凡納濱對蝦Na,K?ATPaseα亞基基因及SNP標記篩查的擴增引物和方法與流程

文檔序號：11672605閱讀：482來源：國知局

技術領域：

本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術領域，具體涉及凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標記篩查的擴增引物和方法。

背景技術：
：

凡納濱對蝦(litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，原產(chǎn)于南美洲，從墨西哥西南沿海至秘魯西部的太平洋沿岸均有分布，是全世界產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖對蝦。在我國，凡納濱對蝦養(yǎng)殖區(qū)域遍布于全國沿海的海水養(yǎng)殖區(qū)和內(nèi)陸的淡水養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖面積約25萬公頃，年產(chǎn)量超過100萬噸，海水養(yǎng)殖區(qū)和淡水養(yǎng)殖區(qū)產(chǎn)量各約占50％，年產(chǎn)值300-400億元人民幣，是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。凡納濱對蝦在海水和淡水中均能成活，這與其強大的滲透壓調(diào)節(jié)能力有著密切的關系，而在凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)過程中滲透壓調(diào)節(jié)基因起著至關重要的作用。

在滲透壓調(diào)節(jié)基因中，na,k-atpase基因的作用尤為突出。na,k-atpase是有機體賴以生存的重要膜蛋白，參與細胞兩側(cè)na⁺、k⁺離子的跨膜主動運輸，在維持細胞的膜電位及細胞內(nèi)外的滲透壓平衡，為細胞轉(zhuǎn)運無機離子和營養(yǎng)物質(zhì)以及排出代謝產(chǎn)物提供驅(qū)動力等方面起重要作用。na,k-atpase基因是甲殼動物重要的滲透壓調(diào)節(jié)基因，研究顯示在低鹽度應激后凡納濱對蝦組織中na,k-atpase基因的表達量顯著上調(diào)，表明na,k-atpase基因是一個與凡納濱對蝦鹽度抗逆相關的功能基因，可望用于凡納濱對蝦耐低鹽分子標記的開發(fā)，加快凡納濱對蝦耐低鹽優(yōu)良品種的選育進程。

在國際上，以分子標記為基礎的分子標記輔助選育技術已成為當代水產(chǎn)育種的關鍵技術。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)即snp，是指由基因組單核苷酸變異(包括堿基轉(zhuǎn)換、顛換、單堿基插入或缺失等)所引起的dna序列多態(tài)性，是最新的第三代dna分子標記。因其具有數(shù)量巨大、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、測定準確簡便、能顯示其他技術無法檢測的隱藏多態(tài)性以及可能與基因功能相關的眾多優(yōu)點，在親子鑒定和分子標記輔助育種中得到廣泛應用。迄今，利用凡納濱對蝦功能基因已經(jīng)開發(fā)了多個與性狀相關的snp標記，如在凡納濱對蝦α淀粉酶(amy)基因上發(fā)現(xiàn)了4個與凡納濱對蝦生長性狀顯著相關的snp位點，在熱休克蛋白60(hsp60)家族成員tcp-1的同源基因tcp-1-eta基因上發(fā)現(xiàn)了1個與凡納濱對蝦耐寒性狀相關的snp位點，在凡納濱對蝦過氧化氫酶(cat)基因上發(fā)現(xiàn)了1個與對蝦抗wssv性狀顯著相關的snp位點。但尚未有與凡納濱對蝦耐低鹽性狀相關的snp分子標記的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標記篩查的擴增引物和方法。利用凡納濱對蝦鹽度抗逆相關功能基因開發(fā)snp標記，為進一步篩選與凡納濱對蝦鹽度抗逆相關的snp標記和開發(fā)用于凡納濱對蝦親子鑒定的分子標記奠定基礎，從而加快凡納濱對蝦抗逆優(yōu)良品種的選育進程。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明以通過ncbi獲得的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列為基礎，設計引物進行該基因全基因序列的獲取，并針對所獲得的na,k-atpaseα亞基的全基因序列進行snp位點篩查，開發(fā)凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因的snp標記，并提供snp位點擴增引物，建立凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標記開發(fā)的技術體系，為進一步篩選與凡納濱對蝦鹽度抗逆相關的snp標記和開發(fā)用于凡納濱對蝦親子鑒定的分子標記奠定基礎。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因擴增引物，包括12對擴增引物：

