與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。通過苗期對資源霜霉病的抗性鑒定篩選的原則和現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，通過選用高抗霜霉病的甜瓜資源PI438685為高抗資源，以高抗資源PI438685與感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”構(gòu)建甜瓜霜霉病抗感F2代群體，利用公知的遺傳軟件，找到與PI438685抗霜霉病基因連鎖的分子標(biāo)記SSR?666230，該標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離為2.66cM。通過提取甜瓜單個植株基因組DNA，用SSR?666230這個標(biāo)記進行PCR擴增，檢測是否只有唯一特定230bp特異性條帶出現(xiàn)，如只有這條特異性條帶出現(xiàn)，則預(yù)測此甜瓜單株抗霜霉病，達到選育抗霜霉病品系過程縮短育種周期、提高選擇準(zhǔn)確率良好的技術(shù)效果，具有廣泛的實用價值。
【專利說明】
與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及與甜瓜抗霜霉病新基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甜瓜是一種重要的經(jīng)濟作物，我國甜瓜的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。甜瓜霜霉病[Pseudoperonospora cubensis(Berk.etCurt.)Rostov.]在高溫高濕的條件下，流行迅速、危害嚴(yán)重、防治困難，對甜瓜的產(chǎn)量、果實含糖量和商品率都造成了直接的影響，是一種毀滅性的病害?；瘜W(xué)防治霜霉病病不僅效率低，還易引起環(huán)境污染，而培育抗病品種是防治甜瓜霜霉病危害的最安全、有效而且節(jié)約成本的措施之一。
[0003]通常利用常規(guī)育種的方法也能得到一些抗性好的優(yōu)良品種，常規(guī)方法選育抗病育種材料時是采用苗期人工接種鑒定，根據(jù)植株的表型抗感特征進行篩選，有時會因為接種不充分或發(fā)病條件不適宜而影響選擇效率，難以準(zhǔn)確、快速地篩選出具有抗病基因的個體植株。為了準(zhǔn)確、快速地篩選出具有抗病基因的個體植株，近幾年發(fā)展起來的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，通過分子標(biāo)記輔助選擇可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型，在早代就可以對抗病植株進行選擇，從降低成本、提高選擇等方面都具有重要的意義。迄今為止，已知的甜瓜抗霜霉病基因有5個?(3-1、？(:-2、？(3-3、？(3-4、？(3-5，且在抗源抗性遺傳上存在一定的歧義，Thomas等認(rèn)為自交系MR-1的抗性是由2個不完全顯性基因控制，并將其命名為Pc-1和Pc-2;Cohen等通過抗病品種PI124111與感病品種WI998的雜交后代抗性研究，認(rèn)為PI124111的抗性是由2個部分顯性基因控制，而且這一結(jié)論在PI124111 X Ananas-Yokneam中重新得到了證實；Epinat等用3個抗病品種PI414723、MR-1和PI124112與感病品種Vedrantais雜交研究顯示，PI414723的抗性是由I個單顯性基因控制，而MR-1和PI124112的抗性則是由暴基因控制，并認(rèn)為這些基因具有不完全顯性，國內(nèi)楊柳燕等通過尚抗材料DM3和高感霜霉病材料DF4構(gòu)建F2分離群體與BCl回交群體，對抗源DM3進行遺傳規(guī)律分析，認(rèn)為DM3的抗性由一對隱性基因控制。有關(guān)抗源的分子標(biāo)記研究僅僅中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所分別對抗親DM3和PI414723進行了報道，并找到了與之連鎖的I個SRAP標(biāo)記和3個SSR標(biāo)記，但是遺傳距離太遠，在分子標(biāo)記輔助育種上難以應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中抗性基因遺傳存在歧義、現(xiàn)有分子標(biāo)記研究的不足的情況下，發(fā)現(xiàn)了并利用新抗源PI438685，并找到了與甜瓜抗霜霉病基因連鎖的分子標(biāo)記?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)在選育穩(wěn)定甜瓜霜霉病抗病品系難度較大、周期較長的缺陷，為甜瓜的霜霉病抗病育種提供分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)，從而降低成本、提高選擇效率，為快速培育優(yōu)良抗霜霉病甜瓜品種奠定了基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
通過苗期對資源霜霉病的抗性鑒定篩選的原則和現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，通過選用高抗霜霉病的甜瓜資源PI438685為高抗資源，以高抗資源PI438685與感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”構(gòu)建甜瓜霜霉病抗感F2代群體，利用公知的遺傳軟件，找到與PI438685抗霜霉病基因連鎖的分子標(biāo)記SSR-66 623Q，通過提取甜瓜單個植株基因組DNA，用SSR-66 623Q這個標(biāo)記進行PCR擴增，檢測是否有唯一的230bp特異性條帶出現(xiàn)，如只有這條特異性條帶出現(xiàn)，則預(yù)測此甜瓜單株抗霜霉病，達到選育抗霜霉病品系過程縮短育種周期、提高選擇準(zhǔn)確率良好的技術(shù)效果。
