本發(fā)明屬于分子生物學(xué)dna標(biāo)記技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及榧樹(torreyagrandis)轉(zhuǎn)錄組序列的est(expresssequencetag-simplesequencerepeat，表達(dá)序列標(biāo)簽)-ssr(簡單序列重復(fù))標(biāo)記的特異引物及篩選方法，屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

榧樹(torreyagrandis)隸屬于榧屬(torreyaarn)，全世界榧屬植物共有7種2變種，包括佛羅里達(dá)榧(torreyataxifolia)、加州榧(torreyacalifornica)、日本榧(torreyanucifera)、榧樹(torreyagrandis)、巴山榧(torreyafargesii)、四川榧(torreyaparvifolia)云南榧(torreyafargesiivar.yunnanensis)和九龍山榧(torreyagrandisfort.exlind.var.jiulongshanensis)，榧樹是我國分布最廣、栽培利用歷史最久、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的樹種之一。榧樹物種種內(nèi)性狀變異復(fù)雜，有許多自然變異類型，也包含人工栽培的香榧品種。香榧具有性狀穩(wěn)定、品質(zhì)優(yōu)良(種仁含油量達(dá)65％左右，不飽和脂肪酸達(dá)80％以上)等特點(diǎn)。但目前香榧生產(chǎn)中存在著栽培品種單一、品種退化等突出問題，同時(shí)香榧童期長，采用常規(guī)雜交育種手段進(jìn)行良種選育一般需要十幾年乃至幾十年的時(shí)間，這極大地阻礙了香榧良種選育、新品種創(chuàng)制。因此，開發(fā)香榧及其榧樹種內(nèi)不同類型的分子遺傳標(biāo)記，檢測遺傳多樣性、研究遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)施分子輔助育種，對于縮短育種進(jìn)程，提高育種效率都具有十分重要的意義。

ssr是廣泛存在于真核和原核生物基因組中的遺傳標(biāo)記，具有共顯性、覆蓋性廣、信息量大、操作簡單等優(yōu)勢。已廣泛應(yīng)用于蘋果、櫻桃、柑橘、葡萄等果樹中。傳統(tǒng)的ssr引物主要從基因組文庫中獲得，其步驟復(fù)雜、工作量大，開發(fā)成本高。近年來，高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展，est-ssr(微衛(wèi)星)是ests測序計(jì)劃的副產(chǎn)物，開發(fā)成本較低，共顯性遺傳，多態(tài)性高，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，是目前最適合用于種質(zhì)鑒定分析的標(biāo)記技術(shù)之一。在榧屬植物分子標(biāo)記開發(fā)方面，金則新等建立了長葉榧issr-pcr的反應(yīng)體系，梁丹等人建立了香榧aflp實(shí)驗(yàn)體系并利用aflp進(jìn)行了榧樹雌雄株的鑒定，劉浩凱等利用srap技術(shù)研究了雌性榧樹4個(gè)居群的遺傳多樣性，戴正等用rapd和scar標(biāo)記鑒定了香榧幼苗的性別，張黨權(quán)等利用rapd將榧樹的幾個(gè)栽培品種進(jìn)行了分類。yi等基于1棵香榧樹的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從4600條unigene中獲得1713個(gè)ssr位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了108對引物，其中37對引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，19對引物在供試樣品中檢測到多態(tài)性。另外，由于est是功能基因的表達(dá)片段，在其中發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星標(biāo)記具有直接標(biāo)記功能基因的優(yōu)勢，并可能同一些生產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)，這對遺傳圖譜構(gòu)建以及分子輔助育種都有很高的應(yīng)用價(jià)值。

利用‘細(xì)榧’和圓榧種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行的ssr引物標(biāo)記與開發(fā)，可能把香榧重要經(jīng)濟(jì)性狀與之關(guān)聯(lián)，達(dá)到分子輔助育種的目的，并可進(jìn)一步進(jìn)行香榧功能基因的研究。目前還未見榧屬種間及榧樹種內(nèi)不同類型est-ssr標(biāo)記的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于細(xì)榧種子轉(zhuǎn)錄組序列和圓榧種子轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的est-ssr特異引物，基于細(xì)榧種子轉(zhuǎn)錄組序列和圓榧種子轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的est-ssr特異引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可有效用于榧屬種間及榧樹種內(nèi)不同類型遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究領(lǐng)域。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案：

