本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領域，涉及使植物具有除草劑抗性的小麥als突變型蛋白、基因及其應用；具體而言，本發(fā)明涉及小麥的乙酰乳酸合成酶(als)突變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其小麥抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發(fā)明公開了該蛋白的序列，以及它們在植物抗除草劑領域中的應用。
背景技術：
農(nóng)田雜草是導致農(nóng)作物減產(chǎn)的最主要原因之一。與傳統(tǒng)依靠栽培措施、人工除草和機械除草等方法相比，化學除草劑的使用是人們公認的防除農(nóng)田雜草最高效的、簡便的和經(jīng)濟的治理方法。
乙酰乳酸合成酶(als)(也稱乙酰羥酸合成酶，ahas；ec4.1.3.18)抑制劑類除草劑以als作為靶標而導致雜草死亡，主要包括磺酰脲類(sulfonylureas，su)、咪唑啉酮類(imidazolinones，imi)、三唑嘧啶類(triazolopyrimidines，tp)、嘧啶氧(硫)苯甲酸類[pyrimidinylthio(oroxy)-benzoates，ptb；pyrimidinyl-carboxyherbicides；pcs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮類(sulfonylamino-carbonyltriazolinones，sct)等13類化合物。als抑制劑類除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、低毒高效、對哺乳動物毒性低等優(yōu)點，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑對一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身也產(chǎn)生藥害，極大限制了其使用時間和使用空間，如需要在農(nóng)作物播種前一段時間使用除草劑才能避免農(nóng)作物遭受藥害。因此，培育一些抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范圍。
成熟的als蛋白大約由670個氨基酸組成，其序列在不同物種間高度保守。als蛋白在gly95、ala96、ala122、pro171、pro196、pro197、ala205、asp376、trp537、trp548、trp552、trp557、trp563、trp574、ser621、ser627、ser638、ser653、gly654、val669等氨基酸位點(以模式植物擬南芥的als氨基酸位置計算)發(fā)生突變可以產(chǎn)生als抑制劑類除草劑抗性，這在多種農(nóng)作物(包括玉米、小麥、小麥、油菜、向日葵等)、模式植物擬南芥和上百種雜草中均有報道。
生產(chǎn)上廣泛種植的普通小麥是一種異源六倍體，含有a、b和d三個基因組，即每個基因在小麥基因組中都有3個拷貝。目前，小麥已知的抗als抑制劑突變位點包括ala179、ser627(授權專利cn102559646b)。基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該已知的ala179、ser627突變位于小麥d基因組的6dl染色體上。als突變體抗除草劑水平與als氨基酸突變的位置有關，還與突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的數(shù)目有關。
目前，als抑制劑類除草劑的作用機理尚未確定，很難提前預測als蛋白其它氨基酸位點的突變是否會產(chǎn)生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長期、艱苦的實踐探索，并憑借一些運氣才可能發(fā)現(xiàn)als蛋白新的除草劑抗性位點。
技術實現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供使植物具有除草劑抗性的蛋白。
本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了編碼該蛋白的核酸以及表達盒、載體和細胞等。
本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用。
本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了判斷植物是否采用本發(fā)明方法獲得的鑒定方法。
本發(fā)明人通過長期、艱苦的研究，對野生型小麥品種煙農(nóng)19進行ems誘變處理，對這些的ems突變植株(野生型煙農(nóng)19品種購自江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺)進行長期、不斷地篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列的als突變蛋白，包括前文所述的某些已知als突變蛋白和新als突變蛋白，其對als抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有als抑制劑類除草劑抗性。本發(fā)明在植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農(nóng)作物，還開發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因如小麥等作物中的應用。
技術方案：為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：本發(fā)明提供了使得植物具有除草劑抗性的als蛋白，其在氨基酸序列的第630位氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘於０?。目前還沒有報道表明，在來自小麥a基因組的6al染色體als蛋白的ser630位點突變，會使得小麥具有als抑制劑類除草劑抗性。