[0006]本發(fā)明具體提供了一種與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，包括以下步驟:
(I)以感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”為母本，抗病資源PI438685為父本進行雜交，得到雜種F1。
[0007](2)由雜種F1自花授粉獲得F2代群體,F1與“卡拉克賽”雜交獲得回交群體BCs，F(xiàn)gPI438685雜交獲得回交群體BCr。
[0008](3)分別在苗期對PI438685、“卡拉克賽” 'F^BCsjCr和F2進行霜霉病抗病性鑒定。
[0009]霜霉病菌接種液的配備:從田間采集自然發(fā)病的早期病葉，用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，用常見的點接法接種于感病品種的子葉上，之后放入光照培養(yǎng)箱進行擴繁，待子葉背面長出大片黑色霉層后，再用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，攪拌均勻后用血球計數(shù)板計數(shù)分生孢子數(shù)，最終濃度為5X 13/ml個孢子。
[0010]接種:分別選用PI438685、“卡拉克賽”和？!各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F2播種于常見的大棚內(nèi)的消毒營養(yǎng)缽中，待第2片真葉完全展開時，采用噴霧法進行接種，接種濃度為5 X 13個/mL，將配制好的霜霉病菌接種液均勻噴于整株葉面，接種后黑暗保濕48小時，控制溫度夜間20°C白天25°C，相對濕度90%以上。
[0011]根據(jù)在苗期對PI438685、“卡拉克賽”、FhBC^BCr和F2進行抗病性鑒定結(jié)果:甜瓜抗霜霉病資源PI438685攜帶霜霉病抗性基因，抗性基因表現(xiàn)為隱性遺傳，PI438685全部抗病，“卡拉克賽”全部感病，F(xiàn)1、BCs全部感病，BCr抗感比接近1:1，F(xiàn)2中抗感比接近1:3，表明抗源PI438685抗性基因為單基因隱性。
[0012](4)抗感基因池的構(gòu)建:F2代選取抗病和感病的單株各5株，等量基因組DNA分別混合構(gòu)建抗感基因池；具體先選取表現(xiàn)型為O級抗病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建抗病基因混合池，再選取表現(xiàn)型感病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建感病基因混合池，抗感池最終濃度I OOng/ mL。
[0013](5)利用公知引物公布的信息，分別以抗感基因池為模版進行PCR擴增，經(jīng)過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，初步篩選出在抗、感基因池間存在多態(tài)性的SSR引物18對，經(jīng)過幾次重復(fù)實驗，只有3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之間能穩(wěn)定擴增出多態(tài)性條帶。
[0014](6)通過對已獲得3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699做進一步驗證；以抗病資源PI438685、感病自交系“卡拉克賽”、F1以及用于構(gòu)建抗感基因池的5個抗病F2單株和5個感病^單株為模版進行PCR驗證，最終引物SSR-666擴增穩(wěn)定，重復(fù)性好，在抗親、抗病基因池和抗病單株上均能擴增出230bp的片段，在感親、感病基因池和感病單株上沒有出現(xiàn)這條特異性條帶，由此推斷引物SSR-666可能與抗源PI438685的抗霜霉病基因存在連鎖關(guān)系，命名SSR-6 6 6 230。
[0015](7)根據(jù)已獲得的分子標(biāo)記SSR-6 6 6 23Q，對F2代群體單株擴增檢測，并進行遺傳連鎖分析；用遺傳軟件進行遺傳連鎖性分析，以3.0為最小LOD閥值，確定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因與分子標(biāo)記SSR-666230緊密連鎖，遺傳連鎖距離為2.66cM。
[0016]本發(fā)明獲得3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699其引物序列為:
SSR-666 5’ GTTCCAATTGGGGAGATG' 3;
5’ CAAATCCAACGATTCATAAAC' 3;
SSR-689 5’ TGTGTGTGTGAGAGAGAGAG' 3;
5’ GTGTTTGCCGATTCTACC’ 3;
SSR-699 5’ CAATCGCAGATACTTCCACG’ 3;
5’ TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT' 3。
[0017]進一步，本發(fā)明提供與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66 6 23Q的應(yīng)用，通過將分子標(biāo)記SSR-6 6 6 23Q用于甜瓜品種或品系的基因型檢測，用于判斷該品種或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步驟:
(I)以抗病資源PI438685與其他甜瓜雜交并繁衍至內(nèi)代以上。
[0018](2)對通過步驟(I)獲得的甜瓜單株提取基因組DNA，用SSR-66623Q這個標(biāo)記進行PCR擴增，檢測是否只有一條唯一 230bp特異性條帶出現(xiàn)，如只有這條特異性條帶出現(xiàn)，則預(yù)測甜瓜植株抗霜霉病。
[0019]本發(fā)明采用的病情調(diào)查，即采用常見的調(diào)查病害情況，分級鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法參照常見的翁祖信等(1989)的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)并做適當(dāng)調(diào)整，以葉片背面霉層的覆蓋面積為統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，將病害O級、I級和2級定為抗病，病害3級、4級和5級定為感病，具體情況如下:
病情調(diào)查:經(jīng)過10-14d后調(diào)查病害情況，根據(jù)甜瓜病斑占葉面積大小不同，將病害劃分為0-5個等級，并根據(jù)病害分級情況，將分級數(shù)轉(zhuǎn)換為單個植株的抗病或感病表現(xiàn)型。
[0020]具體分級標(biāo)準(zhǔn)如下:
O級無任何病癥；
I級病斑面積占整個葉片面積的<1/10;
2級病斑面積占整個葉片面積的1/10-1/4;
3級病斑面積占整個葉片面積的1/4-1/2;
4級病斑面積占整個葉片面積的1/2-3/4;
5級葉上病斑基本布滿，病斑面積占整個葉片面積的>3/4。
[0021]F2代抗感基因池的構(gòu)建取抗病(O級)和感病(5級)的F2R單株各5株等量的DNA，分別混合構(gòu)建抗感基因池。
[0022]本發(fā)明對引物進行SSR擴增篩選中，采用參照國際葫蘆科作物網(wǎng)站(ICuGI)公布的的信息，通過合成1090對引物，除掉無擴增產(chǎn)物及擴增產(chǎn)物有拖尾現(xiàn)象的引物以外，有878對SSR引物能擴增出有效條帶，利用抗感基因池對878對引物進行SSR擴增篩選后，只有3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之間擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。
[0023]本發(fā)明根據(jù)已獲得的分子標(biāo)記SSR-66623Q，對F2代群體單株擴增檢測，并進行遺傳連鎖分析:播種200穴種子，出苗197株，其中病級數(shù)為0-2級有53株，表現(xiàn)為抗病;病級數(shù)為3-5級有144株，表現(xiàn)為感病;在144株感病植株中，90株擴增出抗病和感病2條多態(tài)性條帶，46株擴增出感病多態(tài)性條帶，無擴增條帶6株，2株只擴增出抗病性態(tài)性多條帶，即發(fā)生重組;在53株抗病植株中，48株只擴增出抗病多態(tài)性條帶，O株擴增出感病多態(tài)性條帶，無擴增條帶2株，3株擴增出感病多態(tài)性條帶，即表現(xiàn)重組。利用常見的遺傳軟件進行遺傳連鎖性分析，以3.0為最小LOD閥值，確定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因與分子標(biāo)記SSR-666230緊密連鎖，遺傳連鎖距離為2.66cM。
[0024]本發(fā)明選用的遺傳軟件優(yōu)先采用公知的QTLIciMapping遺傳軟件。
[0025]本發(fā)明所提供的與甜瓜PI438685抗霜霉病基因連鎖的分子標(biāo)記SSR-66623Q中，用弓丨物SSR-666擴增甜瓜霜霉病抗源PI438685的DNA，只擴增出唯一I條長度為230bp特異性的條帶，表明攜帶抗病基因。
[0026]本發(fā)明涉及到的各種遺傳資源都可以通過購買途徑或贈予途徑可以獲得。
[0027]本發(fā)明中所選用的新抗源PI438685來源于美國農(nóng)業(yè)部國家植物種質(zhì)資源體系(USDA NPGS)，現(xiàn)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜中心保存，抗源PI438685材料本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過引進途徑獲得。
[0028]本發(fā)明中所選用的農(nóng)家品種“卡拉克賽”，來源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，新疆種子市場可購買獲得。
[0029]本發(fā)明中所選用的F1，來源于抗病材料與感病自交系雜交獲得，即通過以PI438685父本，“卡拉克賽”為母本，通過常見的雜交技術(shù)手段獲得，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)雜交途徑可以獲得。
[0030]本發(fā)明中所選用的F2，來源于F1自交產(chǎn)生，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)自交途徑可以獲得。