引物對1：glvnk-f1：5’-cacagacggtgaagaatg-3’；

glvnk-r1：5’-tgggaccttgtgctcatc-3’；

引物對2：glvnk-f2：5’-tggaacttgatgagcacaa-3’；

glvnk-r2：5’-ggcaatgaagcagaggata-3’；

引物對3：glvnk-f3：5’-ctcctgctgtggattggc-3’；

glvnk-r3：5’-atgagaagacgcctgtga-3’；

引物對4：glvnk-f4：5’-ggagcccaacaaggacaa-3’；

glvnk-r4：5’-gacagcattggtggagaa-3’；

引物對5：glvnk-f5：5’-ttctccaccaatgctgtc-3’；

glvnk-r5：5’-ggctacaatgataccaatgag-3’；

引物對6：glvnk-f6：5’-tgttgtgttcctcattggt-3’；

glvnk-r6：5’-cagtctcgtggatggatac-3’；

引物對7：glvnk-f7：5’-caagtatccatccacgaga-3’；

glvnk-r7：5’-agcctttgcttcagtggg-3’；

引物對8：glvnk-f8：5’-attcccatcaaggaggtt-3’；

glvnk-r8：5’-ggatgttagatgtcagggt-3’；

引物對9：glvnk-f9：5’-cctgacatctaacatccctgag-3’；

glvnk-r9：5’-gcttgtcggtgaatgggt-3’；

引物對10：glvnk-f10：5’-cctgccatttcccttgcc-3’；

glvnk-r10：5’-cgctcacggagaccaaag-3’；

引物對11：glvnk-f11：5’-atcatggctgagaacggcttcc-3’；

glvnk-r11：5’-tggagaacggaagagcag-3’；

引物對12：glvnk-f12：5’-ttccgttctccatcctta-3’；

glvnk-r12：5’-atggagcagtagttgacc-3’。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因的擴增方法，包括以下步驟：以凡納濱對蝦基因組dna為模板，分別以上述的引物對glvnk-f1/glvnk-r1、glvnk-f2/glvnk-r2、glvnk-f3/glvnk-r3、glvnk-f4/glvnk-r4、glvnk-f5/glvnk-r5、glvnk-f6/glvnk-r6、glvnk-f7/glvnk-r7、glvnk-f8/glvnk-r8、glvnk-f9/glvnk-r9、glvnk-f10/glvnk-r10、glvnk-f11/glvnk-r11和glvnk-f12/glvnk-r12作為擴增引物進行pcr擴增，分別得到擴增產(chǎn)物，然后對擴增產(chǎn)物進行測序，然后再進行序列拼接，獲得凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列。

所述的pcr擴增，其反應體系優(yōu)選為25μl，包括：不含mg²⁺的10×pcrbuffer2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μllataq酶0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由無菌水補足至25μl。

所述的pcr擴增，其反應程序優(yōu)選為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標記篩查的擴增引物，包括13對擴增引物：