優(yōu)選本發(fā)明的第一方面的蛋白帶有ser630asn突變，除了本發(fā)明具有的實施方式所述的突變植株篩選或擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情形下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列并將其導入載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質，這些方法均為常規(guī)手段。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明的具有除草劑抗性的als蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。該蛋白經(jīng)過證實對咪唑啉酮類除草劑不敏感的乙酰乳酸合成酶。
本發(fā)明的第二方面提供了核酸，其編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質。在本發(fā)明中，核酸可以是dna、rna，其中優(yōu)選為dna。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規(guī)的密碼子對應關系和宿主表達頻率，運用pcr方法、dna重組法或人工合成的方法，本領域技術人員有能力獲得并優(yōu)化編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規(guī)的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的核酸的核苷酸序列如seqidno：1所示。具體的，本發(fā)明的dna序列，是在小麥a基因組的6al染色體als基因序列的第1889位核苷酸由g變成核苷酸a。
此外，本發(fā)明突變前的野生型小麥為煙農(nóng)19，該野生型小麥6al染色體上的als核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸如seqidno.4所示。
本發(fā)明的第三方面的內(nèi)容包括表達盒、重組載體或細胞，其含有上述的第二方面的核酸。
本發(fā)明第四方面內(nèi)容還包括上述的具有除草劑抗性的als蛋白、核酸、表達盒、重組載體或細胞在綠色植物抗除草劑方面的應用。
其中，上述綠色植物為小麥、煙草、擬南芥等。
本發(fā)明第五方面的內(nèi)容還包括獲得具有除草劑抗性的植物的方法，包括如下步驟：
1)使植物包含本發(fā)明所述的核酸；或
2)使植物表達所述的蛋白。
其中，上述的方法，包括轉基因、雜交、回交或無性繁殖步驟。
本發(fā)明第六方面的內(nèi)容包括鑒定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表達所述的蛋白的植物或所述的方法獲得的植物，具體包括以下步驟：
1)測定所述植物是否包含所述的核酸；或，
2)測定所述植物是否表達所述的蛋白。
有益效果：本發(fā)明通過田間噴施als抑制劑類除草劑“百壟通”的實驗結果表明，含有本發(fā)明的具有除草劑抗性的als蛋白的小麥1葉1芯幼苗在施用3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)后，植株仍然正常生長發(fā)育和結實，而野生型小麥幼苗在施用1ml百壟通/3l水(1倍推薦使用濃度)后，植株生長逐漸停止，葉片逐漸失綠、變淺黃色，植株不能拔節(jié)，最終整株死亡。
附圖說明
圖1本發(fā)明的百壟通除草劑篩選獲得的抗性小麥突變體；
圖2pcr擴增小麥als基因全長結果圖；第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道為野生型小麥的dna，第3泳道為抗除草劑突變植株的dna；目的片段長度2111bp；
圖3重組質粒pcambia1301-als的bamhi和saci雙酶切驗證電泳圖；泳道1為為marker；marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp；泳道2為重組質粒pcambia1301-als酶切后的片段。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1：小麥抗咪唑啉酮類除草劑突變體獲取過程(百壟通)
將煙農(nóng)19種子(購自江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺)(此為m0，用清水浸泡2小時)120kg分6次用0.4-0.6％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室溫下浸泡6-9小時，期間每1小時搖動一次種子；棄去ems溶液，自來水翻動浸泡種子5次，每次5分鐘，然后用自來水沖洗種子過夜，次日進行田間播種，并進行常規(guī)肥水管理(此為m1)。植株成熟后，種子混收、晾干，過冬保存。次年播種田間。待小麥(此為m2)幼苗長至1葉1芯期時，噴施為3ml百壟通/l水(“百壟通”是德國巴斯夫公司生產(chǎn)一種水劑型咪唑啉酮類除草劑，推薦最低使用濃度為1ml百壟通/1.5～3l水)，3個月后還呈正常綠色、且能正常拔節(jié)的植株即為抗咪唑啉酮類除草劑的小麥突變植株(圖1)。共計獲得抗除草劑的m2單株150株，這些抗性單株進行常規(guī)肥水管理，均可正常結實，種子成熟后，單株收種、晾干，過冬保存。我們對上述獲得的150株m2進行單株收獲，并進行種植m3種子，進一步百壟通除草劑篩選鑒定，篩選濃度如之前，發(fā)現(xiàn)第38號突變體的生長完全沒有影響，而野生型植株的葉片則完全黃化。
實施例2：抗除草劑小麥突變體突變位點分析
上述實施例1獲得的抗除草劑小麥突變植株中，選取突變植株的葉片和野生型植株的葉片，提取基因組dna，送上海翰宇生物科技有限公司進行基因組測序。測序結果發(fā)現(xiàn)：與野生型植株相比，上述抗除草劑的小麥突變體在小麥a基因組的6al染色體als基因序列的第1889位核苷酸發(fā)生了單堿基突變，由g變成a，導致其相應編碼的氨基酸序列的第630氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘於０?，即小麥抗除草劑突變植株的a基因組的6al染色體als基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其編碼的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。野生型植株的6al染色體上的als基因的核苷酸序列如seqidno.3所示，其編碼的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。本發(fā)明的小麥突變植株其分類命名為普通小麥yn19-m1(triticumaestivuml.yn19-m1)，該菌株已于2017年5月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)，郵編：430072，保藏編號為cctccno：p201711。
