技術領域：

本發(fā)明屬于分子標記技術領域，具體涉及凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記及其特異性引物和檢測方法。

背景技術：
：

微衛(wèi)星(microsatellite)，又稱簡單重復序列(simplesequencerepeats,ssrs)或短串聯重復序列(shorttandemrepeats,strs)，為共顯性標記，具有多態(tài)性豐富、重復性好、遺傳穩(wěn)定和可檢測雜合子等優(yōu)點，彌補了擴增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,aflp)和隨機擴增多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)等技術的不足，是目前在水產養(yǎng)殖動物種群遺傳結構研究和遺傳育種領域應用較廣泛的分子標記技術。隨著功能基因組學的發(fā)展，表達序列標簽(expressedsequencetags,ests)成為開發(fā)ssr標記的重要資源。est-ssr作為一種新型分子標記，除具有傳統(tǒng)ssr標記的優(yōu)點外，因其反映的是轉錄區(qū)的差異，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關。因此，與傳統(tǒng)的ssr標記相比，est-ssr標記在分子標記輔助選擇育種領域具有更高的應用價值。

凡納濱對蝦(litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，是全世界產量最大的養(yǎng)殖對蝦。在我國，凡納濱對蝦養(yǎng)殖區(qū)域遍布于全國沿海的海水養(yǎng)殖區(qū)和內陸的淡水養(yǎng)殖區(qū)，是我國水產養(yǎng)殖的支柱性產業(yè)。迄今為止，凡納濱對蝦est-ssr標記的開發(fā)較少，與功能基因相關聯的est-ssr標記的開發(fā)則更少，僅在凡納濱對蝦滲透壓調節(jié)相關功能基因中篩選到5個est-ssr標記。本發(fā)明基于轉錄組測序獲得的凡納濱對蝦est序列，利用滲透壓調節(jié)相關功能基因之外的其他功能基因的est序列進行est-ssr標記的開發(fā)，從而為凡納濱對蝦遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建和進化分析奠定基礎，同時為凡納濱對蝦分子標記輔助育種提供有價值的分子標記。

技術實現要素：
：

本發(fā)明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記及其特異性引物和檢測方法。為凡納濱對蝦遺傳關系分析及分子標記輔助育種提供有價值的分子標記。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記，所述的est-ssr標記編號分別為lv-f008、lv-f010、lv-f014、lv-f016、lv-f028、lv-f032、lv-f047和lv-f056；

所述的lv-f008的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述的lv-f010的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述的lv-f014的核苷酸序列如seqidno.3所示；

所述的lv-f016的核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述的lv-f028的核苷酸序列如seqidno.5所示；

所述的lv-f032的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述的lv-f047的核苷酸序列如seqidno.7所示；

所述的lv-f056的核苷酸序列如seqidno.8所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述的凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記的特異性引物，所述的est-ssr標記的特異性引物如下所示：

