技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物催化
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及微生物催化反應(yīng)中海藻酸鈉接枝衍生環(huán)糊精固定化細(xì)胞及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：甾體化合物作為僅次于抗生素的第二大類藥物，其在生命體內(nèi)具有調(diào)控各種物質(zhì)代謝及生理作用的功能。甾體藥物的工業(yè)化生產(chǎn)主要是改造天然甾體化合物的結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)化學(xué)方法合成相比，微生物轉(zhuǎn)化的方法可以形成多種甾體藥物活性中間體且產(chǎn)物純度高。環(huán)糊精作為增溶劑能增加疏水性甾體的溶解度，其特殊空腔結(jié)構(gòu)可以包結(jié)甾體底物，從而提高甾體化合物的生物利用度和產(chǎn)率。然而環(huán)糊精的價(jià)格較高制約了其在生物催化領(lǐng)域中的大范圍應(yīng)用，采用合適的方法擴(kuò)大環(huán)糊精在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的應(yīng)用是亟待解決的重要問(wèn)題。通過(guò)接枝技術(shù)將環(huán)糊精固載到殼聚糖、海藻酸鈉等高分子載體上，可以把β-環(huán)糊精從溶于水的粉體材料制備成不溶于水的高分子材料，克服環(huán)糊精難回收的缺陷，使其能夠循環(huán)利用，降低工業(yè)使用的成本。接枝后的環(huán)糊精仍保留獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)及其它優(yōu)良性質(zhì)，同時(shí)還擁有了高分子載體良好的機(jī)械性能、穩(wěn)定性等特征，這大大拓寬了環(huán)糊精的應(yīng)用空間，提升了它的應(yīng)用價(jià)值。海藻酸鈉是一種天然聚陰離子多糖高分子化合物，由g、m兩個(gè)單元構(gòu)成，遇水后表面具有粘性，會(huì)使得溶液也具有粘性。其安全無(wú)毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具備藥用輔料所需的性質(zhì)，遇到ca2+、zn2+等陽(yáng)離子時(shí)，會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成凝膠球，針對(duì)這種性質(zhì)，可用作藥物的緩釋和控釋材料，以及用于固定性質(zhì)不穩(wěn)定物質(zhì)，提高穩(wěn)定性，同時(shí)還可用于固定微生物、細(xì)胞、酶等，實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。目前海藻酸鈉的應(yīng)用主要涉及到農(nóng)藥、食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，也被逐漸延伸到重金屬污染的救治方面。中國(guó)專利cn105754984-a公布了海藻酸鈉復(fù)合固定化菌劑及其制備方法以及用途，公開(kāi)了海藻酸鈉復(fù)合固定化菌劑及其制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有適用于二氯喹啉酸降解用假單胞菌的固定化方式的問(wèn)題。本發(fā)明包括將具有假單胞菌的載體培養(yǎng)基和海藻酸鈉混合后，滴入濃度為1～4％的氯化鈣中靜置2～4h制成的顆粒劑；所述海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2～6％；所述載體培養(yǎng)基包括吸附載體和無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基；該吸附載體與海藻酸鈉的重量比為1～3:1,該吸附載體由重量比為1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯組成。本發(fā)明通過(guò)有效提高菌體的降解效率；且本發(fā)明固定化菌劑的降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白小球物理吸附效率和游離菌株的生物降解效率之和,能有效達(dá)到相互促進(jìn)的效果。海藻酸鈉作為天然高分子載體，分子中含有-cooh和-oh兩種親水基團(tuán)，具有較強(qiáng)的親水性，并且可以環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑與環(huán)糊精進(jìn)行接枝，形成的環(huán)糊精-海藻酸鈉接枝物可以固定化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精和細(xì)胞的共循環(huán)。目前關(guān)于以海藻酸鈉作為載體，以天然高分子材料接枝環(huán)糊精的形式作為促溶劑運(yùn)用于難溶化合物的生物轉(zhuǎn)化，并對(duì)環(huán)糊精及細(xì)胞進(jìn)行共循環(huán)利用的技術(shù)尚未可見(jiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種甾體生物催化反應(yīng)中環(huán)糊精介質(zhì)及催化細(xì)胞循環(huán)利用的方法，具體如下：在甾體生物催化反應(yīng)中，以衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠作催化劑，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行過(guò)濾，濾液用于收集反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)濾物即衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，使用反應(yīng)溶液洗滌1-8次后，重新用于甾體生物催化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)及細(xì)胞循環(huán)利用；所述反應(yīng)溶液為tris-hcl緩沖溶液、生理鹽水或純水等，ph7.0-ph7.6；所述洗滌細(xì)胞膠珠的反應(yīng)溶液的用量為每克細(xì)胞膠珠10-100ml；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠的制備方法如下：(1)海藻酸鈉接枝環(huán)糊精按海藻酸鈉和衍生環(huán)糊精按摩爾比1:0.2-1:1.5稱取海藻酸鈉和環(huán)糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸鈉45-55倍(質(zhì)量體積比)的蒸餾水，30-70℃水浴中攪拌使之完全溶解；按環(huán)氧氯丙烷與蒸餾水體積比0.05-1:50加入環(huán)氧氯丙烷，同時(shí)按環(huán)氧氯丙烷與naoh溶液體積比0.05-1:10滴加0.5mol/l的naoh溶液，滴加時(shí)間10min，之后反應(yīng)1.5-6.5h；(2)固定化細(xì)胞膠珠的制備待步驟(1)的反應(yīng)液冷卻后，加入終濃度為1-30g/l的菌體靜息細(xì)胞，攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡1