專利名稱：一種蟬棒束孢菌株的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了建立一種蟬棒束孢菌株(保藏號CGMCCN0. 3453)的分子生物學(xué)的鑒定方法。
背景技術(shù)：
單花是 單棒束抱Isaria cicadae Miquel的通用名( 單棒束抱Isaria cicadaeMiquel =蝶擬青霉Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson),是某些蝶若蟲受蝶棒束抱菌寄生后形成的產(chǎn)物，是一種菌蟲復(fù)合體，由Miquel于1838年定名。
本專利涉及的蝶棒束孢菌株(Isaria cicadae Miquel)已于2009年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)注冊保藏，保藏號為CGMCCNO. 3453。本菌株是從云南三門源頭采集野生蟬花標(biāo)本，經(jīng)人工培養(yǎng)和反復(fù)純化分離獲得本專利所述的蝶棒束孢菌株(CGMCC NO. 3453)。他屬于半知菌亞門Deuteromycotina,絲孢綱Hyphomyceles,束梗抱目 Stilbellales,束梗抱科 Stilbellaceae,棒束抱屬 ISaria。其主要形態(tài)特征為在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)10天，菌落圓形，平展，初絮狀，后粉狀，白色至淺黃色，背面淺黃色，直徑5 6厘米。菌絲無色，分枝，具隔膜，寬I. 2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，寬3. O 5. 5 μ m，由每輪2 5個產(chǎn)孢細(xì)胞組成輪狀分枝。產(chǎn)孢細(xì)胞瓶形，基部球狀膨大，向上變細(xì)窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圓柱形，單細(xì)胞，無色，平滑，鏈生，直或彎曲，6. 5 8. 8( 11. O) X2. 5 3. 5 μ m。本菌株經(jīng)試驗證實其培養(yǎng)物易生長和產(chǎn)量高的特點，經(jīng)藥理學(xué)實驗顯示具明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)驚和解熱等功效，且含有豐富生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)素，是一種功效與冬蟲夏草近似的珍貴藥材，具有廣泛開發(fā)藥品和保健品的前途。由于地理環(huán)境來源不同，寄主不同可造成蟬棒束孢菌株間的次生代謝產(chǎn)物具有較大的差異，而這種差異依靠傳統(tǒng)鑒別方法難以區(qū)別，因為傳統(tǒng)方法對蟲生真菌的鑒別和種內(nèi)變異及菌系特征分析均采用形態(tài)特征、生長特性及生物活性物質(zhì)測定進行區(qū)別鑒定，缺乏從菌株的基因水平上確定種的本質(zhì)所在，往往出現(xiàn)較多鑒定誤差，所以迫切需要建立一種較本質(zhì)、較科學(xué)、較先進的鑒別技術(shù)。本專利就是克服以上不足，運用分子遺傳學(xué)技術(shù)，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，建立一種以基因組中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的DNA序列為基礎(chǔ)的的分子標(biāo)志，為本菌株的種屬鑒定提供一種分子水平上、快速、可靠、精確、科學(xué)及不受環(huán)境影響的鑒別菌株新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蝶棒束孢菌株(Isaria cicadae Miquel) CGMCCNO. 3453的分子生物學(xué)的鑒定方法。本發(fā)明的具體方法步驟如下
I)提取待測囷株的基因組DNA ;2)采用ITS5和ITS4這對引物對步驟I)提取的基因組DNA作PCR擴增；引物序列如下ITS5 :5，-GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3’ (SEQ ID NO 1)ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (SEQ ID NO 2)3)擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，觀察DNA擴增結(jié)果；4)對擴增獲得的DNA片段進行回收和純化；5)將純化后DNA片段做雙向測序；