發(fā)明人首先提供了榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記特異引物，所述的特異引物分別為：

zafu-1：

f:ggctatgctacacccaaagaa(seqidno.1)，

r：ggggcaccacctattgtatg(seqidno.2)；

zafu-2：

f：tcaaagtgcaaccggtacaa(seqidno.3)，

r:caacaggccaacatggagta(seqidno.4)；

zafu-3：

f：gggttacccccttgctttat(seqidno.5)，

r:ccctactttatttccgtgcg(seqidno.6)；

zafu-4：

f：gaattcccattcccattgtg(seqidno.7)，

r:acccccttctgctctgattt(seqidno.8)；

zafu-5：

f：aatgaatgcgtgttacgctg(seqidno.9)，

r:ttggagcggaaggaataatg(seqidno.10)；

zafu-6：

f:ccaatttgtggagcgtttct(seqidno.11)，

r:tgtggaaaggtggtgaacaa(seqidno.12)；

zafu-7：

f:ttttccaactccaacccttg(seqidno.13)，

r:atgtttggggttgacgtgtt(seqidno.14)；

zafu-8：

f:aattggcccttcattcaaca(seqidno.15)，

r:ctagtgggtgcatttgagcc(seqidno.16)；

zafu-9：

f:ggagcgagcgtagcgtatag(seqidno.17)，

r:gttgctgcatcttcctcctc(seqidno.18)；

zafu-10：

f:gcctggtctgcttcttgttc(seqidno.19)，

r:aggcaaaggctgcaatagaa(seqidno.20)；

zafu-11：

f:acatctgcaaggcaaggttc(seqidno.21)，

r:ttgaattttcaccaggctcc(seqidno.22)；

zafu-12：

f:tgctaatgtttgctttgaatgg(seqidno.23)，

r:aacaacctaaacttttgccgaa(seqidno.24)；

zafu-13：

f:gaaattaaacgcgttcaggg(seqidno.25)，

r:cattgctgtccgtctcgtaa(seqidno.26)；

zafu-14：

f:cacaatcctccattcatcca(seqidno.27)，

r:gccactggtgtgattctcaa(seqidno.28)；

zafu-15：

f:atttgatacgacggaaacgg(seqidno.29)，

r:ggtggtcaatatcccatgct(seqidno.30)；

zafu-16：

f:aaggttgccacctcagtcac(seqidno.31)，

r:acagaacgtctccaaccgac(seqidno.32)。

榧樹est-ssr分析的步驟是從發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室細(xì)榧種仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和圓榧種仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用trinity軟件組裝，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。組裝共得到246862條transcript和142213條unigene。利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對篩選得到的1kb以上的unigene做ssr位點(diǎn)搜索。對于2-6個(gè)堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次按照重復(fù)次數(shù)分別為9、8、5、5、5次的微衛(wèi)星片段進(jìn)行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ests序列。

對榧樹est-ssr設(shè)計(jì)引物，利用primer3程序在微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異引物。引物設(shè)計(jì)的主要原則：引物長度控制在20bp；退火溫度58℃-62℃；上下游引物的tm值相差不大于2℃；pcr產(chǎn)物長度在100-300bp之間；gc含量在40％-60％之間；每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3對候選引物。

發(fā)明人還提供了一種榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記的篩選方法，包括：首先對細(xì)榧種仁和圓榧種仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用trinity軟件組裝，獲得轉(zhuǎn)錄本序列，組裝共得到246862條transcript和142213條unigene；然后利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對篩選得到的1kb以上的unigene做ssr位點(diǎn)搜索，對于2-6個(gè)堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次按照重復(fù)次數(shù)分別為9、8、5、5、5次的微衛(wèi)星片段進(jìn)行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ests序列；然后利用primer3程序進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的主要原則：引物長度控制在20bp、退火溫度58℃-62℃、上下游引物的tm值相差不大于2℃、pcr產(chǎn)物長度在100-300bp之間、gc含量在40％-60％之間、每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3對候選引物；最后對est-ssr標(biāo)記的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性進(jìn)行綜合評價(jià)，得到est-ssr標(biāo)記，所述的篩選到的est-ssr標(biāo)記的特異引物分別為：