[0031]本發(fā)明以PI438685及其衍生品種或品系為父本或母本與其它甜瓜雜交并繁衍至F2代以上。所述PI438685及其衍生品種或品系，是指以PI438685為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或用別的物理或化學(xué)方法雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素及其它植物染色體加倍試劑加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的甜瓜品種或品系，這些技術(shù)手段均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。
[0032]本發(fā)明篩選用的SSR引物的序列信息來自本實驗室開發(fā)和ICuGI已公開發(fā)表(http://www.1cug1.0rg/cg1-bin/ICuGI/index.cgi)D
[0033]通過實施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達到以下效果:
(I)通過本發(fā)明首次獲得與甜瓜PI438685抗霜霉病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記SSR-
6 6 6 230ο
[0034](2)通過本發(fā)明可以預(yù)測甜瓜植株的霜霉病抗性，快速篩選抗病品種或品系用于甜瓜育種;檢測抗病基因方便快速，而且不受環(huán)境影響。
[0035](3)通過本發(fā)明提供的分子標(biāo)記，輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交回交建立群體，而且要對群體中霜霉病抗性進行單株選擇。對甜瓜霜霉病進行苗期人工接種鑒定，因接種不充分或發(fā)病條件不適宜而影響選擇效率和準(zhǔn)確率。因此抗病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過SSR-666標(biāo)記，只需檢測是否只有唯一 I條230bp的特異性條帶，即可鑒定出是否抗霜霉病，在苗期即能鑒定出抗霜霉病的抗病單株，淘汰其它感病單株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗霜霉病甜瓜的選擇效率。
[0036]附圖簡要說明圖1顯示為引物SSR-666對雙親'F1、構(gòu)建抗感基因池及抗病單株和感病單株的擴增檢測，圖中:M為Ladder DNA, I:PI438685,2:Fi, 3: “卡拉克賽”，4:抗池，5:感池，R:抗病單株，S:感病單株。
[0037]圖2顯示為引物SSR-666對F2單株的擴增檢測圖。
【具體實施方式】
[0038]下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。
[0039]本發(fā)明中設(shè)備和材料有:TC-512型PCR擴增儀(英國Techne公司)、.DYY_12型電腦三恒多用電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司)、JY-SPE型電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、JY04S-3C型數(shù)碼凝膠成像儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，SSR引物、Taq
酶、PCR反應(yīng)試劑盒及其它試劑均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
[0040]本發(fā)明中涉及到的育種材料包括:甜瓜抗霜霉病資源PI438685，經(jīng)遺傳規(guī)律研究分析PI438685攜帶霜霉病抗性基因，抗性基因表現(xiàn)為隱性遺傳，抗源PI438685引自美國農(nóng)業(yè)部國家植物種質(zhì)資源體系，現(xiàn)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜中心保存，抗源PI438685材料本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過引進途徑獲得。甜瓜農(nóng)家品種“卡拉克賽”，為本發(fā)明中所選用的常見農(nóng)家品種“卡拉克賽”，為新疆厚皮甜瓜，易感霜霉病，來源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，新疆種子市場可購買獲得。
[0041 ] 本發(fā)明中，6%聚丙烯凝膠:30%聚丙烯酰胺(29:1) 24mL，10 X TBE 8mL，雙蒸水40mL, APS 650uL，TEMED 80uL。
[0042]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0043]實施例一:與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記
一種與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記具體包括以下步驟:
(I)以感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”為母本，抗病資源PI438685為父本進行雜交，得到雜種F1。
[0044](2)由雜種F1自花授粉獲得F2代群體,F1與“卡拉克賽”雜交獲得回交群體BCs，F(xiàn)gPI438685雜交獲得回交群體BCr。
[0045](3)分別在苗期對PI438685、“卡拉克賽” 'F^BCsjCr和F2進行霜霉病抗病性鑒定。
