本發(fā)明涉及作物抗病育種技術領域，尤其涉及一種黃瓜子葉注射接種快速鑒定黃瓜抗細菌角斑病的方法。

技術背景

黃瓜（cucumissativusl.,2n=14）是世界范圍內(nèi)種植的一種重要的蔬菜作物，在我國蔬菜供應和國民經(jīng)濟中占有極其重要的地位，但是近年來隨著黃瓜保護地栽培面積的不斷擴大，黃瓜病害越來越成為制約黃瓜生產(chǎn)的一個重要因素，嚴重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)報道2014-2016年，中國河北、山東、河南和遼寧省等地黃瓜細菌角斑病（angularleafspot,als）危害十分嚴重，嚴重減產(chǎn)的達到30-50%（mengetal.,2017）。

黃瓜角斑病是由丁香假單胞桿菌黃瓜細菌角斑病致病變種(pseudomonassyringaepv.lachrymans，psl)引起的葉部病害，病菌在種子和病殘體幸存，初侵染來源為帶菌的種子、昆蟲、雨水、勞動者、病殘體及污染病殘體的土壤等，帶菌土壤通過大風或者灌溉迅速遠距離傳播。病菌通過種子萌發(fā)時定植到子葉上增殖發(fā)病，子葉侵染首先在子葉邊緣開始黃化，葉片侵染發(fā)病時首先在葉背面出現(xiàn)水浸狀的褪綠斑，病斑的外圍擴大呈褪綠暈環(huán)，因受葉脈限制而呈多角形，逐漸成黃褐色、褐色、灰白色、白色，易破裂形成穿孔，有時可危害瓜條，腐爛有臭味（youngetal.1996）。

黃瓜角斑病菌psl與寄主植物互作的報道甚少，ps小種存在分化現(xiàn)象，renata等收集了侵染瓜類作物的22個psl小種，利用感病黃瓜lineb鑒定了不同小種的致病性和毒力，并通過分子進化方法對小種進行了劃分。根據(jù)psl小種的致病性及其分子進化分析結果，將psl菌株劃分為兩種類型，強致病力類型和弱致病力類型(renataetal.,2015）。當病菌侵染寄主植物后，寄主植物一般產(chǎn)生兩種反應，其一是過敏性壞死反應，當病菌侵染寄主細胞后，病菌在寄主植物中繁殖很少，一般在12-24h內(nèi)達到高峰，然后迅速衰減；另一種反應為非過敏性壞死反應，細菌感染寄主后，在寄主的接種部位不斷增殖，一般3至4d內(nèi)達到高峰產(chǎn)生壞死斑。黃瓜對psl抗病反應為延遲了病菌在寄主細胞的增殖，表現(xiàn)為耐病，接種psl后侵染位點可檢測到高濃度的游離氨基酸，psl的生理小種的致病性與其產(chǎn)生的蛋白裂解酶成正相關（keenetal.,1967aandb)。而寄主在psl侵染位點誘導產(chǎn)生病程相關蛋白（pathogenesis-relatedproteins,prps）來抑制psl分泌的蛋白酶功能，從而減緩病害的發(fā)展（kryczynskietal.,2002)。這種互作方式符合親和互作的特征，這為我們指導開展黃瓜抗als抗病性鑒定奠定了理論基礎。

