專利名稱：：一種重組豬α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，具體是一種重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。
背景技術(shù)：
：畜牧業(yè)是我國國民經(jīng)濟(jì)重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，養(yǎng)殖方式從傳統(tǒng)的粗放經(jīng)營向高密度、集約化養(yǎng)殖高速發(fā)展。但是伴隨高密度、集約化的養(yǎng)殖高速發(fā)展，病毒性疾病已經(jīng)成為限制畜禽產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的第一大障礙。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年因各種病毒性疾病引起畜禽死亡率高達(dá)15%_20%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。與此同時(shí)，我國加入WTO后，市場對畜禽產(chǎn)品的需求逐漸從數(shù)量型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型，對畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量要求達(dá)到前所未有的程度，因畜禽病害、藥物殘留、以及不符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的畜禽類食品不僅影響我國畜牧業(yè)發(fā)展、產(chǎn)品出口創(chuàng)匯，甚至威脅到人的身體健康。豬病毒性疾病是當(dāng)前嚴(yán)重制約豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。全年均有發(fā)生，如豬病毒性腹瀉、流行性感冒等。這些動物一旦感染發(fā)病，則有起病急，臨床癥狀嚴(yán)重，極易傳播擴(kuò)散，以及病死率和死亡率均較高的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失；更為重要的是，豬與人類密切接觸，某些人畜共患病還給人類健康帶來潛在威脅。干擾素(interferon,IFN)是病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，于1957年Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發(fā)揮抗腫瘤的活性。按照干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機(jī)體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為a、13、Y三類，其中a型干擾素在機(jī)體內(nèi)能發(fā)揮廣譜、高效抗病毒作用機(jī)制是抑制病毒蛋白質(zhì)的合成，并能選擇性地作用于受感染細(xì)胞，而對正常宿主細(xì)胞無作用或作用微弱，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。由于干擾素具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能，而對正常宿主細(xì)胞無影響，因此被認(rèn)為是當(dāng)今應(yīng)用前景最為廣闊的生物制劑之一。為了有效預(yù)防和控制人畜共患病，減少病毒性疾病對養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了可高效表達(dá)具有生物學(xué)活性的重組豬a干擾素(rpoIFN-a)的重組菌。對于生物制品來說，其質(zhì)量評價(jià)的有效性指標(biāo)多采用生物學(xué)方法，如動物法和細(xì)胞法等進(jìn)行檢測。這些方法本身變異性較大，因此標(biāo)準(zhǔn)品是生產(chǎn)中必不可少的組成部分，在生物制品標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制和效力評價(jià)中標(biāo)準(zhǔn)品是藥品質(zhì)量評價(jià)的標(biāo)尺，起著非常重要的作用。然而目前國際國內(nèi)均沒有rpoIFN-a的標(biāo)準(zhǔn)品，這給實(shí)際研究工作帶來很多不便。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，所制備的重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品純度高，對胰蛋白酶極為敏感，對酸穩(wěn)定，可用于重組豬a型干擾素特性鑒別和效價(jià)測定。本發(fā)明的技術(shù)方案為—種重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、重組豬a型干擾素工程菌的發(fā)酵及蛋白提取將重組豬a型干擾素工程菌接種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，保持溫度為35-38t:，培養(yǎng)過夜；重組豬a型干擾素工程菌表達(dá)質(zhì)粒為pET-32(a)，裝入豬a干擾素基因；基因工程宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3);序列是CCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然后將培養(yǎng)得到的陽性克隆菌接種至含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-38t:，時(shí)間為17-20小時(shí)；將搖床振蕩培養(yǎng)得到的菌液接種至LB培養(yǎng)基中再次進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，菌種與LB培養(yǎng)基的體積比為1:80-100，培養(yǎng)溫度為35-38°C，時(shí)間為17-20小時(shí)；將再次進(jìn)行搖床振蕩后得到菌種接種至含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧量為25-35%，溫度為35-38t:，ra值為7-8;對發(fā)酵后的菌種進(jìn)行檢領(lǐng)"當(dāng)0D6。。