[0046]霜霉病菌接種液的配備:從田間采集自然發(fā)病的早期病葉，用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，用常見的點接法接種于感病品種的子葉上，之后放入光照培養(yǎng)箱進行擴繁，待子葉背面長出大片黑色霉層后，再用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，攪拌均勻后用血球計數(shù)板計數(shù)分生孢子數(shù)，最終濃度為5X 13/ml個孢子。
[0047]接種:分別選用PI438685、“卡拉克賽”和？!各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F2播種于常見的大棚內(nèi)的消毒營養(yǎng)缽中，待第2片真葉完全展開時，采用噴霧法進行接種，接種濃度為5X 13個/mL，將配制好的霜霉病菌接種菌液均勻噴于整株葉面，接種后黑暗保濕48小時，控制溫度夜間20°C白天25°C，相對濕度90%以上。
[0048]根據(jù)在苗期對PI438685、“卡拉克賽” 'FhBCsdCr和F2進行抗病性鑒定結(jié)果:甜瓜抗霜霉病資源PI438685攜帶霜霉病抗性基因，抗性基因表現(xiàn)為隱性遺傳，PI438685全部抗病，“卡拉克賽”全部感病，F(xiàn)1、BCs全部感病，BCr抗感比接近1:1，F(xiàn)2中抗感比接近1:3，表明抗源PI438685抗性基因為單基因隱性。
[0049](4) F2代抗感基因池的構(gòu)建取抗病和感病的F2代單株各5株等量的DNA，分別混合構(gòu)建抗感基因池;具體先選取表現(xiàn)型為O級抗病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建抗病基因混合池，再選取表現(xiàn)型感病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建感病基因混合池，抗感池最終濃度100ng/mL。
[0050](5)利用公知引物公布的信息，除掉無擴增產(chǎn)物及擴增產(chǎn)物有拖尾現(xiàn)象的引物以夕卜，通過對SSR引物能擴增出有效條帶，利用抗感基因池對引物進行SSR擴增篩選后，只有3對引物在抗感基因池之間擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。
[0051 ] (6)通過對已獲得3對引物SSR-666、SSR-689和SSR699做進一步驗證；以抗病資源PI438685、感病自交系“卡拉克賽”、F1以及用于構(gòu)建抗感基因池的5個抗病F2單株和5個感病F2單株為模版進行PCR驗證，最終引物SSR-666擴增穩(wěn)定，重復(fù)性好，在抗親、抗病基因池和抗病單株上均能擴增出230bp的片段，在感親、感病基因池和感病單株上沒有出現(xiàn)這條特異性條帶，由此推斷引物SSR-666可能與抗源PI438685的抗霜霉病基因存在連鎖關(guān)系，命名SSR-666230 ο
[0052](7)根據(jù)已獲得的分子標(biāo)記ssr-6 6 6 23q，對F2代群體單株擴增檢測，并進行遺傳連鎖分析;用公用的遺傳軟件QTL IciMapping進行遺傳連鎖性分析，以3.0為最小LOD閥值，確定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因與分子標(biāo)記SSR-66623Q緊密連鎖，遺傳連鎖距離為2.66cM0
[0053]本發(fā)明獲得3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699其引物序列為:
SSR-666 5’ GTTCCAATTGGGGAGATG' 3;
5’ CAAATCCAACGATTCATAAAC' 3;
SSR-689 5’ TGTGTGTGTGAGAGAGAGAG' 3;
5’ GTGTTTGCCGATTCTACC’ 3;
SSR-699 5’ CAATCGCAGATACTTCCACG’ 3;
5’ TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT' 3。
[0054]實施例二:與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66623Q的應(yīng)用
本發(fā)明提供與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66623Q的應(yīng)用，通過將分子標(biāo)記SSR-6 6 6 23Q用于甜瓜品種或品系的基因型檢測，用于判斷該品種或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步驟:
(I)以抗病資源PI438685與其他甜瓜雜交并繁衍至內(nèi)代以上。
[0055](2)對通過步驟(I)獲得的甜瓜單株提取基因組DNA，用SSR-66623Q這個標(biāo)記進行PCR擴增，檢測是否只有唯一的230bp特異性條帶出現(xiàn)，如只有這條特異性條帶出現(xiàn)，則預(yù)測甜瓜植株抗霜霉病。
[0056]實施例三:與甜瓜抗霜霉病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記SSR-66623Q的獲得。
[0057](I)將抗病材料PI438685為父本和新疆厚皮甜瓜“卡拉克賽”為母本進行雜交獲得Fi，交產(chǎn)生F2，F(xiàn)API438685雜交得到BCr,F1與“卡拉克賽”雜交得到BCs。通過對雙親、FuF^BC^BCs進行人工接種并統(tǒng)計各個單株的發(fā)病情況= BCsJ1和“卡拉克賽”全部表現(xiàn)感病，PI438685表現(xiàn)抗病，BCr中抗病與感病比例約等于1:1 ,F2R分離群體統(tǒng)計表明，197株群體中，53株表現(xiàn)抗病，144株表現(xiàn)感病，抗感比符合1:3，所以確定PI438685抗霜霉病基因為單基因隱性。