針對位點lv-f008：

lv-f008-f：5’-tcagcccttatagatttaaaagaaaa-3’(如seqidno.9所示)；

lv-f008-r：5’-ttaatataaaatcccggccaaac-3’(如seqidno.10所示)；

針對位點lv-f010：

lv-f010-f：5’-tttaaatatggcttcctccttgg-3’(如seqidno.11所示)；

lv-f010-r：5’-acagctacggctcgttacctaga-3’(如seqidno.12所示)；

針對位點lv-f014：

lv-f014-f：5’-gggagagaatctagcttgtgatg-3’(如seqidno.13所示)；

lv-f014-r：5’-cttgttgcttgattccacttttt-3’(如seqidno.14所示)；

針對位點lv-f016：

lv-f016-f：5’-tatgaaaaggttagagcgagtgg-3’(如seqidno.15所示)；

lv-f016-r：5’-ccaaacacgtttatccacacata-3’(如seqidno.16所示)；

針對位點lv-f028：

lv-f028-f：5’-accaaggacttcttcggtgag-3’(如seqidno.17所示)；

lv-f028-r：5’-atacccgaatggaaaaagaagaa-3’(如seqidno.18所示)；

針對位點lv-f032：

lv-f032-f：5’-atggaggtcaggtttttcttctt-3’(如seqidno.19所示)；

lv-f032-r：5’-aatccctctggccttataggaat-3’(如seqidno.20所示)；

針對位點lv-f047：

lv-f047-f：5’-aattgtagggaattggataggga-3’(如seqidno.21所示)；

lv-f047-r：5’-cagaattaggagtgataatacccca-3’(如seqidno.22所示)；

針對位點lv-f056：

lv-f056-f：5’-gtgtgtattccatgttgcgtatg-3’(如seqidno.23所示)；

lv-f056-r：5’-cgatgaaaaaccattgatttagg-3’(如seqidno.24所示)。

所述的特異性引物的正向引物的5’端標記有熒光基團。

所述的熒光基團優(yōu)選為fam、hex或tamra。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記的檢測方法，包括以下步驟：

(1)、提取凡納濱對蝦基因組dna；

(2)、以步驟(1)提取的基因組dna為模板，分別利用上述的針對位點lv-f008的引物對lv-f008-f/r、針對位點lv-f010的引物對lv-f010-f/r、針對位點lv-f014的引物對lv-f014-f/r、針對位點lv-f016的引物對lv-f016-f/r、針對位點lv-f028的引物對lv-f028-f/r、針對位點lv-f032的引物對lv-f032-f/r、針對位點lv-f047的引物對lv-f047-f/r和針對位點lv-f056的引物對lv-f056-f/r進行pcr擴增；

(3)、利用測序儀對pcr擴增產物進行分型。

所述的步驟(2)中的pcr擴增，其反應體系優(yōu)選為：25μl，包括：不含mg²⁺的10×pcrbuffer2.5μl，25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl，5u/μl高保真pcr酶0.2μl，10μm正向引物0.5μl，10μm反向引物0.5μl，25ng/μldna模板0.5μl，ddh2o18.3μl。

所述的步驟(2)中的pcr擴增，其反應程序優(yōu)選為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，按上述的est-ssr標記的特異性引物的退火溫度退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；72℃再延伸6分鐘；所述的est-ssr標記的特異性引物的退火溫度分別為：位點lv-f008：55℃，位點lv-f010：55℃，位點lv-f014：55℃，位點lv-f016：55℃，位點lv-f028：61℃，位點lv-f032：56℃，位點lv-f047：55℃，位點lv-f056：55℃。

為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明利用通過轉錄組測序獲得的凡納濱對蝦est序列，開發(fā)凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記，并提供多態(tài)性引物，建立凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記開發(fā)的技術體系，為凡納濱對蝦遺傳關系分析及優(yōu)良品種的選育提供有價值的分子標記。

本發(fā)明的技術方案：從轉錄組測序獲得的凡納濱對蝦est序列中通過blast比對篩選滲透壓調節(jié)相關功能基因之外的其他功能基因的est序列，并通過misa軟件進行微衛(wèi)星位點查找，獲得了56個含有微衛(wèi)星的凡納濱對蝦功能基因的est序列。采用primerpremier5軟件，針對篩選出的56個est序列的72個ssr位點設計了72對引物，并利用這72對引物對凡納濱對蝦的基因組dna進行pcr擴增，其中有30對引物穩(wěn)定擴增出目的條帶。利用3730xl測序儀對pcr擴增產物進行分型，并使用genemapper3.2軟件判讀等位基因片段的具體數值，最終確定了8個具有高度多態(tài)性的凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記。

本發(fā)明獲得的8個est-ssr標記的等位基因數分別為4、3、5、6、5、7、3和10個，觀測雜合度、期望雜合度和pic值均大于0.5，說明這8個est-ssr標記均具有高度多態(tài)性，可用于凡納濱對蝦種質資源的遺傳結構和遺傳多樣性分析、分子指紋圖譜構建和分子標記輔助育種。

附圖說明：

圖1是lv-f008位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖2是lv-f010位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖3是lv-f014位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖4是lv-f016位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖5是lv-f028位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖6是lv-f032位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖7是lv-f047位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

圖8是lv-f056位點引物擴增24個凡納濱對蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個凡納濱對蝦樣品。

具體實施方式：

以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法或者按照試劑盒說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。轉錄組測序由華大基因有限公司完成，其他測序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。