達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在菌種中加入異丙基-13-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，溫度為30-35°C，時(shí)間為5小時(shí)；將誘導(dǎo)后的菌種進(jìn)行離心、緩沖液重懸、細(xì)胞破碎，再次離心取上清液，即重組豬a型干擾素；(2)、重組豬a型干擾素的純化親和層析純化將重組豬a型干擾素經(jīng)過層析柱上樣、洗雜，梯度洗脫，收集洗脫后的蛋白吸收峰；分子篩層析純化將洗脫后的蛋白吸收峰經(jīng)分子篩層析柱上樣，洗脫，收集洗脫后的蛋白吸收峰，即重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品；所述的重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)、重組豬a型干擾素工程菌的發(fā)酵及蛋白提取將重組豬a型干擾素工程菌種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37t:培養(yǎng)過夜；然后將培養(yǎng)得到的陽性克隆接種至3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C搖床震蕩培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長；將搖床振蕩培養(yǎng)得到的菌液接種至200mlLB培養(yǎng)基中置37。C搖床，轉(zhuǎn)速為220r/min，震蕩培養(yǎng)18h，作為發(fā)酵種子，菌液與LB培養(yǎng)基的體積比為1:100。將再次進(jìn)行搖床振蕩后得到菌種接種至含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)置溫度為37t:、溶氧為30%、轉(zhuǎn)速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養(yǎng)基的體積比為i:ioo;當(dāng)0D6。。達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在菌種中加入異丙基_P_D_硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)溫度至32°C，誘導(dǎo)表達(dá)5h;誘導(dǎo)結(jié)束后收集發(fā)酵液，清洗罐體；將發(fā)酵液fC條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩沖液重懸；然后將重懸后菌液在lOOObar壓力下高壓細(xì)胞破碎、4t:條件下12000r/min離心lOmin，收集上清。(2)、重組豬a型干擾素的純化親和層析純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和層析柱；平衡用3-5個(gè)柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱；上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱；洗雜用2個(gè)柱體積以上的BindingBuffer1溶液過層析柱，該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl，調(diào)節(jié)pH至7.4，洗去未與層析柱結(jié)合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰；洗脫用ElutionBuffer,該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脫，之后繼續(xù)100%梯度洗脫20ml;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱；保存用20%乙醇過層析柱；分子篩層析進(jìn)一步純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和分子篩層析柱；平衡用2-3個(gè)柱體積的BindingBuffer2，該溶液組成為50mMNa2HP04，0.15MNaCl，調(diào)節(jié)pH至7.0，平衡分子篩層析柱；上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱；洗脫用BindingBuffer2洗脫；收集洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗柱子；保存用20%乙醇過柱。