引物對13：lvnk001-lvnk011-f：5’-tggaacttgatgagcacaa-3’；

lvnk001-lvnk011-r：5’-ggcaatgaagcagaggata-3’；

引物對14：lvnk012-lvnk023-f：5’-ctcctgctgtggattggc-3’；

lvnk012-lvnk023-r：5’-gactttgcctcctgatag-3’；

引物對15：lvnk024-lvnk027-f：5’-ggcgtcttctcctactatca-3’；

lvnk024-lvnk027-r：5’-aaagcaaagggaaagtga-3’；

引物對16：lvnk028-lvnk030-f：5’-gcagttgtacctgggcattg-3’；

lvnk028-lvnk030-r：5’-gacagcattggtggagaa-3’；

引物對17：lvnk031-lvnk036-f：5’-ttctccaccaatgctgtc-3’；

lvnk031-lvnk036-r：5’-ggctacaatgataccaatgag-3’；

引物對18：lvnk037-lvnk039-f：5’-tgttgtgttcctcattggt-3’；

lvnk037-lvnk039-r：5’-aggtaggcattgttgaaag-3’；

引物對19：lvnk040-lvnk042-f：5’-attcccatcaaggaggtt-3’；

lvnk040-lvnk042-r：5’-ggatgttagatgtcagggt-3’；

引物對20：lvnk043-lvnk046-f：5’-cattgcttacaccctgac-3’；

lvnk043-lvnk046-r：5’-cagggaatgaacttgtagg-3’；

引物對21：lvnk047-lvnk052-f：5’-tatttaggtgcctgccattt-3’；

lvnk047-lvnk052-r：5’-aggacgaaataagtgggt-3’；

引物對22：lvnk053-lvnk055-f：5’-tcgtttagtttacccact-3’；

lvnk053-lvnk055-r：5’-tgtggctatgtagatgga-3’；

引物對23：lvnk056-lvnk063-f：5’-ttcagaagggatttcgtc-3’；

lvnk056-lvnk063-r：5’-gtccatagtgatcctcca-3’；

引物對24：lvnk064-lvnk074-f：5’-acaacaggctcatctcaa-3’；

lvnk064-lvnk074-r：5’-ctggtggacaatggagtt-3’；

引物對25：lvnk075-lvnk078-f：5’-gccgtaactccattgtcc-3’；

lvnk075-lvnk078-r：5’-tggagaacggaagagcag-3’。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標記的篩查方法，包括以下步驟：分別以若干個不同來源的凡納濱對蝦基因組dna為模板，分別以上述的引物對lvnk001-lvnk011-f/lvnk001-lvnk011-r、lvnk012-lvnk023-f/lvnk012-lvnk023-r、lvnk024-lvnk027-f/lvnk024-lvnk027-r、lvnk028-lvnk030-f/lvnk028-lvnk030-r、lvnk031-lvnk036-f/lvnk031-lvnk036-r、lvnk037-lvnk039-f/lvnk037-lvnk039-r、lvnk040-lvnk042-f/lvnk040-lvnk042-r、lvnk043-lvnk046-f/lvnk043-lvnk046-r、lvnk047-lvnk052-f/lvnk047-lvnk052-r、lvnk053-lvnk055-f/lvnk053-lvnk055-r、lvnk056-lvnk063-f/lvnk056-lvnk063-r、lvnk064-lvnk074-f/lvnk064-lvnk074-r、lvnk075-lvnk078-f/lvnk075-lvnk078-r作為擴增引物進行pcr擴增，分別得到擴增產(chǎn)物，然后對擴增產(chǎn)物進行測序，將每對引物擴增模板得到的擴增產(chǎn)物的測序圖作為一組進行比較，篩查得到snp位點。

所述的pcr擴增，其反應體系優(yōu)選為25μl，包括：不含mg²⁺的10×pcrbuffer2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μl高保真pcr酶0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由無菌水補足至25μl。