實施例3抗咪唑啉酮類除草劑小麥突變體als基因克隆
取上述抗除草劑的小麥突變體的葉片，提取基因組dna。根據(jù)測序序列設計擴增als基因全長基因的特異引物為：正向引物5’-cccatctgaaccacacgctcacc-3’、反向引物5’-ctgattgcgcatgtcacacttg-3’。采用takaraprimerstarmaxdnapolymerase聚合酶(10u/ul)(購自takara公司)擴增als基因全長序列，其反應體系如下：
2×primerstarmaxpremix10.0μl
10μm正向引物1.0μl
10μm反向引物1.0μl
20-30ng/μl小麥基因組dna1.0μl
補加無菌水至總體積20μl
pcr擴增反應程序采用兩步法，退火和延伸合為一起，采用68℃。
程序如下：預變性：98℃3min；35個循環(huán)；變性98℃10sec；延伸68℃3min；保溫：72℃10min。
取2μlpcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有預期大小的片段后(圖2)
將上述的剩余的pcr產(chǎn)物經(jīng)pcr清潔試劑盒(購自axygen公司)清潔回收后，克隆至pmd19-t載體(購自takara公司)，然后轉化大腸桿菌。每個轉化隨機挑取12個大腸桿菌單克隆進行pcr檢測，取pcr結果呈陽性的6個單克隆，送金斯瑞生物科技有限公司測序，獲得突變als基因序列，該基因片段長度為2111bp，該片段的測序結果如下：
cccatctgaaccacacgctcacccgccgcgtgacagcgccaaagacaaaaccatcacccctccccaattccaaccctctctccgcctcacagaaatctctcccctcgcccaaaccctcgccgccgccatggccgccgccacctcccccgccgtcgcattctccggcgccgccgccgccgccgccgccatgcccaagcccgcccgccagcctctcccgcgccaccagcccgcctcgcgccgcgcgctccccgcccgcgtcgtcaggtgctgcgccgcgccccccgctgctgccacctccgccgcgccccccgccaccgcgctccggccctggggcccgtccgagccccgcaagggcgccgacatcctcgtcgaggcgctcgagcgctgcggcatcgtcgacgtattcgcctaccccggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctcgcccgtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggggaggcgttcgcggcgtccggctacgcccgcgcgtccggccgcgtcggcgtctgcgtcgccacctccggcccgggggccaccaacctcgtctccgcgctcgctgacgccctcctcgactccatccccatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcacggacgcgttccaggagacgcccatagtggaggtcacgcgctccatcaccaagcacaactacctggtccttgacgtggaggatatcccccgcgtcatccaggaagccttcttcctcgcgtcctctggccgcccggggccggtgctggttgatatccccaaggatatccagcagcagatggccgtgcctatctgggacacgccgatgagtttgccagggtacatcgcccgcctgcccaagccaccatctactgaatcgcttgagcaggtcctgcgtctggttggcgagtcacggcgcccaattctgtatgttggtggtggctgcgctgcatccggcgaggagttgcgccgctttgttgagctcactgggattccggttacaactactctgatgggccttggcaacttccccagcgacgacccactgtctctgcgcatgcttgggatgcatggcactgtgtatgcaaattatgcagtcgataaggctgacctgttgcttgcatttggtgtgcggtttgatgatcgcgtgactgggaaaatcgaggcctttgcaagcaggtccaagattgtgcacattgacattgacccagctgagattggcaagaacaagcagccacatgtctccatttgtgcagatgttaagcttgctttacaggggttgaatgctctattaaatgggagcaaagcacaacagggtctggattttggtccatggcacaaggagttggatcagcagaagagggagtttcctctaggattcaagacttttggcgaggccatcccgccgcaatatgctatccaggtactggatgagctgacaaaaggggaggcgatcattgctactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggctcagtattacacttacaagcggccacggcagtggctgtcttcgtctggtttgggggcaatgggatttgggttaccagctgcagctggcgctgctgtggccaacccaggtgttacagttgttgacattgatggagatggtagtttcctcatgaacattcaggagttggcattgatccgtattgagaacctccctgtgaaggtgatgatattgaacaaccagcatctgggaatggtggtgcaatgggaggataggttttacaaggccaatcgggcgcacacataccttggcaacccagaaaatgagagtgagatatatccagattttgtgacgattgctaaaggattcaacgttccggcagttcgtgtgacgaagaagagcgaagtcactgcagcaatcaagaagatgcttgagaccccagggccatacttgttggatatcatcgtcccgcatcaggagcacgtgctgcctatgatcccaaacggtggtgctttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtacaatttcgacctacaagacctacaagtgtgacatgcgcaatcag