重組豬a型干擾素標(biāo)準(zhǔn)品鑒定方案如下1)SDS-PAGE和HPLC鑒定在95%以上；2)N端氨基酸測序使用Edman降解法，在測序之前先用腸激酶將重組干擾素酶切，再電泳并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，立春紅染色后將干擾素部分的蛋白條帶剪下進(jìn)行測序，N-末端氨基酸序列從第十個(gè)氨基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR;3)在H印-2/VSV系統(tǒng)上以北京生物制品所制備的重組人a型干擾素(rhIFN-a)國家標(biāo)準(zhǔn)品對其效價(jià)經(jīng)行標(biāo)定，其效價(jià)為^1.OX1041.OX105IU/ml;4)Lowry法檢測蛋白濃度，其蛋白含量為0.4mg/ml。重組豬a型干擾素標(biāo)準(zhǔn)品其理化特征是豬a干擾素單克隆抗體可中和重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性，證明該重組蛋白確實(shí)為豬a干擾素；對胰蛋白酶極為敏感，但對酸和熱較為穩(wěn)定，在56t:保溫lh，活性仍保留在50%。本發(fā)明制備的制備的重組豬a型干擾素生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為>1.0X104-1.0X105IU/ml;SDS-PAGE純度》95%;HPLC純度為》95%;相對分子量為35KD±5%;N-末端氨基酸序列從第十個(gè)氨基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR;豬a干擾素單克隆抗體可中和重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，證明該重組蛋白確實(shí)為豬a干擾素；對胰蛋白酶極為敏感，但對酸(pH2.0)和56°C30min非常穩(wěn)定，在56。C保溫lh，活性仍保存在50%左右，主要理化性質(zhì)與北京生物制品所研制的重組人干擾素a2b標(biāo)準(zhǔn)品類似?？捎米髦亟M豬a型干擾素效價(jià)測定的參考標(biāo)準(zhǔn)。具體實(shí)施例方式重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法1、重組豬a型干擾素工程菌的發(fā)酵及蛋白提取將重組豬a型干擾素工程菌種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37t:培養(yǎng)CCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然后將培養(yǎng)得到的陽性克隆接種至3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C搖床震蕩培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。LB培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)基因工程受體菌(大腸桿菌)的常用培養(yǎng)基。LB解釋為Luria-Bertani培養(yǎng)基，應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。將搖床振蕩培養(yǎng)得到的菌液接種至200mlLB培養(yǎng)基中置37。C搖床，轉(zhuǎn)速為220r/min，震蕩培養(yǎng)18h，作為發(fā)酵種子，菌液與LB培養(yǎng)基的體積比為1:100。將再次進(jìn)行搖床振蕩后得到菌種接種至含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)置溫度為37t:、溶氧為30%、轉(zhuǎn)速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養(yǎng)基的體積比為i:ioo;當(dāng)0D6。。達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在菌種中加入異丙基_P_D_硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)溫度至32°C，誘導(dǎo)表達(dá)5h;誘導(dǎo)結(jié)束后收集發(fā)酵液，清洗罐體；將發(fā)酵液4t:條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩沖液重懸；然后將重懸后菌液在lOOObar壓力下高壓細(xì)胞破碎、4t:條件下12000r/min離心lOmin，收集上清。2、重組豬a型干擾素的純化(1)、親和層析純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和層析柱，流速為5ml/min;平衡用3-5個(gè)柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱，流速為2ml/min;上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱，流速為lml/min;洗雜用2個(gè)柱體積以上的BindingBuffer1(20mMNa2HP04(3.5814)，0.5MNaCl(14.61)，pH7.4)過層析柱，洗去未與層析柱結(jié)合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰，流速lml/min;洗脫用ElutionBuffer(20mMNa2HP04(3.5814)，0.5MNaCl(14.61)0.5M咪唑(17.02)，pH7.4)梯度洗脫，0%-100%40ml，之后繼續(xù)100%梯度洗脫20ml，流速lml/min;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱，流速為5ml/min;保存用20%乙醇過層析柱，流速為5ml/min;(2)、分子篩層析進(jìn)一步純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;平衡用2-3個(gè)柱體積的BindingBuffer2(50mMNa2HP04(8.908)，0.15MNaCl(4.383)，pH7.0)平衡分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱，流速為0.5ml/min;洗脫用BindingBuffer2以0.5ml/min的流速洗脫；收集洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗柱子，流速0.5ml/min;保存用20%乙醇過柱，流速為0.5ml/min。