zafu-1：

f:ggctatgctacacccaaagaa(seqidno.1)，

r：ggggcaccacctattgtatg(seqidno.2)；

zafu-2：

f：tcaaagtgcaaccggtacaa(seqidno.3)，

r:caacaggccaacatggagta(seqidno.4)；

zafu-3：

f：gggttacccccttgctttat(seqidno.5)，

r:ccctactttatttccgtgcg(seqidno.6)；

zafu-4：

f：gaattcccattcccattgtg(seqidno.7)，

r:acccccttctgctctgattt(seqidno.8)；

zafu-5：

f：aatgaatgcgtgttacgctg(seqidno.9)，

r:ttggagcggaaggaataatg(seqidno.10)；

zafu-6：

f:ccaatttgtggagcgtttct(seqidno.11)，

r:tgtggaaaggtggtgaacaa(seqidno.12)；

zafu-7：

f:ttttccaactccaacccttg(seqidno.13)，

r:atgtttggggttgacgtgtt(seqidno.14)；

zafu-8：

f:aattggcccttcattcaaca(seqidno.15)，

r:ctagtgggtgcatttgagcc(seqidno.16)；

zafu-9：

f:ggagcgagcgtagcgtatag(seqidno.17)，

r:gttgctgcatcttcctcctc(seqidno.18)；

zafu-10：

f:gcctggtctgcttcttgttc(seqidno.19)，

r:aggcaaaggctgcaatagaa(seqidno.20)；

zafu-11：

f:acatctgcaaggcaaggttc(seqidno.21)，

r:ttgaattttcaccaggctcc(seqidno.22)；

zafu-12：

f:tgctaatgtttgctttgaatgg(seqidno.23)，

r:aacaacctaaacttttgccgaa(seqidno.24)；

zafu-13：

f:gaaattaaacgcgttcaggg(seqidno.25)，

r:cattgctgtccgtctcgtaa(seqidno.26)；

zafu-14：

f:cacaatcctccattcatcca(seqidno.27)，

r:gccactggtgtgattctcaa(seqidno.28)；

zafu-15：

f:atttgatacgacggaaacgg(seqidno.29)，

r:ggtggtcaatatcccatgct(seqidno.30)；

zafu-16：

f:aaggttgccacctcagtcac(seqidno.31)，

r:acagaacgtctccaaccgac(seqidno.32)。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的一種榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記的篩選方法中，所述的特異引物對細(xì)榧、榧樹雄株、大圓榧、九龍山榧雌株、九龍山榧雄株、長葉榧雌株、長葉榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其中：擴(kuò)增體系總體積為10μl，含10×buffer(mg²⁺)1μl、dntpmix0.8μl、上下游引物各0.5μl、rtaq酶0.05μl、模板0.5μl和ddh2o6.65μl，混合均勻后置于pcr儀中擴(kuò)增；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行34次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸3min，4℃保存，各個(gè)引物的最佳退火溫度在預(yù)期退火溫度上下浮動(dòng)10℃之間進(jìn)行優(yōu)化，直至預(yù)期產(chǎn)物清晰單一。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的一種榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記的篩選方法中，所述的特異引物對細(xì)榧、榧樹雄株、大圓榧、九龍山榧雌株、九龍山榧雄株、長葉榧雌株、長葉榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物的檢測方法如下：擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，主要工藝參數(shù)為：電壓5-10v/cm，15-20分鐘；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性后，再用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，主要工藝參數(shù)為：電泳緩沖液為1×tbe，電壓180v，電泳90min；然后再用硝酸銀染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，分析確定多態(tài)性。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的一種榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記的篩選方法中，篩選獲得重復(fù)性好，穩(wěn)定的多態(tài)豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記，其步驟是利用至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析得到的多態(tài)引物，繼續(xù)用大量個(gè)體檢測其重復(fù)性和穩(wěn)定性，同時(shí)得到其多態(tài)特征。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明可方便快捷的用于做榧屬種間及榧樹種內(nèi)不同類型種質(zhì)資源和遺傳多樣性的分析，分子種群遺傳學(xué)、種質(zhì)資源的鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的研究，進(jìn)一步用于榧樹的分子設(shè)計(jì)育種和資源調(diào)查。

附圖說明

圖1是zafu-1在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖2是zafu-2在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖3是zafu-3在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖4是zafu-4在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖5是zafu-5在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖6是zafu-6在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖7是zafu-7在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖8是zafu-8在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖9是zafu-9在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖10是zafu-10在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖11是zafu-11在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖12是zafu-12在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖13是zafu-13在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖14是zafu-14在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖15是zafu-15在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖16是zafu-16在est-ssr標(biāo)記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果，

圖中，1細(xì)榧2榧樹雄株3大圓榧4九龍山榧雌株5九龍山榧雄株6長葉榧雌株7長葉榧雄株8巴山榧雄株9日本榧雌株，marker所用的是1000bp的。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。