1、凡納濱對蝦轉錄組測序及序列比對

1.1轉錄組測序

分別取凡納濱對蝦肌肉、肝胰腺、鰓和腸組織，用rnaisoplus(takara,japan)提取總rna，并用dnasei(takara)處理。采用nanodrop^tm2000分光光度計(thermoscientificwaltham,ma,usa)測定rna濃度，并用agilent2100bioanalyzer(agilenttechnologies,ca,usa)評價rna的質量。將從4種不同組織樣品中提取的rna等量混合后，經mrna富集、mrna片段化、cdna合成、末端修復、加“a”尾和測序接頭連接等工序建立cdna文庫。采用iiiuminahiseq2000高通量測序平臺對cdna文庫進行測序，采用seqclean和lucy軟件去掉接頭序列及低質量序列，獲得高質量的序列數據，并用trinity法進行序列組裝。

1.2est序列比對

通過ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)對est序列進行比對，確定每個est序列隸屬的基因名稱。

2、凡納濱對蝦功能基因est的篩選及微衛(wèi)星位點查找

針對篩選出的滲透壓調節(jié)相關功能基因之外的其他功能基因的est序列，采用misa軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進行微衛(wèi)星位點查找，獲得56個含有微衛(wèi)星的凡納濱對蝦功能基因est序列。

3、凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記引物的設計

采用primerpremier5軟件，針對篩選出的56個凡納濱對蝦功能基因est序列的72個ssr位點進行ssr引物設計。引物設計的要求為：引物長度18-24bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結構及錯配等；擴增產物長度為100-550bp。共設計和合成72對est-ssr引物，引物序列見表1：

表1凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記引物特性表

(位點、對應基因、重復基序、引物序列、退火溫度)

注：f表示正向引物，r表示反向引物

4、凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記引物的篩選及結果分析

4.1凡納濱對蝦基因組dna的提取

選取來自于廣東深圳、珠海、湛江、徐聞和茂名等地24個養(yǎng)殖場的凡納濱對蝦24尾，分別取肌肉組織，采用海洋動物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對蝦基因組dna，操作步驟嚴格按照說明書進行?；蚪Mdna定量采用nanodrop^tm2000分光光度計完成，質量采用瓊脂糖電泳來檢測。

4.2引物的初步篩選

從上述提取的凡納濱對蝦基因組dna中隨機抽取一份做模板，分別采用表1中的72對引物對該dna進行pcr梯度擴增，反應體系25μl，包括：10×pcrbuffer(withoutmg²⁺)2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μl高保真pcr酶(hsdnapolymerase)0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、25ng/μldna模板0.5μl、無菌水18.3μl。反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，退火(溫度從48℃到64℃)30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；72℃再延伸6分鐘。pcr擴增產物經2％瓊脂糖電泳檢測，顯示有30對引物在特定退火溫度下能穩(wěn)定擴增出單一條帶。分別對擴增產物進行測序，結果顯示該30對引物均可擴增出目的條帶，位點分別為：lv-f001-lv-f003、lvf006-lv-f018、lv-f020、lv-f025-lv-f028、lv-f030、lv-f032、lv-f034、lv-f041、lv-f045-lv-f047、lv-f056和lv-f065。

4.3多態(tài)性引物的篩選及結果分析

對步驟4.2初步篩選出的30對引物的正向引物的5’端分別用fam、hex或tamra進行熒光標記，以步驟4.1提取的24個凡納濱對蝦基因組dna為模板，分別用步驟4.2初步篩選出的30對引物(正反向引物序列見表1，正向引物的5’端標記有熒光基團)進行pcr擴增。反應體系同步驟4.2所述，反應程序除退火溫度外均與步驟4.2中所述一致，各引物對對應的退火溫度詳見表1。pcr擴增產物先用2％瓊脂糖電泳進行檢測，后采用3730xl測序儀進行分型，并使用genemapper3.2軟件判讀等位基因片段的具體數值，確定了8個具有多態(tài)性的凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記(見圖1～8)，位點分別為：lv-f008(其核苷酸序列如seqidno.1所示)、lv-f010(其核苷酸序列如seqidno.2所示)、lv-f014(其核苷酸序列如seqidno.3所示)、lv-f016(其核苷酸序列如seqidno.4所示)、lv-f028(其核苷酸序列如seqidno.5所示)、lv-f032(其核苷酸序列如seqidno.6所示)、lv-f047(其核苷酸序列如seqidno.7所示)和lv-f056(其核苷酸序列如seqidno.8所示)。