-6h，過(guò)濾，用反應(yīng)溶液洗滌1-8次，即得衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠；所述反應(yīng)溶液為tris-hcl緩沖溶液、生理鹽水或純水等，ph7.0-ph7.6；所述的衍生環(huán)糊精，具體為羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、磺酸基-β-環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精或甲基-γ-環(huán)糊精等；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠可在不補(bǔ)加環(huán)糊精及微生物細(xì)胞的條件下循環(huán)使用8次以上；所述衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠可通過(guò)活化延長(zhǎng)循環(huán)利用的次數(shù)，所述的活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠10g,投入到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養(yǎng)20h；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)使用的培養(yǎng)基；(2)培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液過(guò)濾得到膠珠，用反應(yīng)溶液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定2h，反應(yīng)溶液洗滌收集膠珠1-8次，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；活化后衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠可再次循環(huán)利用3-5次。有益效果：(1)本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)及細(xì)胞的循環(huán)利用，在循環(huán)8次后甾體底物轉(zhuǎn)化率仍在90％以上，達(dá)到提高甾體催化反應(yīng)效率的同時(shí)降低生產(chǎn)成本的目的，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。(2)本發(fā)明可以提高甾體底物生物催化初始轉(zhuǎn)化速率，提高最終轉(zhuǎn)化率。(3)本發(fā)明所述的環(huán)糊精循環(huán)利用工藝方法簡(jiǎn)單便捷，便于實(shí)現(xiàn)，成本節(jié)約。具體實(shí)施方式：以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠及其在醋酸可的松c1,2位脫氫反應(yīng)中的應(yīng)用微生物菌種采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)tccc11037，它能實(shí)現(xiàn)甾體化合物的c1，2位脫氫轉(zhuǎn)化，將醋酸可的松(ca)轉(zhuǎn)化為醋酸潑尼松；斜面培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，酵母膏10，瓊脂20，ph7.2；種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，玉米漿10，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，ph7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖10，玉米漿15，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，ph7.2；簡(jiǎn)單節(jié)桿菌靜息細(xì)胞的制備：tccc11037在32℃，160r/min，30/250ml種子培養(yǎng)基裝量條件下培養(yǎng)18h后，按5％接種量接種于裝有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，32℃，160r/min條件下培養(yǎng)20h，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的細(xì)胞5000r/min離心后用ph7.2的tris-hcl緩沖液洗滌三遍，重懸于ph7.2的tris-hcl緩沖液中得簡(jiǎn)單節(jié)桿菌靜息細(xì)胞菌懸液；衍生環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細(xì)胞的制備：準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:0.2的羥丙基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，30℃水浴中電動(dòng)攪拌使之完全溶解，加入0.6ml的環(huán)氧氯丙烷，同時(shí)滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約3.5h后停止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻后，加入菌體靜息細(xì)胞懸液，使得菌體濃度為20g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.3mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡3h，過(guò)濾，用tris-hcl(ph7.2)洗滌4次。生物轉(zhuǎn)化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的tris-hcl(ph7.2)，實(shí)驗(yàn)組加入10g上述步驟制備的環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠(接枝的羥丙基-β-環(huán)糊精量為0.043g)，對(duì)照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，控制加入的菌體與實(shí)驗(yàn)組等量，34℃、180r/min轉(zhuǎn)化8h，hplc法測(cè)定底物轉(zhuǎn)化率；環(huán)糊精及細(xì)胞的循環(huán)利用工藝：將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝固定細(xì)胞后用于上述ca的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，將其用tris-hcl(ph7.2)洗滌3次，用量為每次每克細(xì)胞膠珠50ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化，用量不變，hplc法測(cè)定每次循環(huán)后的底物轉(zhuǎn)化率；循環(huán)利用5次后，轉(zhuǎn)化率降至91％，將衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠進(jìn)行活化，步驟如下：將回收的10g衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠投入到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養(yǎng)20h；培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液過(guò)濾得到膠珠，用tris-hcl(ph7.2)緩沖液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定2h，洗滌收集膠珠，再次用于ca的生物催化反應(yīng)；結(jié)果表明，對(duì)照組的初次轉(zhuǎn)化率為86％，接枝羥丙基-β-環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠的初次轉(zhuǎn)化率是95％，初始轉(zhuǎn)化速率是對(duì)照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.3倍，循環(huán)利用8次后，ca的最終轉(zhuǎn)化率為92％，見(jiàn)表1。