本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近年來規(guī)?；s化豬場在我國迅速興起,我國生豬存欄量和豬肉生產(chǎn)總量穩(wěn)居世界首位，傳統(tǒng)的豬病防治方法已遠不能適應(yīng)大規(guī)模集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中傳染病的控制。我國近20年來新出現(xiàn)了近20種畜禽傳染病，加上原有的動物疫病，對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年因各種病毒性疾病引起畜禽死亡率高達15％-20％，經(jīng)濟損失達數(shù)十億元。目前對豬病毒性疾病的預(yù)防和治療途徑主要是通過疫苗接種和使用抗生素，但由于養(yǎng)殖環(huán)境不完善，病毒變異以及機體抵抗力變化等原因，使傳統(tǒng)的預(yù)防和治療途徑受到了巨大挑戰(zhàn)，大部分抗生素類藥物以及傳統(tǒng)的口服抗病毒藥物，由于藥物殘留問題，給人了健康帶來負面影響；而傳統(tǒng)的疫苗，由于它的高特異性以及副作用，無法抵抗病毒變異和新型病毒不斷出現(xiàn)給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大危害。ifn是一類病毒感染誘導(dǎo)機體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年issacs和lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒rna來抑制病毒的生長繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。現(xiàn)已知，α型ifn在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒等感染細胞，通過抑制受染細胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用。但對正常宿主細胞無作用或作用微弱。ifn-α主要生物學(xué)活性為具有抑制病毒復(fù)制、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性。γ型ifn是由激活的t細胞和nk細胞產(chǎn)生，具有較強抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所以ifn-γ又稱為免疫調(diào)節(jié)干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導(dǎo)細胞對病毒感染的反應(yīng)，但干擾素γ的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和確定機體長期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應(yīng)用價值。細胞因子il-2即白細胞介素-2，又名t細胞生長因子。主要由活化的t淋巴細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細胞因子，既可以促進淋巴細胞增殖，增強免疫功能，又能限制t細胞反應(yīng)而增強機體的免疫耐受，故可用于治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在獸醫(yī)中，由于il-2能提高疫苗的免疫應(yīng)答和減少疾病的發(fā)生，也出現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。il-2因能增強機體的免疫水平，提高機體的抗病能力，因而用于細菌性、病毒性和寄生蟲性疾病的免疫治療。此外，il-2還可影響藥物的代謝，使藥物的代謝時間延長，作用時間增加，從而提高藥物療效。天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應(yīng)的時間成本及經(jīng)濟成本隨之增加，而機體的耐受極限也有可能被突破導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導(dǎo)致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于臨床上應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法，并由此融合蛋白與凍干保護劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥制備得到一種重組豬長效干擾素，所述重組豬長效干擾素可顯著提高豬干擾素的半衰期，較普通豬干擾素的半衰期提高19倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高豬自身的免疫應(yīng)答。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如sequencelisting400〈1〉所示。本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示，記為基因組1；或如sequencelisting400〈3〉所示，記為基因組2。所述基因組1和所述基因組2均可編碼所述融合蛋白?；蚪M2是對基因組1的核苷酸序列進行優(yōu)化之后的結(jié)果，通常密碼子適應(yīng)指數(shù)cai＝1.0時被認為該基因在該表達系統(tǒng)中為最優(yōu)的高效表達狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達水平越低。基因中g(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)豬白細胞介素2、豬ifn-γ、豬ifn-α原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.23、0.24、0.22，gc百分比為38.7％、39.2％、59.1％；而通過對豬白細胞介素2、豬ifn-γ、豬ifn-α基因優(yōu)化后得到各基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)為0.97、1.0、1.0，gc百分比47.6％、45.4％、55.6％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的表達載體。進一步地，所述表達載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達載體。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的基因工程菌。進一步地，所述基因工程菌為pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα。含有基因組1或基因組2的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍，進一步地，所述宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞，更進一步地，所述大腸桿菌宿主細胞為bl21(de3)感受態(tài)細胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。