實(shí)施例中主要材料、試劑和儀器設(shè)備說明：

眼科剪，鑷子，1.5ml離心管，微量移液器、微量移液器槍頭。脫氧核糖核苷酸dntp，熱聚合taq酶，小型離心機(jī)(qspin^tm，baygene)，渦旋振蕩器(ql-866型，qilinebeier)，ph計(jì)(mettlertoledo320phmeter)、高壓蒸氣滅菌鍋(sanyo)、電泳儀(dyy-6c型，北京六一)、電泳儀(dyy-12c型，北京六一)、dna序列分析電泳儀(dycz-20c型，北京六一)、調(diào)速多用振蕩器(hy-2型，上海國華)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(bio-radgd2000)、pcr儀(abiveriti96wellthermalcycler)。

本發(fā)明的樣本細(xì)榧、榧樹雄株、大圓榧、九龍山榧雌株、九龍山榧雄株、長葉榧雌株、長葉榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株。9個(gè)榧樹單株中，巴山榧雄株，采自湖北省?？悼h；長葉榧雌雄株，采自浙江省桐廬縣；九龍山榧雌雄株，采自浙江省遂昌縣；日本榧雌株，采自江蘇省南京市；細(xì)榧，大圓榧和榧樹雄株采自浙江省杭州市富陽區(qū)。

本發(fā)明實(shí)施例所用的常規(guī)藥品苯酚氯仿抽提液(25:24:1)，甲醛，氫氧化鈉(分析純)，硝酸銀，氯化鈉(分析純)，尿素，丙烯酰胺，甲叉，tris-堿，硼酸，乙二胺四乙酸(edta)，過硫酸銨，十二烷基硫酸鈉(sds)，無水乙醇購自國藥集團(tuán)瓊脂糖，溴化乙錠，去離子甲酰胺，temed，蛋白酶k等購自takara公司，脫氧核糖核苷酸dntp，熱聚合taq酶購自tiangen公司，質(zhì)粒文庫測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

本發(fā)明實(shí)施例所用主要儀器包括：小型離心機(jī)(qspin^tm，baygene)，渦旋振蕩器(ql-866型，qilinebeier)，ph計(jì)(mettlertoledo320phmeter)、高壓蒸氣滅菌鍋(sanyo)、電泳儀(dyy-6c型，北京六一)、電泳儀(dyy-12c型，北京六一)、dna序列分析電泳儀(dycz-20c型，北京六一)、調(diào)速多用振蕩器(hy-2型，上海國華)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(bio-radgd2000)、pcr儀(abiveriti96wellthermalcycler)。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，例如sambrook等作者的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的。

實(shí)施例1

1、ssr位點(diǎn)的來源和est-ssr序列的篩選

發(fā)明人從實(shí)驗(yàn)室細(xì)榧種仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和圓榧種仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用trinity軟件組裝，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。組裝共得到246862條transcript和142213條unigene。利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對篩選得到的1kb以上的unigene做ssr位點(diǎn)搜索。對于2-6個(gè)堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次按照重復(fù)次數(shù)分別為9、8、5、5、5次的微衛(wèi)星片段，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ests序列。利用引物設(shè)計(jì)軟件primer3.0在微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異引物。

2、est-ssr標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)

在微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列利用軟件primer3程序設(shè)計(jì)引物，引物要求滿足以下條件：引物長度控制在20bp；退火溫度58℃-62℃；上下游引物的tm值相差不大于2℃；pcr產(chǎn)物長度在100-300bp之間；gc含量在40％-60％之間；每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3對候選引物。

3、引物的優(yōu)化

各引物的最佳退火溫度在預(yù)期退火溫度上下浮動(dòng)10℃之間進(jìn)行優(yōu)化，直至預(yù)期目的產(chǎn)物能被清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行34次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min，4℃保存。反應(yīng)體系為：總體積10μl，其中含10×buffer(內(nèi)含1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，ddh2o6.65μl，模板0.5μl。模板是隨機(jī)的10個(gè)榧樹個(gè)體的dna混合池。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳-eb染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，選擇單一或雜帶少、特異性產(chǎn)物，較高的溫度作為最佳退火溫度。