表1循環(huán)次數(shù)12345678轉(zhuǎn)化率95％96％95％94％91％94％92％92％實(shí)施案例2：除以下內(nèi)容外，其他同實(shí)施例1。衍生環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細(xì)胞的制備：準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1.5的磺丁基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，60℃水浴中電動(dòng)攪拌使之完全溶解，加入1ml的環(huán)氧氯丙烷，同時(shí)滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，6.5h后停止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻后，加入菌體靜息細(xì)胞懸液，使得菌體濃度為30g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡6h，過(guò)濾，用生理鹽水(ph7.2)洗滌3次備用。生物轉(zhuǎn)化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的生理鹽水(ph7.2)，實(shí)驗(yàn)組加入10g上述步驟制備的環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠(接枝的磺丁基-β-環(huán)糊精量為0.119g)，對(duì)照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，控制加入的菌體與實(shí)驗(yàn)組等量，34℃、180r/min轉(zhuǎn)化8h，hplc法測(cè)定底物轉(zhuǎn)化率；將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述ca的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，將其用生理鹽水(ph7.2)洗滌4次，用量為每次每克細(xì)胞膠珠80ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化，用量不變。結(jié)果表明，接枝磺丁基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠首次用于ca生物催化的初始轉(zhuǎn)化速率是對(duì)照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.4倍，且循環(huán)利用5次后對(duì)磺丁基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞進(jìn)行活化，活化方法同實(shí)施例1，活化后繼續(xù)循環(huán)使用3次，ca的最終轉(zhuǎn)化率為94％。實(shí)施案例3：除以下內(nèi)容外，其他同實(shí)施例1。環(huán)糊精接枝海藻酸鈉固定化細(xì)胞：準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉0.99g(5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1的甲基-β-環(huán)糊精于100ml三角瓶中，加入約50ml蒸餾水，70℃水浴中電動(dòng)攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環(huán)氧氯丙烷，同時(shí)滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約1.5h后停止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻后，加入菌體靜息細(xì)胞懸液，使得菌體濃度為15g/l。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.25mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續(xù)浸泡2h，過(guò)濾，用tris-hcl(ph7.5)洗滌2次。生物轉(zhuǎn)化：稱取0.06g的ca于100ml三角瓶中，加入20ml的tris-hcl(ph7.5)，再加入10g衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠(接枝的甲基-β-環(huán)糊精量為0.063g)，對(duì)照組加入不接枝環(huán)糊精的海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，控制加入的菌體與實(shí)驗(yàn)組等量，34℃、180r/min轉(zhuǎn)化8h，hplc法測(cè)定底物轉(zhuǎn)化率；將環(huán)糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述ca的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集衍生環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠，將其用tris-hcl(ph7.5)洗滌2次，用量為每次每克細(xì)胞膠珠100ml，洗滌后重新用于醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化，用量不變。結(jié)果表明，接枝甲基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞膠珠首次用于ca生物催化的初始轉(zhuǎn)化速率是對(duì)照組(1.1×10-2g/lmin-1)的1.5倍，且循環(huán)利用5次后對(duì)甲基-β-環(huán)糊精-海藻酸鈉固定化細(xì)胞進(jìn)行活化，活化方法同實(shí)施例1，活化后繼續(xù)循環(huán)使用4次，ca的最終轉(zhuǎn)化率為92％。雖然上文已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及實(shí)驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12