本發(fā)明還提供了一種重組豬長效干擾素，所述重組豬長效干擾素由所述的融合蛋白與凍干保護劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。本發(fā)明還公開了所述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將含有基因組1或基因組2的表達載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細胞中，獲得基因工程菌，基因工程菌經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達后得到所述融合蛋白的粗品，經(jīng)純化后即可得到融合蛋白。所述表達載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達載體；所述基因工程菌為pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα，其制備方法為：(1)設(shè)計引物，通過反轉(zhuǎn)錄得到或人工合成帶有柔性linker序列的豬白細胞介素2、豬干擾素γ、豬干擾素α的目的基因；通過柔性linker將豬白細胞介素2、豬干擾素γ、豬干擾素α的目的基因連接起來，連接后的目的基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示或如sequencelisting400〈3〉所示；(2)將連接后的目的基因連接到pet-32a質(zhì)粒上獲得表達載體；(3)將表達載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細胞中，即可得到基因工程菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα。所述大腸桿菌宿主細胞為bl21(de3)感受態(tài)細胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。所述純化的方法為：融合蛋白的粗品先后經(jīng)親和層析、陰離子交換層析和分子篩層析純化。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號為v205。所述基因組1的獲取方法為：a.引物設(shè)計豬白細胞介素2(il-2)的引物序列為：上游il-2-f1：catgccatggatgtataagatgcagct，帶有ncoi酶切位點；下游il-2-r1：accaccaccagaaccaccaccaccagtcagtgttgagtag，帶有柔性linker；豬干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatgagttatacaactt，帶有柔性linker；下游ifn-γ-r1：accaccaccagaaccaccaccaccttttgatgctctctg，帶有柔性linker；豬干擾素α(ifn-α)的引物序列為：上游ifn-α-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatgtgttcctattta，帶有柔性linker；下游ifn-α-r1：ccctcgagctccttcctcctgag，帶有xhoi酶切位點；b.從豬肝臟中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉所示和sequencelisting400〈6〉所示；分別以豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因為模板，并分別利用豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的上下游引物進行pcr擴增，分別得到連接有柔性linker的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，模板rna1.5μl，上下游引物各0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)；95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker連接豬il-2和豬ifn-γ目的基因得到ril2-ifnγ基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的il-2基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker連接ril2-ifnγ基因和豬ifn-α目的基因得到ril2-ifnγ-ifnα基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，ril2-ifnγ基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min?；蚪M2是對基因組1進行優(yōu)化之后，人工合成的基因，所述基因組2的獲取方法為：a.引物設(shè)計豬白細胞介素2(il-2)的引物序列為：上游il-2-f2：catgccatggatgtacaaaatgcagc，帶有ncoi酶切位點；下游il-2-r2：accaccaccagaaccaccaccaccggtcagggtagagtag，帶有柔性linker；豬干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatgtcttacaccacct，帶有柔性linker；下游ifn-γ-r2：accaccaccagaaccaccaccacctttagaagcacgctg，帶有柔性linker；豬干擾素α(ifn-α)：上游ifn-α-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatgtgctcttacctg，帶有柔性linker；下游ifn-α-r2：ccctcgagttctttacgacgcag，帶有xhoi酶切位點。b.所述豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示；分別以豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因為模板，并分別利用豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的上下游引物進行pcr擴增，分別得到連接有柔性linker的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，基因組dna1.0μl，上下游引物各0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)；95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker連接豬il-2和豬ifn-γ目的基因得到ril2-ifnγ基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的il-2基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker連接ril2-ifnγ基因和豬ifn-α目的基因得到ril2-ifnγ-ifnα基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，ril2-ifnγ基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，il-2上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明還提供了所述重組豬長效干擾素的應(yīng)用，其半衰期長達76小時以上，具有廣譜抗病毒作用并能提高豬自身的免疫應(yīng)答。