[0058](2)接種霜霉病和病害分級:采用分生抱子懸浮液噴霧接種和6級病害分級的方法，用微型噴霧器噴灑抱子懸浮液，抱子懸浮液濃度為5 X 13個-mL.1，噴到植株葉片開始滴水為止;接種后用小拱棚保濕，相對濕度90%以上，3d后揭開小拱棚，7d后調(diào)查統(tǒng)計病情。根據(jù)植株莖部病害進行分級并記錄個體抗感表型。
[0059]O級無任何病癥；
I級病斑面積占整個葉片面積的<1/10;
2級病斑面積占整個葉片面積的1/10-1/4;
3級病斑面積占整個葉片面積的1/4-1/2;
4級病斑面積占整個葉片面積的1/2-3/4;
5級葉上病斑基本布滿，病斑面積占整個葉片面積的>3/4;
上述采用的鑒定方法參照常見的翁祖信等(1989)的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)，以葉片背面霉層的覆蓋面積為統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)。病害級別為0、1和2的個體記錄為抗病，病害級別為3、4和5的個體記錄為感病。
[0060](3)基因組DNA的提取和DNA池的構(gòu)建:基因組DNA提取采用CTAB法。利用Q3000 UVDNA Analizer測定F2單株DNA濃度，利用BSA法取5個抗病單株和5個感病單株的DNA等量混合，構(gòu)建成抗感池用于SSR引物的多態(tài)性篩選；用于篩選多態(tài)性的引物序列見ICuGI網(wǎng)站http://www.1cug1.0rg/cg1-bin/ICuGI/misc/download.cgi。
[0061 ] (4)SSR-PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL; 1mmol /mL正向和反向引物各)1.0uL;模板 DNA (30ng.uL—Ml.0u L ; ddH20 13uL，共 20 uL PCR 擴增在 TC-512 擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸10min，4°C保存。
[0062](5)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測:取1uLPCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V穩(wěn)定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀拍照片。
[0063](6)連鎖性分析:利用QTL IciMapping軟件對F2代分離群體單株的標(biāo)記和抗型表現(xiàn)數(shù)據(jù)進行遺傳連鎖分析，并利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距(CM)，采用QTLIci Mapping軟件對獲得的SSR標(biāo)記和抗病基因之間的遺傳關(guān)系進行連鎖分析，結(jié)果表明:該標(biāo)記與抗性基因存在連鎖關(guān)系，其遺傳連鎖距離為2.66cM，定名為SSR-6 6 6 230。
[0064]實施例四:引物SSR-666對雙親的擴增檢測
以雙親PI438685和“卡拉克賽”的基因組DNA為模板，用引物SSR-666進行擴增，SSR-PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL; 1mmol /mL正向和反向引物各)I.0uL;模板DNA (30ng.uL—Ol.0uL ; CldH2O 13uL，共20 uL。PCR擴增在TC-512擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸1min，4°C保存。
[0065]取1uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V恒定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀檢測，抗源PI438685能擴增出一條約230bp的條帶，而感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”在同一位置則沒有擴增出條帶。
[0066]實施例五:引物331?-666對?1的擴增檢測。
[0067]以雜種基因組DNA為模板，用引物SSR-666進行擴增，PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL;10mmol /mL正向和反向引物各)1.0 uL;模板DNA (30ng.uL-1) 1.0u L ; ddfeO13uL，共20 uLo PCR擴增在TC-512擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸1min，4°C保存。取1uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V恒定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀檢測,F1能擴增出抗源PI438685的特異性的230bp條帶和感病自交系“卡拉克賽”在另一位置的條帶。
[0068]實施例六:引物SSR-666對F2的擴增檢測。
