本發(fā)明涉及nkt細胞的體外擴增培養(yǎng)，特別涉及一種nkt細胞的體外高效擴增培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、nkt細胞是一類特殊的免疫細胞，能夠識別并結(jié)合特定的糖脂類抗原，進而激活下游的免疫反應(yīng)。nkt細胞在免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用。在生物技術(shù)領(lǐng)域中，免疫細胞的治療應(yīng)用日益廣泛，特別是在癌癥治療、感染性疾病防治等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。nkt細胞，作為一種獨特的免疫細胞亞群，具有獨特的抗原識別機制和強大的免疫調(diào)節(jié)能力，成為近年來免疫細胞治療研究的熱點之一。由于nkt細胞在體內(nèi)的數(shù)量有限，且其分化和擴增受到多種因素的限制，如細胞因子、抗原刺激等，使得nkt細胞的體外擴增培養(yǎng)成為了一個技術(shù)難題。

2、目前，nkt細胞的體外擴增培養(yǎng)主要依賴于細胞因子和抗原刺激等方法。然而，這些方法存在諸多限制：首先，細胞因子和抗原刺激的濃度和比例難以精確控制，容易導(dǎo)致nkt細胞的分化方向偏離預(yù)期；其次，現(xiàn)有的體外擴增培養(yǎng)方法往往需要在特定的培養(yǎng)條件下進行，如特定的溫度、濕度、ph值等，這些條件難以在普通實驗室中完全實現(xiàn)；最后，現(xiàn)有的體外擴增培養(yǎng)方法往往存在細胞污染的風(fēng)險，影響nkt細胞的純度和活性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種nkt細胞的體外高效擴增培養(yǎng)方法，其目的是解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種nkt細胞的體外高效擴增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

4、s1：包被和細胞活化瓶處理；

5、s2：細胞分離培養(yǎng)擴增；

6、s3：細胞收集。

7、進一步的，所述包被和細胞活化瓶處理包括以下步驟：

8、s11：第0天：

9、用移液管取cd16抗體（濃度5-50ng/ml）加入到t75培養(yǎng)瓶中擰緊瓶蓋，緩慢顛倒，使液體充分在底部分散；

10、s12：用封口膜封閉裝入袋子中封口，然后放入4℃冰箱過夜；

11、s13：放入冰箱時輕輕晃動，確保包被液均勻鋪在培養(yǎng)瓶底部。

12、進一步的，所述細胞分離培養(yǎng)擴增包括以下步驟：

13、s21：第1天：

14、s211、抽取50ml全血，放入定制無菌肝素鈉采血管中，顛倒數(shù)次混勻；

15、s212、室溫下，對全血進行離心處理15分鐘，1800rpm/（757g），升9降7；離心結(jié)束后，用移液管將上層血漿轉(zhuǎn)入離心管；血漿放入水浴鍋，56度滅活半小時；

16、s213、將滅活后的血漿置于4度冰箱半小時，降低血小板對細胞活化的影響；從冰箱取出血漿，離心5分鐘3000轉(zhuǎn)/min（1057g）取上清備用；

17、s214、將離心后的血細胞沉淀，用等體積的生理鹽水重懸混勻；將混勻的血細胞緩慢地加到10ml/管的淋巴細胞分離液上；將離心管對稱放心離心機中，室溫離心處理20分鐘，2000rpm/min（939g），升9降0；

18、s215、離心結(jié)束后吸取中層pbmc層（白膜層），吸盡兩液面交界處的細胞層；將白膜層放入新的離心管中，用生理鹽水重懸混勻定容至50ml，離心2000轉(zhuǎn)，5min，棄上清；蓋好離心管蓋子，用力在掌心拍打以將細胞充分重懸，重復(fù)洗一次，棄上清；

19、s216、在1l的gibco培養(yǎng)液中加入含慶大霉素（1x）溶液，混勻配成完全培養(yǎng)液；

20、s217、用巴氏移液管向離心管內(nèi)加入3ml的gibco完全培養(yǎng)液、3ml血漿以及il-2（100u/ml）il-15（濃度5-50ng/ml）,inf-y（濃度5-50ng/ml），重懸細胞；