3、蛋白質(zhì)含量測定對上述純化前后的豬a干擾素樣品用Lowry法檢測蛋白濃度，其蛋白含量為0.4mg/ml。4、SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定對蛋白表達(dá)條件優(yōu)化及工程菌發(fā)酵得到的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定純度及分按照分子克隆試驗(yàn)指南進(jìn)行制備5%的濃縮膠和的12%分離膠；灌膠按照儀器使用說明安裝好垂直板SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳裝置，迅速在兩層玻璃板間灌入分離膠，并在膠面上用少量蒸餾水覆蓋；待分離膠完全聚合后，倒出表面的蒸餾水，以少量IXSDS-PAGE緩沖液(25mmolTris-ClpH8.0，250mmol甘氨酸，O.1%SDS)沖洗表面。以濾紙吸去凝膠表面液體，迅速加入適量濃縮膠并插入梳齒，室溫靜置，待濃縮膠聚合完全后拔出梳齒；上樣以10iU低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)作為電泳分子量指示，取樣品10iU與等體積上樣緩沖液混合(4%SDS，20X甘油，10%P-琉基乙醇，125,1/LTris-HClp朋.8，0.1溴酚藍(lán))，IO(TC煮沸5分鐘，短暫離心后以微量加樣器依次上樣；電泳將適量1XSDS-PAGE緩沖液(25mmolTris-ClpH8.0，250mmol甘氨酸，0.1%SDS)倒入電泳槽，連接好電源。電泳條件為恒壓方式，電壓調(diào)為8V/cm，待樣品進(jìn)入分離膠后，升至15V/cm，當(dāng)指示劑抵達(dá)分離膠底部時(shí)關(guān)閉電源；固定、染色及脫色取下凝膠，以5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(0.25g考馬斯亮藍(lán)溶解于ioomi甲醇/冰醋酸溶液中，甲醇水冰醋酸=45:45:io)浸泡凝膠，室溫下緩慢搖動4小時(shí)?；厥杖旧海悦撋?45%甲醇，10%冰醋酸)浸泡凝膠，緩慢搖動脫色，其間更換脫色液3次，待凝膠背景清晰后，觀察結(jié)果；SDS-PAGE鑒定其純度>95%。5、HPLC純度鑒定純化后的rpoIFN-a做HPLC純度鑒定清洗用雙蒸水洗去純化系統(tǒng)管道中的保存液，再用2-3個(gè)柱體積的雙蒸水清洗分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;平衡用2-3個(gè)柱體積的0.1%TFA水溶液平衡分子篩層析柱，流速為lml/min;上樣將樣品脫鹽處理后上樣50iU;洗脫線性梯度洗脫0-70min070%0.1%TFA乙腈溶液；洗柱用雙蒸水清洗柱子，流速lml/min;保存用20%乙醇過柱，流速為lml/min;結(jié)果經(jīng)HPLC鑒定純化后的rpoIFN-a其純度^95%。6、N-端氨基酸序列測定N-端氨基酸序列測定的作用是確證純化的目的蛋白就是重組豬a型干擾素；酶切取純化后的rpoIFN-a200iig，加4單位重組腸激酶，與酶切緩沖液中4t:條件下酶切16小時(shí)；SDS-PAGE電泳取酶切產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣前先將配置好的聚丙烯酰胺凝膠裝到垂直電泳儀上，用50V恒壓空跑30min;轉(zhuǎn)膜將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，電轉(zhuǎn)緩沖液用CAPS緩沖液；立春紅染色將PVDF(聚偏氟乙烯)膜放到立春紅染液中染色，待看到蛋白條帶后拿出，用水洗去背景顏色；將目的條帶剪下放于E卯endorf管中，-2(TC保存，用Edman降解法進(jìn)行N端氨基酸測序；N-末端氨基酸序列從第十個(gè)氨基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR，確證純化的目的蛋白就是重組豬a型干擾素。7、效價(jià)滴定rhIFN-a標(biāo)準(zhǔn)參考品購自北京中國藥品生物制品研究所，干擾素a國家標(biāo)準(zhǔn)品，批號97/04，下稱標(biāo)化干擾素；細(xì)胞人喉癌傳代細(xì)胞(H印-2)株；病毒攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV);方法采用微量細(xì)胞病變抑制法；測定干擾素抗病毒活性，以實(shí)際測得的效價(jià)即干擾素的工作單位表示。工作單位經(jīng)修正后以國際單位表示，必須有標(biāo)化國際單位的IFN同時(shí)滴定，測定的標(biāo)化干擾素國際單位除以標(biāo)化單位即可得到一系數(shù)，將此系數(shù)乘以工作單位；標(biāo)化IFN7500IU-=3.75xIFN工作單位本次實(shí)際測定2000U二倍遞增系列稀釋待檢重組豬a干擾素根據(jù)需要橫排做IO個(gè)稀釋度(1:2.......1:1024);第11孔為病毒對照；第12孔為細(xì)胞對照，若豎排做為6個(gè)稀釋度(1:2......1:64);第7孔病毒對照，第8孔細(xì)胞對照，亦可用四倍遞增系列稀釋IFN;每個(gè)批號IFN需作復(fù)孔；標(biāo)化干擾素以同上方法稀釋10孔或6孔。