利用化學農(nóng)藥防治als不僅污染環(huán)境，而且容易產(chǎn)生抗藥性（lamichhaneetal.,2015）。利用黃瓜種質(zhì)資源進行抗病品種的選育是一項最經(jīng)濟和有效的措施，而快速、可靠、準確的接種鑒定是實現(xiàn)這一目標的關鍵。目前黃瓜als抗病鑒定主要是通過噴霧接種病菌的方法，雖然操作簡單，但是病害發(fā)病不穩(wěn)定，受環(huán)境影響大，每次噴霧接種后的材料的發(fā)病率及病情指數(shù)不穩(wěn)定，給抗病鑒定帶來困難。目前缺乏一種快速準確評價不同黃瓜種質(zhì)資源對als抗病鑒定表現(xiàn)型的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種子葉注射接種快速鑒定黃瓜抗細菌角斑病的方法，該方法首先在黃瓜幼苗兩片子葉完全展開時，以一定濃度的強致病力的黃瓜細菌角斑病psl病菌液輕輕注射黃瓜幼苗的子葉背面，然后保溫保濕7天后根據(jù)子葉的表現(xiàn)的癥狀來判定黃瓜對細菌角斑病的抗病性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：一種黃瓜子葉接種快速鑒定黃瓜抗細菌角斑病的方法，該方法使用黃瓜細菌角斑病菌psl強致病力菌株進行子葉注射接種，從而根據(jù)接種子葉的癥狀快速鑒定黃瓜種質(zhì)資源對細菌角斑病的抗病性，該方法包括以下步驟：

（1）鑒定黃瓜細菌角斑病病菌psl強致病力菌株用于黃瓜幼苗子葉接種，且接種濃度在1×10⁶cfu/ml至5×10⁶cfu/ml之間；

（2）黃瓜幼苗子葉為受體注射接種：將黃瓜種子消毒后播種到營養(yǎng)土中，在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃光照培養(yǎng)16小時、20℃黑暗培養(yǎng)8小時、濕度100%，當子葉完全展開時，將psl菌液輕輕注射入黃瓜幼苗子葉背面的細胞間隙中。接種完后扣透明的塑料蓋密封，在人工氣候室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)7天，然后統(tǒng)計接種后的子葉的發(fā)病癥狀，根據(jù)子葉的癥狀來判斷黃瓜對細菌角斑病的抗病性。

（3）黃瓜對細菌角斑病病菌的抗病性鑒定：當psl菌液接種黃瓜幼苗子葉7天后，在抗病材料上癥狀表現(xiàn)為無明顯褪綠暈環(huán)、子葉濃綠色，而感病材料表現(xiàn)為有明顯的褪綠暈環(huán)、子葉黃化。通過上述方法，即可快速鑒定出黃瓜抗細菌角斑病的材料。

進一步地，步驟（1）中分離黃瓜細菌角斑病病菌強致病力菌株的方法為：①田間采集具有黃瓜細菌角斑病典型癥狀的病葉，放入離心管中，室內(nèi)無菌條件下用10%次氯酸鈉消毒3min，用無菌的蒸餾水沖洗三次。②在離心管里用無菌的玻璃棒將病葉搗碎，加無菌水0.5ml，取無菌的接種針沾取搗碎的病菌汁液，在kb培養(yǎng)基上劃線，24℃暗培養(yǎng)2天直至菌落長出。③選取單菌落kb劃板培養(yǎng)，然后培養(yǎng)的劃線菌用無菌水在平板上沖洗，收集黃瓜細菌角斑病菌液后，用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度在1×10⁶cfu/ml。④用注射器輕輕在黃瓜子葉葉背面注射接種，直至菌液浸透整個子葉葉背面。⑤以24℃光照培養(yǎng)16小時、20℃黑暗培養(yǎng)8小時、濕度100%的條件培養(yǎng)3至7天。⑥根據(jù)接種后子葉褪綠黃化的程度來判斷黃瓜細菌角斑病菌株的致病力水平，選取強致病力的黃瓜細菌角斑病菌株用于隨后的抗病鑒定研究。

進一步地，分離的強致病力黃瓜細菌角斑病菌株用無菌的1%脫脂奶粉保存，并加甘油至終濃度為30%，分裝在1.5ml離心管后于-80℃下長期保存。

進一步地，步驟（2）中黃瓜種子要用10%的次氯酸鈉消毒后，用水沖洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盤上，然后置于人工氣候室中培養(yǎng)。

一種上述方法在黃瓜抗細菌角斑病育種中的應用，也是本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和積極效果：