21、s218、用移液管吸取23ml的gibco完全培養(yǎng)液加入淋巴細胞離心管中，混勻，轉(zhuǎn)移至75ml培養(yǎng)瓶中；

22、s219、后續(xù)每次轉(zhuǎn)細胞前，用力拍打培養(yǎng)瓶使細胞充分分散；

23、s22：第3天，向75ml培養(yǎng)瓶中補加gibco完全培養(yǎng)液30ml至60ml；

24、s23：第5天，將細胞轉(zhuǎn)移至一個t175培養(yǎng)瓶中，補加20ml血漿以及gibco完全培養(yǎng)液至200ml；

25、s24：第7天：

26、s241、將細胞平分至2個t175培養(yǎng)瓶中，新瓶子中略微多加一些體積；

27、s242、每個培養(yǎng)瓶中再補加100mlgibco完全養(yǎng)液至終體約200ml，總體積為400ml；

28、s243、取培養(yǎng)瓶中的細胞懸液6ml，進行質(zhì)量檢測；

29、s25：第9天：

30、s251、將2瓶細胞平分至4個t175培養(yǎng)瓶中，補加完全培養(yǎng)基至體積200ml每瓶，總體積800ml；

31、s252、用5ml注射器從取樣口吸取樣本進行無菌檢測；

32、s26：第11天：

33、s261、將1支溶液b加入至1l細胞培養(yǎng)液中，混勻配成完全培養(yǎng)液；

34、s262、將4瓶細胞分別裝至2個2l的培養(yǎng)袋中，補加完全培養(yǎng)基至體積900ml/袋；

35、s27：第13天，向細胞培養(yǎng)袋中分別補加完全培液400ml至1300ml，總體積為2600ml。

36、進一步的，所述細胞收集包括以下步驟：

37、s31、將2個培養(yǎng)袋的細胞全部收集至2個500ml離心瓶中，需離心3次收集細胞沉淀，2000rpm離心7分鐘，每次棄上清時要小心不要將細胞沉淀倒出；每次離心后用力拍打瓶底將細胞重懸；

38、s32、向其中一個離心瓶加入少量生理鹽水將細胞轉(zhuǎn)移至另一個離心瓶中合并細胞，再補加生理鹽水至500ml，顛倒混勻，吸取少量細胞用于計數(shù)。2000rpm，離心7分鐘，棄上清；

39、s33、用力拍打瓶底將細胞重懸，再加入500ml生理鹽水重懸細胞，2000rpm，離心7分鐘，棄上清，用力拍打瓶底將細胞重懸；

40、s34、取出1袋250ml生理鹽水備用，用20ml注射器吸取10-20ml生理鹽水和nkt4溶液加入培養(yǎng)瓶中，再將細胞懸液一起吸出打到200ml血袋中，用封口機封口。

41、本發(fā)明的有益效果為：

42、1、高效擴增：通過精確的細胞活化瓶處理和優(yōu)化的細胞分離培養(yǎng)擴增步驟，本方法能夠顯著提高nkt細胞的擴增效率；從初始的細胞分離到最終的細胞收集，確保nkt細胞在體外環(huán)境下能夠獲得最佳的生長和擴增條件。

43、2、高純度：本發(fā)明中的細胞分離培養(yǎng)擴增步驟采用了先進的淋巴細胞分離技術(shù)，有效去除了紅細胞、血小板等雜質(zhì)，保證了nkt細胞的高純度；高純度的nkt細胞不僅能夠減少臨床應(yīng)用中可能產(chǎn)生的副作用，還能夠提高治療效果。

44、3、高活性：在培養(yǎng)過程中，本發(fā)明特別注重了對細胞活性的保護；通過合理的細胞因子配比、溫度控制、離心參數(shù)設(shè)置等措施，最大限度地保留了nkt細胞的活性；高活性的nkt細胞能夠更好地發(fā)揮其在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面的作用。

45、4、操作簡便：本發(fā)明的nkt細胞體外擴增培養(yǎng)方法步驟清晰、操作簡便，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)支持，便于在普通實驗室中推廣應(yīng)用；此外，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和步驟，本方法還降低了操作難度和成本，提高了實驗的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

46、5、降低污染風(fēng)險：在細胞培養(yǎng)過程中，污染是一個不容忽視的問題；本發(fā)明采用了嚴格的無菌操作技術(shù)和質(zhì)量控制措施，有效降低了細胞污染的風(fēng)險。同時，通過定期的質(zhì)量檢測和無菌檢測，確保了nkt細胞的純度和活性不受影響。