10%牛血清RPMI1640液作為IFN稀釋液，每個(gè)稀釋度每孔100ill可在96孔板上用100y1加樣器直接稀釋，最終每孔100iU。病毒對照和細(xì)胞對照不加干擾素；制備H印-2細(xì)胞懸液H印-2為處于對數(shù)生長期，即傳代后1824h已形成單層，鏡下觀察時(shí)，細(xì)胞透亮，立體感強(qiáng)；用pH7.4PBS洗滌細(xì)胞二次，倒去PBS加入35mlVTP消化液室溫作用3min后一倒去VTP—靜透5min—待細(xì)胞從玻璃瓶表面滑下，加入10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為l-3X107ml，每孔100iU與不同稀釋度rIFN混合。病毒對照，細(xì)胞對照孔均加100ii1細(xì)胞懸液。混勻后將該96孔板置5%(A37。C孵箱培養(yǎng)16-18h，(IFN在細(xì)胞上誘導(dǎo)抗病毒蛋白的時(shí)間控制在16-18h若要快速亦不能少于6h);VSV攻擊IFN與細(xì)胞共孵育16-18h后，倒去96孔板的液體加入配制合適濃度的VSV100y1/孔(預(yù)先滴定VSVTCID5。，以24h可使H印-2細(xì)胞完全破碎的TCID5。為合適濃度)；結(jié)果觀察與分析通常VSV攻擊后24h，鏡檢病毒對照孔細(xì)胞破碎達(dá)100%而細(xì)胞對照正常時(shí)，即可用結(jié)晶紫染色，水洗后肉眼觀察記錄，細(xì)胞完整良好呈紫色如細(xì)胞對照孔，干擾素保護(hù)孔均呈紫色(一)100%病變細(xì)胞為細(xì)胞全脫落故無色，如病毒對照孔和無干擾素保護(hù)的孔均無色(100%CPE++++)舉例如下表1.某批重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果以"+""-"記號記錄形式<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2.50%保護(hù)細(xì)胞的干擾素稀釋度計(jì)算(ReedMuench計(jì)算)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>50%保護(hù)為27，即1:128，即本rIFN的工作單位(U)為128U;工作單位修正以國際單位(IU)表示每次設(shè)立有標(biāo)化國際單位的IFN同時(shí)測定，若標(biāo)化的IFN為7500IU,而本次實(shí)驗(yàn)滴定標(biāo)化干擾素的工作單位為2000U，以下面公式算出系數(shù)，乘以實(shí)際滴定的每個(gè)樣本工作單位，即為該rIFN國際單位。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>所以每次滴定干擾素必需加上標(biāo)化干擾素，使所測干擾素的工作單位加以修正，并以國際單位(IU)表示；經(jīng)過測試，制備的重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)達(dá)到^1.OX1041.OX105IU/ml。8、重組豬a干擾素蛋白理化性狀檢測材料與方法對照參比品為rhIFN-a標(biāo)準(zhǔn)參考品購自北京中國藥品生物制品研究所，干擾素a國家標(biāo)準(zhǔn)品，批號97/04，下稱標(biāo)化干擾素；豬a干擾素單克隆抗體購自ABcam公司；細(xì)胞用于抗病毒活性測定的細(xì)胞人喉癌傳代細(xì)胞(H印-2)株；干擾素效價(jià)測定采用微量板染色法進(jìn)行。攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV);結(jié)果抗胰蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)用胰蛋白酶溶液重新溶解重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品(豬a干擾素效價(jià)稀釋為10000IU/ml，胰蛋白酶的終濃度2.5iig/ml)。37。C作用lh，加入含10%小牛血清的匿EM營養(yǎng)液，稀釋并中止胰蛋白酶的作用，而后依照微量板測定方法測定其干擾素活性，對照為未經(jīng)胰蛋白酶處理的同批標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果經(jīng)胰蛋白酶作用lh的干擾素樣品的活性損失在95%以上，表明重組豬a干擾標(biāo)準(zhǔn)品素對胰蛋白酶不耐受(表3)，符合蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性；表3重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品對胰蛋白酶耐受性測定結(jié)果*干擾素(IU/ml)樣品編號-殘存活性(％)作用前作用后110000<543<5.43210000<526<5.26310000<544<5.44410000<435<4.35510000<411<4,11平均10000<492<4.92*0.25%胰蛋白酶，37"作用lh熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取三批重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品2ml(濃度為0.4mg/ml)，分別于0.5h、lh和2h取樣，4t:保存，統(tǒng)一測其生物學(xué)活性。以同批未經(jīng)加熱處理的樣品為對照測定其干擾素活性。