所述的pcr擴增，其反應程序優(yōu)選為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。

所述的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因有78個snp位點，分別為seqidno.2所示核苷酸序列自5’端起第672位堿基是a或g、第711位堿基是t或c、第752位堿基是a或g、第773位堿基是a或c、第785位堿基是t或c、第796位堿基是a或t、第813位堿基是a或t、第846位堿基是t或c、第860位堿基是a或g、第865位堿基是t或c、第902位堿基是t或c、第1106位堿基是a或t、第1142位堿基是t或c、第1155位堿基是t或c、第1207位堿基是a或g、第1210位堿基是a或g、第1213位堿基是a或t、第1436位堿基是a或t、第1439位堿基是t或g、第1488位堿基是g或c、第1542位堿基是a或t、第1547位堿基是t或g、第1652位堿基是t或c、第1852位堿基是a或g、第1954位堿基是a或t、第1980位堿基是a或c、第1985位堿基是a或g、第2743位堿基是a或t、第2753位堿基是t或g、第2855位堿基是t或c、第3032位堿基是t或c、第3034位堿基是a或g、第3078位堿基是a或g、第3326位堿基是a或t、第3368位堿基是a或c、第3466位堿基是a或t、第3912位堿基是t或c、第4029位堿基是t或c、第4041位堿基是t或c、第4548位堿基是a或g、第4677位堿基是t或c、第4754位堿基是a或t、第5221位堿基是a或t、第5222位堿基是a或t、第5641位堿基是t或c、第5650位堿基是a或t、第8384位堿基是a或g、第8454位堿基是a或g、第8507位堿基是a或g、第8520位堿基是a或t、第8559位堿基是t或g、第8593位堿基是a或g、第8796位堿基是t或g、第8827位堿基是a或t、第8838位堿基是t或c、第10799位堿基是t或g、第10903位堿基是t或c、第10942位堿基是a或t、第10965位堿基是a或c、第11008位堿基是t或c、第11030位堿基是t或g、第11057位堿基是a或c、第11217位堿基是a或t、第11267位堿基是t或c、第11272位堿基是a或g、第11289位堿基是t或g、第11290位堿基是t或c、第11298位堿基是t或c、第11299位堿基是a或t、第11300位堿基是a或t、第11309位堿基是t或c、第11312位堿基是t或g、第11375位堿基是a或g、第11388位堿基是t或c、第11649位堿基是a或g、第11663位堿基是a或t、第11678位堿基是t或c、第11689位堿基是a或t。

本發(fā)明從ncbi中獲得凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列(genbank：kf765670.1)，并基于該序列設計12對引物，通過pcr擴增、測序及序列拼接，獲得全長為12452bp的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列。針對所獲得的na,k-atpaseα亞基的全基因序列分段設計引物，采用不同來源的凡納濱對蝦基因組dna模板進行pcr擴增，通過測序方法進行snp位點篩查，共獲得78個snp位點。本發(fā)明建立了凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標記開發(fā)的技術體系，為進一步篩選與凡納濱對蝦鹽度抗逆相關的snp標記和開發(fā)用于凡納濱對蝦親子鑒定的分子標記奠定基礎，從而加快凡納濱對蝦抗逆優(yōu)良品種的選育進程。

附圖說明：

圖1是凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因結(jié)構圖；其中，數(shù)字代表核苷酸數(shù)，淺灰色代表外顯子，深灰色代表內(nèi)含子。

具體實施方式：

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法或者按照試劑盒說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。克隆測序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。

1、凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基完整基因序列的獲取

1.1凡納濱對蝦基因組dna的提取

取凡納濱對蝦肌肉組織，采用海洋動物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對蝦基因組dna，操作步驟嚴格按照說明書進行?；蚪Mdna定量采用nanodroptm2000分光光度計完成，質(zhì)量采用瓊脂糖電泳來檢測。

1.2pcr引物設計

以從ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中獲得的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列(genbank：kf765670.1)為基礎，設計引物用以獲取na,k-atpaseα亞基的全基因序列。引物設計的要求為：引物長度18-22bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構及錯配等。共設計和合成12對pcr引物，引物序列見表1：

表1用于凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列獲取的引物及擴增產(chǎn)物特征

注：括號中的數(shù)字表示引物序列對應于凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基mrna序列(genbank:kf765670.1)的核苷酸位置

1.3pcr擴增、測序及序列拼接

以上述提取的凡納濱對蝦基因組dna為模板，分別采用表1中設計的12對引物對該dna進行pcr擴增，反應體系25μl，包括：10×pcrbuffer(withoutmg²⁺)2.5μl、mgcl2(25mm)2.0μl，dntp(10mm)0.5μl、lataq酶(5u/μl)0.2μl、正向引物(10μm)0.5μl、反向引物(10μm)0.5μl、dna模板(25ng/μl)0.5μl、無菌水18.3μl。反應程序為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，顯示該12對引物均能穩(wěn)定擴增出單一條帶。對擴增產(chǎn)物分別進行克隆測序，結(jié)果顯示有4對引物擴增出目的核苷酸序列，有8對引物的擴增產(chǎn)物除包含目的核苷酸序列外，還包含內(nèi)含子序列。將測序結(jié)果進行序列拼接，獲得全長為12452bp的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列(如seqidno.1所示)，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成(圖1)。