采用popgene32軟件計算期望雜合度和觀察雜合度，使用piccalc0.6軟件計算多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)。結果表明：上述8個多態(tài)性微衛(wèi)星標記的等位基因數分別為4、3、5、6、5、7、3和10個；觀測雜合度分別為0.6800、0.7500、0.6853、0.8067、0.7332、0.8191、0.7500和0.8661；期望雜合度分別為0.5417、0.6782、0.6250、0.7917、0.7500、0.7917、0.6800和0.6667；pic值分別為0.5997、0.5899、0.6071、0.7572、0.6727、0.7731、0.5917和0.8300(表2)，均大于0.5，說明這8個est-ssr標記均具有高度多態(tài)性，可用于凡納濱對蝦種質資源的遺傳結構和遺傳多樣性分析、分子指紋圖譜構建和分子標記輔助育種。

表2凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記特性表

序列表

<110>中國科學院南海海洋研究所

<120>凡納濱對蝦功能基因est-ssr標記及其特異性引物和檢測方法

<160>24

<210>1

<211>158

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>1

tcagcccttatagatttaaaagaaaatatttataagttggactcaaataaagaatttaaa60

aaaatcaactctggtgtgtgtgtgtgcaacattgtgtgatttaactttcttttgatactg120

ttaaaattttcatctgtttggccgggattttatattaa158

<210>2

<211>154

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>2

tttaaatatggcttcctccttggcagcgtcacataaccgctaaagtcaccctcgctcgtc60

tgcgtctgcgcctctgctgcggctgtgtactcggcggcggcggcggcggcgtgagaggct120

gcggaggagcgtctaggtaacgagccgtagctgt154

<210>3

<211>149

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>3

gggagagaatctagcttgtgatgcatgtcccgatcgagcgctcgttccgggcgtgacgag60

agagaagtggagtgacgccatggagtagaacgagtgacggcggagagagagagagagaga120

gttaaaaaaaagtggaatcaagcaacaag149

<210>4

<211>120

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>4

tatgaaaaggttagagcgagtgggagaaataagcatgtttgagtaagagaacatctttgt60

gtgtgtgtgtgcgtgtgtacatgcacatgtatgtgtctatgtgtggataaacgtgtttgg120

<210>5

<211>123

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>5

accaaggacttcttcggtgaggctgcgcggtcgccccaaccctcgctttcttcgtcattt60

tttgctctatatcatcctatatatatgtgtgtgtgtgtgtttcttctttttccattcggg120

tat123

<210>6

<211>102

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>6

atggaggtcaggtttttcttctttacaatgttgtgaatctctatcaatatcatttatata60

tatatatataataacactcattcctataaggccagagggatt102

<210>7

<211>155

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>7

aattgtagggaattggatagggattttgtgcattaaatttgatattattattattatttt60

tacagttatcatcattattttcaatatattatttttttattacaattatttttactgcct120

ctagtattagtggggtattatcactcctaattctg155

<210>8

<211>137

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>8

gtgtgtattccatgttgcgtatgtgcttaaaatattcagtcagatgtatttcataattaa60

gaaaaaaagaaatgaaaatatatatatatattttttttcattattaaaaattctcctaaa120

tcaatggtttttcatcg137

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>9

tcagcccttatagatttaaaagaaaa26

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>10

ttaatataaaatcccggccaaac23

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>11

tttaaatatggcttcctccttgg23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>12

acagctacggctcgttacctaga23

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>13

gggagagaatctagcttgtgatg23

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>14

cttgttgcttgattccacttttt23

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>15

tatgaaaaggttagagcgagtgg23

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>16

ccaaacacgtttatccacacata23

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>17

accaaggacttcttcggtgag21

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>18

atacccgaatggaaaaagaagaa23

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>19

atggaggtcaggtttttcttctt23

<210>20

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>20

aatccctctggccttataggaat23

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>21

aattgtagggaattggataggga23

<210>22

<211>25

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>22

cagaattaggagtgataatacccca25

<210>23

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>23

gtgtgtattccatgttgcgtatg23

<210>24

<211>23

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>24

cgatgaaaaaccattgatttagg23