6)將測得DNA序列與蟬棒束孢菌株CGMCC NO. 3453的ITS序列(SEQ ID NO 3)作比對；7)若比對結(jié)果表明，待測菌株ITS序列與SEQ ID NO 3的內(nèi)容和排列順序完全一致時，則待測菌株就是蟬棒束孢CGMCC NO. 3453菌株。步驟2)所述PCR擴增體系為每20ul反應(yīng)體系，內(nèi)含I XEX PCR緩沖液、I. 5mMdNTP、正反向引物各 IOpmol、EX Tag 酶 Iu 和 DNA 樣本 200ng 及力口 ddH20 至 20ul。步驟2)所述PCR擴增條件為94°C 3分鐘為I個循環(huán)；94°C 30秒，55°C 30秒，720C 40秒為38個循環(huán)；最后72°C 7分鐘延伸。蟬棒束孢菌株CGMCC NO. 3453的ITS nrDNA序列經(jīng)引物ITS5/ITS4擴增獲得的PCR產(chǎn)物序列長度為613bp，包括18S rDNA部分序列，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)I (ITSl)，5. 8S r DNA和轉(zhuǎn)錄隔區(qū)II(ITS2)的全部序列以及28S r DNA的部分序列。其序列為SEQ ID NO :3，其中，1-116 為 18S rDNA 部分序列；117-238 為 ITSl (238bp) ;239_396 為 5. 8S r DNA (396bp)；397-555為ITS2(554bp)的全部序列；及556-613為28S r DNA部分序列。研究表明，由ITS5與ITS4引物擴增的蟬棒束孢CGMCC NO. 3453的ITS序列具有種系特異性，不僅與種內(nèi)蟬棒束孢菌株有差別，相似度為99 %，而且與屬內(nèi)其他蟲生真菌具有更顯著差異，相似度為83-98%，尤其與7株蟬棒束孢相比在ITSl和ITS2兩個區(qū)域中共有10個位點發(fā)生變異，不相一致。上述研究結(jié)果提示，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA堿基序列的特異性可作為本菌株的分子標(biāo)記，用于菌株的鑒別診斷。因此認(rèn)為，本發(fā)明的鑒定方法可以成為本菌株在分子水平上的種屬鑒定依據(jù)，并且，本發(fā)明的鑒別方法快速可靠，可準(zhǔn)確地鑒定蟬棒束孢菌株CGMCCN0. 3453，并且檢測結(jié)果不受環(huán)境因素影響。


圖I蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB086631比對結(jié)果圖2蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB086630比對結(jié)果圖3蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB085886比對結(jié)果圖4蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB085887比對結(jié)果圖5蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB085888比對結(jié)果圖6蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AY624175比對結(jié)果圖7蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AF368801比對結(jié)果圖8蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AF368807蛹棒束孢比對結(jié)果圖9蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AJ786590冬蟲夏草比對結(jié)果
圖10蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AB027380細(xì)腳擬青霉比對結(jié)果圖11蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AF237664粉棒束孢比對結(jié)果圖12蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AF368808細(xì)腳棒束孢比對結(jié)果圖13蟬捧束孢CGMCC NO 3453與AY624181粉棒束孢比對結(jié)果圖中，Query對應(yīng)蟬捧束孢CGMCC NO 3453的序列，Sbjct對應(yīng)比對序列
具體實施例方式以下列舉具體實施例進一步闡明本發(fā)明可性行和科學(xué)性，應(yīng)理解實例并非用于限制本發(fā)明的保護范圍實施例I試驗步驟I)常規(guī)方法培養(yǎng)蟬棒束孢CGMCC NO. 3453菌株后，提取該菌株的基因組DNA ；提取基因組DNA方法采用氯仿抽提和異丙醇沉淀DNA的常規(guī)方法，先將液態(tài)培養(yǎng)菌絲體用滅菌水清洗2 次，然后懸于含 3M 異硫氰酸胍的 TEN-3(50mM Tris-Hcl，IOOmM EDTA, 50mM NacI, PH =8. 3)溶液中，在冰浴上勻漿破碎后，加入700ul提取液(50mM Kcl, IOmM Tris-Hcl, PH =