2、凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的全基因序列snp位點篩查

2.1不同來源凡納濱對蝦基因組dna的提取

選取來自于廣東深圳、珠海、湛江、徐聞和茂名等地24個養(yǎng)殖場的凡納濱對蝦24尾，分別取肌肉組織，采用海洋動物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對蝦基因組dna，操作步驟嚴格按照說明書進行?；蚪Mdna定量采用nanodroptm2000分光光度計完成，質(zhì)量采用瓊脂糖電泳來檢測。

2.2pcr引物設計

以本研究中獲得的凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)為基礎分段設計引物。引物設計的要求為：引物長度18-22bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構及錯配等。共設計和合成25對pcr引物，引物序列見表2：

表2用于凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列snp位點篩查的引物及擴增產(chǎn)物特征

注：括號中的數(shù)字表示引物序列對應于凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)的核苷酸位置

2.3snp位點的篩查及snp位點基因型分析

以步驟2.1提取的24個凡納濱對蝦基因組dna為模板，分別采用表2中的25對引物進行pcr擴增。反應體系和反應程序與步驟1.3中所述基本一致，不同點在于：用于篩選snp位點的pcr體系中以高保真pcr酶(hsdnapolymerase)替代了lataq酶，72℃延伸由2分鐘降為1分鐘。pcr擴增產(chǎn)物先用2％瓊脂糖電泳進行檢測，然后采用3730xl測序儀進行測序。將每對引物擴增24個樣品所獲得的擴增產(chǎn)物的測序圖作為一組進行比較以篩查snp位點，在15對引物的擴增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了snp位點(見表2)，共篩查到78個snp位點，這78個snp位點在seqidno.2所示序列(加粗的部分為內(nèi)含子序列；snp位點為帶下劃線的混合堿基，其中r代表a或g，y代表c或t，m代表a或c，k代表g或t，s代表c或g，w代表a或t)中的位置及snp位點的基因型及基因型頻率詳見表3。

表3凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列中的snp位點及基因型特征

序列表

<110>中國科學院南海海洋研究所

<120>凡納濱對蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標記篩查的擴增引物和方法

<160>4

<210>1

<211>12452

<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

<400>1

gtcgtgaagcgcgcgtcgtcgagatcggacgtgccgctgtgccctttagtgtcgaccaac60

aaacacttcacagacggtgaagaatgtgcttgtagcgaaaacctacacaggtcctagagg120

gcaacattaagggagtgaacgagtgtacaaagtgaagcctagtggcttgtacataagtgt180

gtatatacagtgattgttggtgctggtttgagagccagcgcgtcgccgttgttcgtggat240

actgtgtatcctctgctgccgtcctcctgctgagcgccgagtgtcgcctcttcagcagcc300

atggccgatacgggcagaacagattcgtatcgacacgccacggatcgtaccatccccgac360

gataaccgaacagtgaaaggggatcctaagtctaagaaaaagccccagaaggctaaaggg420

aagaagggagataaggatttgaatgatctgaagcaggagttggaacttgatgagcacaag480

gtcccaattgaggaactctttcaacgtctcactgttaacccagacacagtaggtttaccc540

gagttctttgtagtatccttggtatattgcctaaattaagagtattggtaagatttaatc600

caatagcgacagggaaggaattttgggaaagtgggttaaggagaagtgtacattagcgtg660

cacagctctgcgcattgggtgattctccagctattttttgtaattacttgttatgattta720

atctaaaatcacctgtcgctaataggttagaatagatctttaagagtagatacacgcaga780

taaccctcaaaaataaatcaaatgtaattcttacttgtgtactttaattacaaggtgttt840

ttctgccttgaacatgactaaccactcctataaccttgcagggtctatcacaaagtgagg900

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<212>dna

<213>凡納濱對蝦（litopenaeusvannamei）

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