（1）規(guī)范了黃瓜細菌角斑病的快速接種鑒定技術，以黃瓜幼苗子葉為接種對象，通過注射接種psl強致病力病菌，在接種過程中psl病菌接種濃度可控，保證黃瓜材料在不同批次的接種鑒定中結果的規(guī)范性、準確性、可比性、一致性和穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的黃瓜幼苗葉片噴霧接種方法相比，該方法更為簡單、準確、穩(wěn)定、可控，從而規(guī)范了黃瓜抗細菌角斑病菌的接種鑒定技術。

（2）采用注射快速接種子葉，接種后根據(jù)接種子葉的褪綠癥狀來直接判斷黃瓜材料對黃瓜的抗性，這種判斷方法簡單、可靠，可以有效避免黃瓜噴霧接種后葉片調(diào)查時發(fā)病癥狀不明顯、不穩(wěn)定和鑒定結果差等問題。

（3）本發(fā)明創(chuàng)造性的選擇在幼苗的子葉葉背面采用微注射接種，黃瓜的子葉葉片較厚，使用無注射器針頭的注射器和子葉葉片緊密吻合，在一定的壓力作用下，可以輕輕地將菌液注射進去子葉的細胞間隙中，而且在注射過程中注意避免注射的位置產(chǎn)生傷口，這樣在葉片無創(chuàng)口情況下，接種后7天就可以根據(jù)子葉的癥狀來鑒定抗病性。

附圖說明

圖1表示強致病力psl菌株的濃度；分別以1×10⁸cfu/ml、1×10⁷cfu/ml、1×10⁶cfu/ml和1×10⁵cfu/ml為濃度梯度接種黃瓜幼苗子葉。

圖2表示子葉注射法的流程；

子葉背面被去掉針頭的注射器輕輕注射到子葉細胞間隙里，避免注射的部位產(chǎn)生傷口。

圖3表示在不同濃度下材料的抗病表現(xiàn)，其中在psl病菌>=1×10^7：的接種濃度下，^，ps76和str8都產(chǎn)生黃化褪綠斑；在psl病菌<=1×10⁵的接種濃度下，ps76和str8子葉的都不產(chǎn)出黃化褪綠斑，兩者無差異；在psl病菌為1×10⁶接種濃度下，ps76和str8癥狀差異明顯，其中ps76表現(xiàn)為無褪綠斑，而str8的表現(xiàn)為黃化褪綠，該濃度合適用于區(qū)分抗感材料。

圖4黃瓜材料gy14和9930子葉注射接種psl的抗病性表現(xiàn)。gy14和9930在接種后7天的癥狀表現(xiàn)，其中gy14的子葉無明顯褪綠黃化癥狀，而感病的9930子葉表現(xiàn)為明顯的褪綠黃化癥狀。

具體實施方式

1.黃瓜細菌角斑病病菌psl強致病力菌株的分離鑒定

采用平板分離法分離黃瓜細菌角斑病的致病力菌株psl：①田間采集具有黃瓜細菌角斑病典型癥狀的病葉，放入離心管中，室內(nèi)無菌條件下用10%次氯酸鈉消毒3min，用無菌的蒸餾水沖洗三次。②在離心管里用無菌的玻璃棒將病葉搗碎，加無菌水0.5ml，取無菌的接種針沾取搗碎的病菌汁液，在kb培養(yǎng)基上劃線，24℃暗培養(yǎng)2天直至菌落長出。③選取單菌落kb劃板培養(yǎng)，然后培養(yǎng)的劃線菌用無菌水在平板上沖洗，收集黃瓜細菌角斑病菌液后，用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度在1×10⁶cfu/ml。④用注射器輕輕在黃瓜子葉葉背面注射接種，直至菌液浸透整個子葉葉背面。⑤以24℃光照培養(yǎng)16小時、20℃黑暗培養(yǎng)8小時、濕度100%的條件培養(yǎng)3至7天。⑥根據(jù)接種后子葉褪綠黃化的程度來判斷黃瓜細菌角斑病菌株的致病力水平，選取強致病力的黃瓜細菌角斑病菌株用于隨后的抗病鑒定研究。分離的強毒力psl菌株可以用無菌的1%脫脂奶粉保存，并加甘油至終濃度為30%，分裝在1.5ml離心管后于-80℃下長期保存。