[0069]以197株?2群體各單株的基因組DNA為模板，用引物SSR-666進行擴增，PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL;10mmol /mL正向和反向引物各)1.0 uL;模板DNA (30ng.uL—”I.0uL ;ddH20 13uL，共20 ULt3PCR擴增在TC-512擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸10min，4°C保存。取1uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V恒定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀檢測。F2群體中50個單株只能擴增出I條約230bp的抗病特異性條帶，49個單株只能擴增出I條感病特異性條帶，90個單株能同時擴增出2條帶，無擴增條帶8株。
[0070]實施例七:引物SSR-666對5個抗病F2單株的擴增檢測。
[0071]以構(gòu)建抗病基因混合池的5個抗病F2單株的基因組DNA為模板，用引物SSR-666進行擴增，PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL； 1mmol /mL正向和反向引物各)1.0 uL；模板DNA(30ng.uL—1H-Ou L ;ddH20 13uL，共20 uLJCR擴增在TC-512擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸10min，4°C保存。取1uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V恒定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀檢測。5個單株均能只擴增出I條230bp的特異性條帶。
[0072]實施例八:引物SSR-666對5個感病F2單株的擴增檢測。
[0073]以構(gòu)建感病基因混合池的5個感病F2單株的基因組DNA為模板，用引物SSR-666進行擴增，PCR反應(yīng)體系為:5XPCR反應(yīng)液4uL； 1mmol /mL正向和反向引物各)1.0 uL；模板DNA(30ng.uL—1H-Ou L ;ddH20 13uL，共20 uLJCR擴增在TC-512擴增儀(TECHNE)上進行，反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，進行35個循環(huán)，在72°C下繼續(xù)延伸10min，4°C保存。取1uL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1.5uL嗅酚藍(0.25 % )混合，點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠中，以I X TBE為電泳緩沖液，在120V恒定電壓下電泳1.5h左右。用JY04S-3C數(shù)碼凝膠成像儀檢測。5個單株在同一位置均沒有擴增出條帶。
[0074]實施例九:育種材料抗病基因檢測
以甜瓜資源PI438685為親本的F2, F3后代群體播種后，取植株子葉或葉片提取基因組DNA，用引物SSR-666進行PCR擴增及電泳檢測，擴增和檢測方法為同上，表現(xiàn)抗病的植株能夠擴增出唯一 I條230bp特異性條帶，而表現(xiàn)感霜霉病的植株在同一位置不能擴增出條帶，或是擴增出2條帶，其中一條是抗病特異性條帶，另一條是感病特異性條帶。從提取基因組DNA到得到鑒定結(jié)果，在試驗室內(nèi)只需要1-2個工作日即可完成。
[0075]通過傳統(tǒng)方法鑒定是否攜帶抗霜霉病基因，則需要將待鑒定的甜瓜與PI438685先雜交得到?工，再自交和回交構(gòu)建FdPBC，群體，結(jié)合人工接種甜瓜霜霉病菌，根據(jù)抗感表現(xiàn)型的遺傳分離規(guī)律才能得到鑒定結(jié)果。每個雜交、自交和回交組合按照200個單株計算，至少需要種植1000株群體植株并進行人工接種蔓枯病菌。按照甜瓜一個生長季節(jié)100天計算，傳統(tǒng)方法鑒定至少需要200天后，才能鑒定出是否攜帶抗霜霉病基因。
[0076]通過上述系列實施例提供的試驗驗證，本發(fā)明首次獲得與甜瓜PI438685抗霜霉病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記SSR-66623Q，可以預(yù)測甜瓜植株的霜霉病抗性，快速篩選抗病品種或品系用于甜瓜育種，檢測抗病基因方便快速，鑒定方便，而且不受環(huán)境影響。
[0077]通過上述系列實施例提供的試驗驗證，本發(fā)明通過提供的分子標(biāo)記，輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交回交建立群體，而且要對群體中霜霉病抗性進行單株選擇。對甜瓜霜霉病進行苗期人工接種鑒定，因接種不充分或發(fā)病條件不適宜而影響選擇效率和準(zhǔn)確率。因此抗病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過SSR-666標(biāo)記，只需檢測是否只有唯一I條230bp的特異性條帶，即可鑒定出是否抗霜霉病，在苗期即能鑒定出抗霜霉病的抗病單株，淘汰其它感病單株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗霜霉病甜瓜的選擇效率。