8.3,2. 5mMMgcl2,0. lmg/ml 白明膠，O. 45%NP40,0. 45% Tween 20)另加入 6ul (10mg/ml)蛋白酶K，混勻后置55°C、I小時水浴，結(jié)束后用等量氯仿抽提2次，加入等量異丙醇，于_20°C冰箱過夜，然后15000r/min離心15min(4°C )取沉淀，用70%酒精清洗I次，IXTE溶解DNA,保存于_20°C冰箱待用。2)采用ITS5和ITS4 —對引物對上述提取基因組DNA作PCR擴增；I TS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3，I TS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ；PCR擴增反應(yīng)體系如下總反應(yīng)體系為20ul，內(nèi)含IXEX PCR緩沖液、I. 5mMdNTP、一對各為IOpmol引物、EX Tag酶Iu (TakaRa產(chǎn)品)和DNA樣本200ng及加ddH20至20ul。PCR擴增反應(yīng)的順序如下94°C 3分鐘為I個循環(huán)；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒為38個循環(huán)；最后72°C 7分鐘延伸。上述擴增反應(yīng)在美國ABI公司2720型PCR儀上完成。3)擴增產(chǎn)物在I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，觀察DNA擴增結(jié)果，獲得613bp大小的DNA片段；4)對擴增獲得的DNA片段進行回收和純化；回收和純化PCR產(chǎn)物,采用Micorocon-30試劑盒(Millipore產(chǎn)品)，按試劑盒提供的操作步驟進行。5)將純化后的DNA片段，應(yīng)用雙脫氧測序原理，采用測序引物分別為ITS5和ITS4，在ABI3130XL測序儀上做雙向測序。6)結(jié)果為SEQ ID NO :3，應(yīng)用NCBI中的BLAST軟件進行DNA序列相似性檢索。7)與種內(nèi)各蟬棒束孢ITS序列比較將本菌株的測序結(jié)果與Gen Bank登記的7株種內(nèi)蟬棒束孢AB086631，AB086630，AB085886, AB085887, AB085888, AY624175 和 AF368801 的 ITS 序列作 BLAST 比對結(jié)果表明相似性均達到99%，具體數(shù)據(jù)見表I。
表I蟬棒束孢rDNA基因ITS5/ITS4間序列比對*

權(quán)利要求
1.一種蟬棒束孢菌株CGMCC NO. 3453的分子鑒定方法，包括下列步驟 1)提取待測菌株的基因組DNA； 2)采用ITS5和ITS4這對引物對步驟I)提取的基因組DNA作PCR擴增；ITS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCCTAACAAGG-3，ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 3)擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，觀察DNA擴增結(jié)果； 4)對擴增獲得的DNA片段進行回收和純化； 5)將純化后DNA片段做雙向測序； 6)將測得DNA序列與SEQID NO 3作比對； 7)若比對結(jié)果表明，待測菌株ITS序列與SEQID NO :3的內(nèi)容和排列順序完全一致，則待測菌株就是蟬棒束孢CGMCC NO. 3453菌株。
2.如權(quán)利要求I所述蟬棒束孢菌株CGMCCNO. 3453的分子鑒定方法，其特征在于，步驟2)所述PCR擴增體系為每20ul反應(yīng)體系，內(nèi)含IXEX PCR緩沖液、I. 5mMdNTP、正反向引物各 IOpmol、EX Tag 酶 Iu 和 DNA 樣本 200ng 及加 ddH20 至 20 μ I。
3.如權(quán)利要求I所述蟬棒束孢菌株CGMCCNO. 3453的分子鑒定方法，其特征在于，步驟2)所述PCR擴增條件為94°C 3分鐘為I個循環(huán)；而后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒為38個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘延伸。
全文摘要
本專利涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種蟬棒束孢菌株CGMCCNO.3453的分子鑒定方法，包括如下步驟提取菌株的基因組DNA；采用引物ITS5和ITS4對基因組的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA擴增，對擴增獲得的DNA片段進行回收和純化；將純化后DNA片段做雙向測序；將測得DNA序列與SEQIDNO:3作比對；若比對結(jié)果表明，待測菌株ITS序列與SEQIDNO:3的內(nèi)容和排列順序一致，則待測菌株就是蟬棒束孢CGMCCNO.3453菌株。本發(fā)明的方法可快速，可靠及準(zhǔn)確地鑒定蟬棒束孢菌株CGMCCNO.3453，而且該鑒定方法結(jié)果不受環(huán)境因素影響。
文檔編號C12Q1/68GK102851353SQ20111017827
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者鮑曉妮, 陳超, 魏寧, 張健, 江三多, 孫長勝 申請人:上海泛亞生命科技有限公司