4、est-ssr位點(diǎn)的確定

根據(jù)步驟3中優(yōu)化的退火溫度選取35個(gè)個(gè)體檢測這些est-ssr標(biāo)記的多態(tài)性。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行34次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，54-58℃退火30s(退火溫度因不同引物而異)，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min。反應(yīng)體系為：總體積10μl，其中含10×buffer(內(nèi)含1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，模板0.5μl，ddh2o6.65μl。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒壓180v，電泳90min，硝酸銀染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，干燥后分析確定多態(tài)性，最后篩選出16個(gè)榧樹est-ssr標(biāo)記，這些標(biāo)記的具體信息如表1。

表1開發(fā)獲得的16個(gè)榧樹est-ssr標(biāo)記

實(shí)施例2

1、提取榧樹的dna

具體步驟如下：

提前將ctab放入65℃水浴鍋中水浴(30min)，用冰盒取新鮮的樣品，剪碎后置于2ml的離心管中(樣品量約為管子的1/4)。在每個(gè)離心管中加入一顆直徑為4mm左右的鋼珠，在液氮中浸泡5-7分鐘，充分預(yù)冷后，用均質(zhì)儀磨碎。加800μl提前水浴過的ctab提取液于離心管中(ctab提取液中加1％的β-巰基乙醇)，將離心管置于65℃水浴鍋中水浴40min，期間上下顛倒搖晃一次。12000rpm，4℃，離心10min，取上清，加等體積的24:1的氯仿-異戊醇(氯仿:異戊醇＝24:1)，充分搖勻，靜置5-8min。12000rpm，4℃，離心10min，取上清，加等體積的24:1，充分搖勻，12000rpm，4℃，離心10min，取上清，加等體積的-20℃預(yù)冷過的異丙醇，充分搖勻，可見絮狀沉淀。置于-20℃冰箱40min左右。12000rpm，4℃，離心10min，倒掉液體，加500μl75％乙醇洗滌兩遍，置于通風(fēng)櫥15-20min，風(fēng)干至半透明，加滅菌后的ddh2o30-40μl。檢測質(zhì)量。

2、pcr擴(kuò)增

各est-ssr標(biāo)記引物的最佳退火溫度如表1所示，pcr反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行34次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min，4℃保存。反應(yīng)體系為：總體積10μl，其中含10×buffer(1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，ddh2o6.65μl，模板0.5μl。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳-eb染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

3、電泳檢測

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(電壓5-10v/cm，15-20分鐘)，特異擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×tbe，恒壓180v，功率200w，電泳90分鐘后進(jìn)行染色和顯色，首先將膠片放入銀染液中，在震蕩儀上震蕩5min左右，倒出銀染液，用ddh2o漂洗兩次。然后將膠片放入顯色液中顯色，在震蕩儀上震蕩直至有清晰的條帶出現(xiàn)，膠片取出后用ddh2o漂洗兩次，凝膠置于可見光燈箱上觀察并拍照保存。銀染液配置：ddh2o450ml，無水乙醇50ml和agno30.75g。顯色液配置：ddh2o450ml，20％naoh50ml和甲醛2ml。

干燥后的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1至圖16所示。

sequencelisting

<110>浙江農(nóng)林大學(xué)

<120>一種榧樹轉(zhuǎn)錄組序列的est-ssr標(biāo)記特異引物及篩選方法

<130>20170306

<160>32

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggctatgctacacccaaagaa21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggggcaccacctattgtatg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcaaagtgcaaccggtacaa20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caacaggccaacatggagta20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gggttacccccttgctttat20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccctactttatttccgtgcg20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaattcccattcccattgtg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

acccccttctgctctgattt20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aatgaatgcgtgttacgctg20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

ttggagcggaaggaataatg20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ccaatttgtggagcgtttct20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

tgtggaaaggtggtgaacaa20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

ttttccaactccaacccttg20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

atgtttggggttgacgtgtt20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

aattggcccttcattcaaca20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ctagtgggtgcatttgagcc20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggagcgagcgtagcgtatag20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gttgctgcatcttcctcctc20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

gcctggtctgcttcttgttc20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aggcaaaggctgcaatagaa20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

acatctgcaaggcaaggttc20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

ttgaattttcaccaggctcc20

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tgctaatgtttgctttgaatgg22

<210>24

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

aacaacctaaacttttgccgaa22

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gaaattaaacgcgttcaggg20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

cattgctgtccgtctcgtaa20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

cacaatcctccattcatcca20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

gccactggtgtgattctcaa20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

atttgatacgacggaaacgg20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

ggtggtcaatatcccatgct20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

aaggttgccacctcagtcac20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

acagaacgtctccaaccgac20