結(jié)果，經(jīng)上述3種時(shí)間在561:加熱處理后的干擾素仍分別保留58.68%、51.55%和24.15%的活性，說明重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品具有較好的熱穩(wěn)定性(詳見表2);表4重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果*熱處理后干擾素效價(jià)殘存干擾素活性(％)樣品編號(x104IU/ml)2h0.5h2h0.5h2h0,5h12.62.41.753.949.630.622.82.51.256.550.125.232.72.21.354.547.326.1平均2.72.41.454.974927.3*測定樣品原效價(jià)5X104單位/ml，水浴溫度56°C。酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)用2.5mol/LHCL分別將重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品以及標(biāo)準(zhǔn)參比品(北京生物制品所產(chǎn)品)調(diào)至pH2.0，而后置4t:。分別于24h、48h和96h取樣，以同批未經(jīng)酸滅活的干擾素樣品為對照，測定其IFN活性；結(jié)果見表3。三種樣品在pH2.0作用24h時(shí)，用NaOH將pH值調(diào)回后，測定效價(jià)，干擾素活性幾乎未受破壞；表5pH2.0處理重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果*樣品編號原效價(jià)(x104IU/ml)pH2.0處理后效價(jià)(x104IU/ml)損失活性(％)24h48h96h24h48h96h110.09.69.58.42.76.514.925.04.84.33.62.86.115.3標(biāo)準(zhǔn)參比品(對照)10.09.89.68.52.76.313.6*用2.5mol/LHC1調(diào)IFN樣品pH至2.0，4。C處理不同時(shí)間后測定3份平行標(biāo)本測定的平均結(jié)果與抗豬干擾素抗體的中和實(shí)驗(yàn)將從ABcam公司購買的抗豬a干擾素單克隆抗體，與重組豬a干擾素混合后，37t:水浴作用lh后測定效價(jià)，結(jié)果被檢的活性損失在95X以上，表明抗豬a干擾素單克隆抗體可中和重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(表4);表6重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品對抗豬干擾素抗體的中和實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果*樣品編號IFN(IU/ml)殘存活性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*抗豬a干擾素單克隆抗體，37。C作用lh結(jié)果判斷我們用ABcam公司購買的豬a干擾素單克隆抗體對重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了中和試驗(yàn)，結(jié)果證明，該重組蛋白確實(shí)為豬a干擾素；并證實(shí)該IFN對胰蛋白酶極為敏感，但對酸和熱較為穩(wěn)定。在56t:保溫lh，活性仍保留在50%，主要理化性質(zhì)與北京生物制品所研制的重組人干擾素a2b標(biāo)準(zhǔn)品類似。權(quán)利要求一種重組豬α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、重組豬α型干擾素工程菌的發(fā)酵及蛋白提取將重組豬α型干擾素工程菌接種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，保持溫度為35-38℃，培養(yǎng)過夜；重組豬α型干擾素工程菌表達(dá)質(zhì)粒為pET-32(a)，裝入豬α干擾素基因；基因工程宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)；序列是TGAAAGTGAAAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTGGAATTCATGTGTGACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATCCCCTCATGAGGCTTTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACGCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAGCCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGAAAGCTTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAATCGGCCCAACGCGCGGGGGAGAGGGCGGTTTTGCGTATTTGAGCGCTCTTTCCCGCTTCCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然后將培養(yǎng)得到的陽性克隆菌接種至含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-38℃，時(shí)間為17-20小時(shí)；將搖床振蕩培養(yǎng)得到的菌液接種至LB培養(yǎng)基中再次進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，菌種與LB培養(yǎng)基的體積比為1∶80-100，培養(yǎng)溫度為35-38℃，時(shí)間為17-20小時(shí)；將再次進(jìn)行搖床振蕩后得到菌種接種至含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧量為25-35％，溫度為35-38℃，PH值為7-8；對發(fā)酵后的菌種進(jìn)行檢測，當(dāng)OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在菌種中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，溫度為30-35℃，時(shí)間為5小時(shí)；將誘導(dǎo)后的菌種進(jìn)行離心、緩沖液重懸、細(xì)胞破碎，再次離心取上清液，即重組豬α型干擾素；(2)、重組豬α型干擾素的純化親和層析純化將重組豬α型干擾素經(jīng)過層析柱上樣、洗雜，梯度洗脫，收集洗脫后的蛋白吸收峰；分子篩層析純化將洗脫后的蛋白吸收峰經(jīng)分子篩層析柱上樣，洗脫，收集洗脫后的蛋白吸收峰，即重組豬α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)、重組豬a型干擾素工程菌的發(fā)酵及蛋白提取將重組豬a型干擾素工程菌種于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37t:培養(yǎng)過夜；然后將培養(yǎng)得到的陽性克隆接種至3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37t:搖床震蕩培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長；將搖床振蕩培養(yǎng)得到的菌液接種至200mlLB培養(yǎng)基中置37t:搖床，轉(zhuǎn)速為220r/min，震蕩培養(yǎng)18h，作為發(fā)酵種子，菌液與LB培養(yǎng)基的體積比為1:100。將再次進(jìn)行搖床振蕩后得到菌種接種至含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)置溫度為37t:、溶氧為30X、轉(zhuǎn)速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養(yǎng)基的體積比為l:100;當(dāng)OD,達(dá)到O.6-0.8時(shí)，在菌種中加入異丙基-!3-D-硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)溫度至32°C，誘導(dǎo)表達(dá)5h;誘導(dǎo)結(jié)束后收集發(fā)酵液，清洗罐體；將發(fā)酵液fC條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩沖液重懸；然后將重懸后菌液在1000bar壓力下高壓細(xì)胞破碎、4t:條件下12000r/min離心10min，收集上清。(2)、重組豬a型干擾素的純化親和層析純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和層析柱；平衡用3-5個(gè)柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱；上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱；洗雜用2個(gè)柱體積以上的BindingBuffer1溶液過層析柱，該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl，調(diào)節(jié)pH至7.4，洗去未與層析柱結(jié)合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰；洗脫用ElutionBuffer,該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脫，之后繼續(xù)100%梯度洗脫20ml;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱；保存用20%乙醇過層析柱；分子篩層析進(jìn)一步純化重組豬a型干擾素清洗用雙蒸水清洗系統(tǒng)管道和分子篩層析柱；平衡用2-3個(gè)柱體積的BindingBuffer2，該溶液組成為50mMNa2HP04，0.15MNaCl，調(diào)節(jié)pH至7.0，平衡分子篩層析柱；上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱；用BindingBuffer2洗脫;洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；用雙蒸水清洗柱子；用20%乙醇過柱。脫集柱存洗收洗保全文摘要本發(fā)明公開了一種重組豬α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，將重組豬α型干擾素的重組菌進(jìn)行發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)并提取總蛋白，用兩步法純化后得到標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明制備的重組豬α型干擾素生物學(xué)活性參考標(biāo)準(zhǔn)品可用于重組豬α型干擾素特性鑒別和效價(jià)測定，以此為標(biāo)準(zhǔn)可使不同批次及同一批次不同次測定的重組豬α型干擾素效價(jià)結(jié)果更為可信。文檔編號C07K1/16GK101736062SQ20091018565公開日2010年6月16日申請日期2009年11月27日優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日發(fā)明者王明麗,趙俊申請人:王明麗;趙俊