納米顆粒的表面。

53、在可行的實(shí)現(xiàn)方式中，所述疫苗或免疫原性組合物為鼻噴劑、口服制劑或胃腸外制劑的形式；

54、優(yōu)選地，所述鼻噴劑選自氣霧劑、噴霧劑和粉霧劑；

55、優(yōu)選地，所述口服制劑選自片劑、粉末劑、丸劑、散劑、顆粒劑、軟/硬膠囊劑、薄膜包衣劑和膏劑；

56、優(yōu)選地，所述胃腸外制劑為經(jīng)皮劑、軟膏劑、硬膏劑、外用液劑、可注射或可推注制劑。

57、第九方面，本發(fā)明提供了一種如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

58、在編碼如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的、經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列的5’端加上編碼信號(hào)肽的核苷酸序列以及3’端加上編碼組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列和終止密碼子，進(jìn)行克隆表達(dá)，篩選正確的重組子，然后將其轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，從中分離獲得所述rsv?f蛋白重構(gòu)多肽。

59、上述方法的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞；可選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293t細(xì)胞，293f細(xì)胞，或cho細(xì)胞；可選地，所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。

60、第十方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防和/或治療呼吸道合胞病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受試者施用預(yù)防和/或治療有效量的以下物質(zhì)：如上述第一方面所述的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸構(gòu)建體、如上述第四方面所述的表達(dá)載體、如上述第五方面所述的宿主細(xì)胞、如上述第六方面所述的rsv重組抗原和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性組合物。

61、所述“預(yù)防和/或治療有效量”可根據(jù)給藥對(duì)象、對(duì)象臟器、癥狀、給藥方法等不同而存在差異，可以考慮劑型的種類、給藥方法、受試者的年齡和體重、受試者的癥狀等，根據(jù)獸醫(yī)的判斷來(lái)確定。

62、有益效果

63、本發(fā)明通過(guò)在rsv融合前f蛋白的特定位點(diǎn)引入三聚化域，并在三聚化域的c端連接rsv?f蛋白的同源跨膜域或異源跨膜域，設(shè)計(jì)出了本發(fā)明的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽；實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽的融合前構(gòu)象更為穩(wěn)定，并且其所形成的三聚化蛋白穩(wěn)定性也得以增強(qiáng)，從而導(dǎo)致了更強(qiáng)的免疫原性和更高的免疫應(yīng)答效果。本發(fā)明的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽具有很好的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體滴度，對(duì)于呼吸道合胞病毒的臨床治療和防控具有重大的意義。

64、此外，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了不同三聚化域與不同來(lái)源的跨膜域的組合均可誘導(dǎo)較高水平的中和抗體滴度，這說(shuō)明，上述設(shè)計(jì)方式不依賴于特定的rsv亞型或特定的f蛋白或其突變體，其在多種不同突變體中均能實(shí)現(xiàn)較高的中和抗體滴度水平。簡(jiǎn)言之，本發(fā)明的rsv?f蛋白重構(gòu)多肽具有廣譜有效性。