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.通過柔性linker將豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因?qū)崿F(xiàn)融合表達，提高了干擾素半衰期，與普通干擾素相比，提高了19倍以上；2.通過對豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因進行優(yōu)化，提高了豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α融合蛋白的表達量。3.以重組大腸桿菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα作為表達菌株，通過引入分子伴侶pgro7質(zhì)粒，在蛋白表達時產(chǎn)生包涵體較少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵體變性和復(fù)性的過程，大大縮短了融合蛋白表達的時間；4.本發(fā)明公開的由豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α組成的融合蛋白不僅具有ifn-α的廣譜抗病毒作用，同時顯著提高了豬自身的免疫應(yīng)答。附圖說明圖1為實施例1中的豬白細胞介素2基因、豬干擾素α基因與豬干擾素γ基因rt-pcr擴增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：豬白介素2基因rt-pcr擴增產(chǎn)物；泳道2：豬干擾素γ基因rt-pcr擴增產(chǎn)物；泳道3：豬干擾素α基因rt-pcr擴增產(chǎn)物；圖2為實施例1中的豬il-2、ifn-γ和ifn-α的目的基因連接之后的pcr擴增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：豬白介素2基因、豬干擾素γ基因與豬干擾素α基因連接擴增產(chǎn)物；圖3為實施例1中的陽性克隆質(zhì)粒的pcr擴增及雙酶切鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl10000；泳道1：質(zhì)粒pcr結(jié)果；泳道2：重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；圖4為實施例1中的重組蛋白的sds-page電泳檢查結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：空載對照；泳道2：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后沉淀；泳道3：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后上清；圖5為實施例1得到的融合蛋白的westernblot鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：重組菌誘導(dǎo)破碎后沉淀；泳道2：為重組菌誘導(dǎo)破碎后上清；圖6為實施例5中由實施例1中的融合蛋白制得的重組豬長效干擾素α對vsv致細胞病變的抑制作用；1為vsv病毒對照孔；2為hep-2細胞對照孔；a3-12為梯度稀釋(從右向左)的人干擾素標準品處理孔；b3-12為梯度稀釋(從右向左)的重組豬長效干擾素α處理孔；圖7為實施例8中由實施例1中的融合蛋白制得的重組豬長效干擾素α肌肉注射血藥濃度-時間變化曲線。具體實施方式實施例1一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.豬白細胞介素2(il-2)、豬干擾素γ(ifn-γ)與豬干擾素α(ifn-α)目的基因的獲取與擴增引物設(shè)計：根據(jù)genebank中已報道的目的基因序列設(shè)計合成引物見表1，在豬白細胞介素2的上游引物和下游引物中分別引入ncoi酶切位點和linker序列，在豬干擾素γ的上游引物和下游引物中分別引入linker序列，在豬干擾素α的上游引物和下游引物中分別引入linker序列和xhoi酶切位點。表1pcr擴增引物rt-pcr獲取目的基因：從豬肝臟組織中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉和sequencelisting400〈6〉所示；rt-pcr反應(yīng)體系(25μl)見表2表2rt-pcr反應(yīng)體系rnasefree水10μldntpmix10μl反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組rna1.5μl反應(yīng)參數(shù)為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：95℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。rt-pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在490bp、560bp和710bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖1所示，說明分別制備得到了分別連接有柔性linker序列的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接各段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表3、表4所示：表3ril2-ifnγpcr反應(yīng)體系表4ril2-ifnγ-ifnαpcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1700bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖2所示，圖2中出現(xiàn)了ril2-ifnγ和ifn-α擴增產(chǎn)物條帶，這是因為在ril2-ifnγ和ifn-α基因連接的過程中，出現(xiàn)了非特異反應(yīng)。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈2〉所示。3.