2.pls強毒力菌株的接種濃度的確定

以抗病的黃瓜自交系ps76和感病自交系str8為材料，種子用10%的次氯酸鈉消毒后，用水沖洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盤上，每個材料種8株，置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：24℃光照培養(yǎng)16小時、20℃黑暗培養(yǎng)8小時，直至黃瓜的兩片子葉完全展開時，于接種前2天將苗盤用透明的塑料蓋密封保持濕度100%，隨后子葉可方便用于接種。根據(jù)步驟（1）選取的強致病力的psl菌株，從凍存的-80℃冰箱里取出迅速在沒有融化的情況下用針刺菌然后在kb固體培養(yǎng)基中劃線，隨后在24℃下暗培養(yǎng)1d，然后活化的菌株再轉(zhuǎn)接到kb固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2d，用分光光度計測定菌液的濃度，并用無菌的蒸餾水將調(diào)整菌液濃度分別為1×10⁸cfu/ml、1×10⁷cfu/ml、1×10⁶cfu/ml和1×10⁵cfu/ml，每個育苗盤接種不同濃度梯度，并設置無菌水對照。隨后將psl菌液輕輕注射入黃瓜幼苗的一個子葉背面的細胞間隙中，另一個子葉不進行接種（圖2）。接種完后扣透明的塑料蓋密封，在人工氣候室內(nèi)保持24℃光照培養(yǎng)16小時、20℃黑暗培養(yǎng)8小時，濕度在100%，保持7天，然后統(tǒng)計接種后的子葉的發(fā)病癥狀，當某一濃度的psl菌液接種后在抗病材料上癥狀表現(xiàn)為無明顯褪綠暈環(huán)、子葉濃綠色，而感病材料表現(xiàn)為有明顯的褪綠暈環(huán)、子葉黃化時，此時的psl菌液濃度為最適接種濃度，在psl病菌>=1×10^7：的接種濃度下，^，ps76和str8都產(chǎn)生黃化褪綠斑；在psl病菌<=1×10⁵:的接種濃度下，ps76和str8子葉的都不產(chǎn)出黃化褪綠斑，兩者無差異；在psl病菌為1×10⁶:接種濃度下，ps76和str8癥狀差異明顯，其中ps76表現(xiàn)為無褪綠斑，而str8的表現(xiàn)為黃化褪綠，該濃度合適用于區(qū)分抗感材料。表明psl強致病力菌株的最適宜接種濃度為1×10⁶cfu/ml（圖1、圖3）。

1.子葉注射接種psl快速鑒定黃瓜抗細菌角斑病技術建立

對黃瓜的種質(zhì)資源育苗并進行抗病鑒定。具體方法同（2），黃瓜種質(zhì)資源在人工氣候室進行育苗，每個種質(zhì)資源種8株，待到子葉完全展開時用于接種，采用psl的最適接種濃度（1×10⁶cfu/ml）接種黃瓜的子葉背面，用手托起子葉，用無菌的注射器將菌液輕輕注入子葉背面的細胞間隙，注意在注入的時候避免接種部位產(chǎn)生傷口。子葉接種完后在人工氣候室內(nèi)保持100%的濕度7天，然后統(tǒng)計不同黃瓜種質(zhì)資源接種子葉的癥狀。接種的子葉表現(xiàn)為黃化褪綠的為感病，而子葉葉片濃綠、無褪綠斑的為抗病。通過上述方法，我們篩選了10個抗細菌角斑病的材料，4個感病材料，其中4個抗病材料配制成2個雜交組合，建立了一種黃瓜子葉注射快速準確鑒定黃瓜抗細菌角斑病的方法，為應用該方法開展黃瓜抗細菌角斑病病育種奠定了技術基礎（圖4）。表1為不同的黃瓜材料對psl抗病性表現(xiàn)。篩選出10份抗病材料（r），4份感病材料（s）。

表1不同的黃瓜材料對psl抗病性表現(xiàn)

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