[0078]上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1.一種與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物SSR-666，其引物序列為: SSR-666 5’ GTTCCAATTGGGGAGATG' 3; 5’ CAAATCCAACGATTCATAAAC' 3。2.—種與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66623Q，其特征在于，包括以下步驟: (1)以感病農(nóng)家品種“卡拉克賽”為母本，抗病資源PI438685為父本進行雜交，得到雜種F1; (2)由雜種F1自花授粉獲得F2代群體，F(xiàn)1與“卡拉克賽”雜交獲得回交群體BCs，F(xiàn)1與PI438685雜交獲得回交群體BCr; (3)分別在苗期對PI438685、“卡拉克賽”、F^BCsjCjPF2進行霜霉病抗病性鑒定； 根據(jù)在苗期對PI438685、“卡拉克賽”、FhBC^BCjPF2進行抗病性鑒定結(jié)果:甜瓜抗霜霉病資源PI438685攜帶霜霉病抗性基因，抗性基因表現(xiàn)為隱性遺傳，PI438685全部抗病，“卡拉克賽”全部感病，BCs全部感病，BCr抗感比接近I: I，F(xiàn)2中抗感比接近1: 3，表明抗源PI438685抗性基因為單基因隱性； (4)抗感基因池的構(gòu)建:F2代中選取取極端抗病和極端感病的單株各5株，等量的基因組DNA分別混合構(gòu)建抗感基因池;具體先選取表現(xiàn)型為O級抗病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建抗病基因混合池，再選取表現(xiàn)型感病的5個單株，吸取等量的基因組DNA，構(gòu)建感病基因混合池，抗感池最終濃度I OOng/mL; (5)利用公知引物公布的信息，分別以抗感基因池為模版進行PCR擴增，經(jīng)過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，初步篩選出在抗、感基因池間存在多態(tài)性的SSR引物18對，經(jīng)過幾次重復(fù)實驗，只有3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之間能穩(wěn)定擴增出多態(tài)性條帶； (6)通過對已獲得3對引物SSR-666、SSR-689和SSR-699做進一步驗證；以抗病資源PI438685、感病自交系“卡拉克賽”、F1以及用于構(gòu)建抗感基因池的5個抗病F2單株和5個感病?2單株為模版進行PCR驗證，最終引物SSR-666擴增穩(wěn)定，重復(fù)性好，在抗親、抗病基因池和抗病單株上均能擴增出230bp的片段，在感親、感病基因池和感病單株上沒有出現(xiàn)這條特異性條帶，由此推斷引物SSR-666可能與抗源PI438685的抗霜霉病基因存在連鎖關(guān)系，命名SSR-6 6 6 230； (7)根據(jù)已獲得的分子標(biāo)記SSR-66623Q，對F2代群體單株擴增檢測，并進行遺傳連鎖分析;用遺傳軟件進行遺傳連鎖性分析，以3.0為最小LOD閥值，確定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因與分子標(biāo)記SSR-66623Q緊密連鎖，遺傳連鎖距離為2.66cM。3.如權(quán)利要求2所述的與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66 6 23Q，其特征在于，所述的霜霉病抗病性鑒定中，霜霉病菌接種液的配備:從田間采集自然發(fā)病的早期病葉，用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，用常見的點接法接種于感病品種的子葉上，之后放入光照培養(yǎng)箱進行擴繁，待子葉背面長出大片黑色霉層后，再用軟毛刷刷取葉背面的孢子囊，置于盛有無菌水的燒杯中，攪拌均勻后用血球計數(shù)板計數(shù)分生孢子數(shù)，最終濃度為5 X 103/ml個孢子。4.如權(quán)利要求2所述的與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-66 6 23Q，其特征在于，所述的霜霉病抗病性鑒定中，接種分別選用PI438685、“卡拉克賽”和？1各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒^播種于常見的大棚內(nèi)的消毒營養(yǎng)缽中，待第2片真葉完全展開時，采用噴霧法進行接種，接種濃度為5 X 13個/mL，將配制好的霜霉病菌液均勻噴于整株葉面，接種后黑暗保濕48小時，控制溫度夜間20°C白天25°C，相對濕度90%以上。5.如權(quán)利要求2所述的與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SSR-6 6 6 23Q的應(yīng)用，其特征在于，通過將分子標(biāo)記SSR-6 6 623Q用于甜瓜品種或品系的基因型檢測，用于判斷該品種或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步驟: (1)以抗病資源PI438685與其他甜瓜雜交并繁衍至內(nèi)代以上； (2)對通過步驟(I)獲得的甜瓜單株提取基因組DNA，用SSR-66623Q這個標(biāo)記進行PCR擴增，檢測是否只有唯一的230bp特異性條帶出現(xiàn)，如只有這條特異性條帶出現(xiàn)，則預(yù)測甜瓜植株抗霜霉病。
【文檔編號】C12Q1/68GK105821135SQ201610282180
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】張學(xué)軍, 李寐華, 楊永, 張紅, 張永兵, 伊鴻平, 王豪杰
【申請人】新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心