表達載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序無誤后，pcr膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用ncoi和xhoi限制性內(nèi)切酶進行雙酶切和回收，按表5中的20μl體系做雙酶切：表5雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表6中的體系進行連接，4℃過夜連接：表6酶連體系目的片段dna10μl表達載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，將感受態(tài)細胞涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板過夜培養(yǎng)；挑取lb平板上的單菌落進行目的基因pcr鑒定，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)ncoi和xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示工程菌構(gòu)建成功，pcr擴增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1700bp左右處檢測出單一條帶，其結(jié)果如圖3所示，說明成功得到了pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα工程菌。4.重組蛋白的表達挑取工程菌于含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖床復(fù)蘇1h，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h(od＝1.0)，加入終濃度為100μg/ml的iptg，32℃誘導(dǎo)表達5h；收集菌體，經(jīng)sds-page電泳檢測，其結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在80.6kd左右處可見優(yōu)勢表達條帶，說明在沉淀和上清中均成功表達了融合蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.4樣品鑒定測定ril2-ifnγ-ifnα效價及比活性，比活性≥107iu/mg，蛋白合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例2一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白，其他同實施例1，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實施例1對照，上清液中80.6kd左右處優(yōu)勢表達條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達蛋白正確折疊，達到蛋白可溶性表達。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例3一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.豬白細胞介素2(il-2)、豬干擾素γ(ifn-γ)與豬干擾素α(ifn-α)目的基因的獲取與擴增對實施例1中的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α進行優(yōu)化，人工合成豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α目的基因，優(yōu)化后，三者的核苷酸序列分別如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示。1.1密碼子優(yōu)化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實際上，常用做蛋白表達或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達效率。因此，在異源表達系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用稀有的密碼子進行基因合成，這種基因的重新設(shè)計叫密碼子優(yōu)化。因此，本實施例中對豬的il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因密碼子進行優(yōu)化。1.2密碼子優(yōu)化后結(jié)果分析通常密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)＝1.0時被認為該基因在該表達系統(tǒng)中的最優(yōu)的高效表達狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達水平越低。基因中g(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.23、0.24、0.22，gc百分比為38.7％、39.2％、59.1％；而通過對豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.97、1.0、1.0，gc百分比47.6％、45.4％、55.6％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。1.3引物設(shè)計：表7pcr擴增引物將優(yōu)化后的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的基因組dna分別稀釋至0.05mg/ml。利用pcr擴增獲得目的基因，25μl反應(yīng)體系如表8所示：表8pcr反應(yīng)體系rnasefree水10.5μldntpmix10.0μltaqdna聚合酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組dna1.0μl反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：95℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。豬il-2、豬ifn-γ與豬ifn-α的pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分別在490bp、560bp和710bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明制備得到了優(yōu)化后的分別連接有柔性linker的豬il-2、豬ifn-γ和豬ifn-α的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接各段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表9、表10所示：表9ril2-ifnγpcr反應(yīng)體系表10ril2-ifnγ-ifn-αpcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1700bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明成功得到了連接后的ril2-ifnγ-ifn-α基因。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。3.表達載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序后無誤的pcr的膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用ncoi、xhoi限制性內(nèi)切酶進行雙酶切和回收，按表11中的20μl體系做雙酶切：表11雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表12中的體系進行連接，4℃過夜連接：表12目的片段dna10μl表達載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb平板中過夜培養(yǎng)；取lb平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)ncoi、xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達載體構(gòu)建成功，pcr擴增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1700bp左右處出現(xiàn)單一條帶，說明含有ril2-ifnγ-ifnα融合基因工程菌pet-32a/ril2-ifnγ-ifnα構(gòu)建成功。4.重組蛋白的表達挑取工程菌于含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖床復(fù)蘇1h，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h(od＝1.0)，加入終濃度為100μg/ml的iptg，32℃誘導(dǎo)表達5h；收集菌體，經(jīng)sds-page電泳檢測，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在80.6kd左右處可見優(yōu)勢表達條帶，說明在上清和沉淀中均得到了重組蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集ril2-ifnγ-ifnα蛋白峰。5.4樣品鑒定測定ril2-ifnγ-ifnα效價及比活性，比活性≥107iu/mg，蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例4一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白，其他同實施例3，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實施例3對照，上清液中80.6kd左右處優(yōu)勢表達條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達蛋白正確折疊，達到蛋白可溶性表達。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例5一種重組豬長效干擾素α，由實施例1、2、3、4中的融合蛋白分別與凍干保護劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。實施例6實施例1～4得到由豬白細胞介素2、豬干擾素γ與豬干擾素α組成的融合蛋白的鑒定6.1蛋白含量的定量檢測用lowry法，以中國食品藥品生物制品檢定院的標準蛋白作標準測定，測定實施例1～4得到的融合蛋白濃度均大于1.1mg/ml。6.2sds-page電泳檢測與空菌相比，融合蛋白在80.6kd左右有一條濃染的新增蛋白條帶，如圖4所示。6.3westernblot結(jié)果分別檢測實施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗豬α干擾素(1:5000稀釋)為一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp為二抗(1:10000稀釋)。重組豬長效干擾素樣品能與抗豬干擾素α單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，80.6kd左右處出現(xiàn)特異性條帶，如圖5所示。實施例7實施例5中的四份重組豬長效干擾素α凍干劑的效價檢測按照微量細胞病變抑制法，用培養(yǎng)基將hep-2細胞配成5×105細胞/ml細胞懸浮液，每孔接種0.1ml移入96孔細胞培養(yǎng)板。37℃、5％co2培養(yǎng)24h，加入不同劑量的重組豬長效干擾素α，24h后吸棄，再分別接種100tcid50vsv病毒。試驗結(jié)果結(jié)果表明獲得的重組豬長效干擾素α對vsv引起hep-2細胞的病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細胞接種病毒后均出現(xiàn)細胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組豬長效干擾素α處理后的細胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察，細胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變，測得效價≥107iu/ml，如圖6所示。實施例8實施例5中的分別由實施例1～4的融合蛋白得到的四份重組豬長效干擾素α凍干劑(分別記為a、b、c、d)在豬體內(nèi)的半衰期的測定細胞病變抑制法測定ril2-ifnγ-ifnα的血藥濃度與時間關(guān)系取六只體重大致相同的豬(雌雄各半)，頸部皮下注射2mg/ml重組豬長效干擾素α凍干劑2ml，分別在1h、2h、4h、8h、16h、36h、72h、96h靜脈采血，血樣4℃凝固，3500rpm低溫離心10min分離血清，各時點每只豬血樣于-20℃保存待測。采用細胞病變抑制法測定血清樣品中ril2-ifnγ-ifnα的濃度，用das藥動學(xué)軟件進行曲線擬合并計算參數(shù)。參數(shù)計算結(jié)果見表13。表13重組豬長效干擾素α肌肉注射后血清中主要動力學(xué)參數(shù)結(jié)果表明重組豬長效干擾素α有較長的半衰期。經(jīng)測定半衰期能達到76h左右，較普通干擾素提高19倍以上。實施例9實施例5中的四份重組豬長效干擾素α凍干劑對豬細胞免疫應(yīng)答影響的測定取六只體重大致相同的豬分為兩組，記為實驗組和對照組；實驗組頸部皮下注射2mg/ml重組豬長效干擾素α凍干劑2ml，對照組頸部皮下注射2ml的pbs，取注射4周后豬外周血，之后每周取一次血，使用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，淋巴細胞經(jīng)過無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗2次后，用完全培養(yǎng)基重懸、調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入1ml淋巴細胞，37℃，5％co2培養(yǎng)72h，收集淋巴細胞培養(yǎng)時上清。elisa檢測培養(yǎng)上清中il-4含量，按試劑盒說明書進行，檢測結(jié)果如表14所示：表14elisa檢測各組豬細胞免疫應(yīng)答水平結(jié)果表明注射重組豬長效干擾素α后，能夠顯著提高豬外周血中細胞因子il-4的含量，增強了細胞免疫應(yīng)答水平，顯著提高免疫力水平。上述參照實施例對一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司<120>一種由豬白細胞介素2、豬干擾素γ和豬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法<130>1<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>566<212>prt<213>豬il2-ifnγ-ifnα融合蛋白<400>1mettyrlysmetglnleuleucyscysilealaleuthrleualaleu151015metalaasnglyalaprothrserserserthrlysasnthrlyslys202530glnleugluproleuleuleuaspleuglnleuleuleulysgluval354045lysasntyrgluasnalaaspleuserargmetleuthrphelysphe505560tyrmetprolysglnalathrgluleulyshisleuglncysleuval65707580glugluleulysalaleugluglyvalleuasnleuglyglnserlys859095asnseraspseralaasnilelysglusermetasnasnileasnval100105110thrvalleugluleulysglysergluthrserphelyscysglutyr115120125aspaspgluthrvalthralavalglupheleuasnlystrpilethr130135140phecysglnseriletyrserthrleuthrglyglyglyglysergly145150155160glyglyglysermetsertyrthrthrtyrpheleualapheglnleu165170175cysvalthrleucyspheserglysertyrcysglnalaprophephe180185190lysgluilethrileleulysasptyrpheasnalaserthrsergly195200205valproasnglyglyproleupheleugluileleugluasntrplys210215220glugluserasplyslysileileglnserglnilevalserphetyr225230235240phelysphephegluilephelysaspasnglnalaileglnargser245250255metaspvalilelysglnaspmetpheglnargpheleuasnglyser260265270serglylysleuasnasppheglulysleuvallysileprovalasp275280285asnleuglnileglnarglysalailesergluleuilelysvalmet290295300asnaspleuserproargserasnleuarglysarglysargsergln305310315320thrmetpheglnglyglnargalaserlysglyglyglyglysergly325330335glyglyglysermetcyssertyrleuarghisargprogluglyarg340345350serserasnileleugluserargvalthrgluserprothrserala355360365argthralaalaseralaargserprometalaprothrseralaphe370375380leuthralaleuvalleuleusercysasnalailecysserleugly385390395400cysaspleuproglnthrhisserleualahisthrargalaleuarg405410415leuleualaglnmetargargileserprophesercysleuasphis420425430argargasppheglypheproglnglualaleuglyglyasnglnval435440445glnlysalaglnalametalaleuvalhisglumetleuglnglnthr450455460pheglnleupheserthrgluglyseralaalaalatrpaspgluser465470475480leuleuhisglnphecysthrglyleuaspglnglnleuargaspleu485490495glualacysvalmetglnglualaglyleugluglythrproleuleu500505510glugluaspserileleualavalarglystyrphehisargleuthr515520525leutyrleuglnglulyssertyrserprocysalatrpgluileval530535540argalagluvalmetargalapheserserserthrasnleuglnasp545550555560argleuargarglysglu565<210>2<211>1698<212>dna<213>基因組1<400>2atgtataagatgcagctcttgtgttgcattgcactaacccttgcactcatggcaaacggt60gcacctacttcaagctctacaaagaacacaaagaaacaactggagccattgctgctggat120ttacagttgcttttgaaggaagttaagaattacgagaatgctgatctctccaggatgctc180acatttaaattttacatgcccaagcaggctacagaattgaaacaccttcagtgtttagta240gaagaactcaaagctctggagggagtgctaaatttaggtcaaagcaaaaactctgactca300gcaaatatcaaggaatcaatgaacaatatcaacgtaacagttttggaactaaagggatct360gaaacaagtttcaaatgtgaatatgatgatgagacagtaactgctgttgaatttctgaac420aaatggattaccttttgtcaaagcatctactcaacactgactggtggtggtggttctggt480ggtggtggttctatgagttatacaacttatttcttagcttttcagctttgcgtgactttg540tgtttttctggctcttactgccaggcgcccttttttaaagaaataacgatcctaaaggac600tattttaatgcaagtacctcaggtgtacctaatggtggacctcttttcttagaaattttg660gagaattggaaagaggagagtgacaaaaaaataattcagagccaaattgtctccttctac720ttcaaattctttgaaatcttcaaagataaccaggccattcaaaggagcatggatgtgatc780aagcaagacatgtttcagaggttcctaaatggtagctctgggaaactgaatgacttcgaa840aagctggttaaaattccggtagataatctgcagatccagcgcaaagccatcagtgaactc900atcaaagtgatgaatgatctgtcaccaagatctaacctaagaaagcggaagagaagtcag960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