實施例4抗百壟通除草劑小麥突變體的als酶活測定
為了驗證小麥突變體的除草劑抗性是否由als突變所致，本發(fā)明人進行了als酶活性測定。測定方法參照singh等的方法(singhb.k.，stidhamm.a.，shanerd.l.assayofacetohydroxyacidsynthase.analyticalbiochemistry，1988，171：173-179.)。具體的，分別取野生型小麥和突變體小麥的葉片0.2g，在研缽中用液氮研磨粉碎，加入2ml提取液(100mmk2hpo4，ph7.5、10mm丙酮酸鈉、5mmedta、1mm纈氨酸、1mm亮氨酸、10mm半胱氨酸、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸、5mm氯化鎂、10％(v/v)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解凍后繼續(xù)研磨1min左右。12000rpm、4℃離心30min，吸取上清液，加入硫酸銨使之達到50％飽和度，于冰上放置半小時，12000rpm、4℃離心30min，棄上清，將沉淀溶解于0.2ml反應緩沖液(100mmk2hpo4，ph7.0、1mmedta、10mm氯化鎂、100mm丙酮酸鈉、1mm焦磷酸硫胺素、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸)，分別得各植株的als提取液。
在獲得als提取液中分別加入10μl除草劑“百壟通”(水劑，有效成分240g/l)，混勻，37℃孵育1h，加0.1ml3m硫酸終止反應，反應混合物在60℃反應孵育30分鐘便于脫羧。然后加0.4ml顯色液(0.09g/l1-萘酚和0.009g/l肌酸，用2.5mnaoh溶解)?；旌弦涸?7℃孵育30分鐘進行顯色(als蛋白催化丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脫羧形成3-羥基丁酮，再與肌酸和1-萘酚形成粉紅色復合物，該復合物在530nm處有最大吸收值)，隨后測定其530nm的吸光度，als蛋白活性用a530吸光值表示，a530吸光值的高低反映als蛋白活性的高低。實驗以水為對照，設3次重復。
a530吸光值測定結果發(fā)現(xiàn)，當野生型和小麥突變體的als提取液中沒有百壟通時，它們的a530吸光值均在1.3-1.4之間，表明野生型和突變體的als酶活性無顯著性差異(表1)；而加入百壟通后，野生型植株的a530吸光值僅為0.26，突變體小麥植株的a530吸光值為0.98，此時突變體小麥植株的als酶活性為野生型的als酶活性的4倍(表1)，表明突變體小麥的als基因突變后對百壟通不敏感，從而賦予了抗性。
表1
實施例5轉基因煙草獲得
設計特異引物5’-cgcggatccccatcacccctccccaattcc-3’和5’-tccccgcggcacttgtaggtcttgtaggtcg-3’，其5’分別加入bamhi和saci酶切修飾位點。通過pcr從上述小麥突變體的基因組dna中擴增出突變als基因，測序正確后，用bamhi和saci分別雙酶切突變als基因片段和植物表達載體pcambia1301質粒(購自pcambia公司)，酶切產(chǎn)物用t4-dna酶(購白takara公司)連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌得到重組質粒pcambia1301-als。重組質粒pcambia1301-als提取dna，用bamhi和saci雙酶切驗證，可以產(chǎn)生大的質粒片段和小的基因片段(圖3)，證明已將核苷酸序列如seqidno.1所示的als基因克隆至植物表達載體pcambia1301質粒(購自pcambia公司)中。將構建好的質粒載體轉化農(nóng)桿菌eha105，挑選陽性克隆，培養(yǎng)菌體。采用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導法轉化本氏煙葉盤，獲得轉基因植株收種后，后代植株長至3-4葉期時，經(jīng)pcr鑒定呈陽性后，噴施3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)，7天后，參照實施例4所述方法測定als酶活性，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草的als酶活性是非轉基因煙草的3倍(表2)；30天后發(fā)現(xiàn)轉基因煙草生長狀態(tài)良好，而非轉基因煙草則全部枯死。
表2
實施例6轉基因擬南芥獲得
設計特異引物5’-cgcggatccccatcacccctccccaattcc-3’和5’-tccccgcggcacttgtaggtcttgtaggtcg-3’，其5’分別加入bamhi和saci酶切修飾位點。通過pcr從上述小麥突變體的基因組dna中擴增出突變als基因，測序正確后，參照實施例5的方法將核苷酸序列如seqidno.1所示的als基因克隆至植物表達載體pcambia2301質粒(購自pcambia公司)中，挑選陽性克隆轉化農(nóng)桿菌eha105，培養(yǎng)菌體，通過農(nóng)桿菌介導方法轉化擬南芥(cloughs，benta.floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantjournal，1998，16(6)：735-743.)，轉化的擬南芥成熟收種后，隨即播種，對未抽薹的擬南芥幼苗噴施3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)，30天后發(fā)現(xiàn)非轉基因擬南芥枯死，而轉基因擬南芥生長狀態(tài)良好。
盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細描述，本領域技術人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附專利要求極其任何等同物給出。
sequencelisting
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學院
<120>使植物具有除草劑抗性的小麥als突變型蛋白、基因及其應用
<130>sg20170606001
<160>8
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1941
<212>dna
<213>小麥als突變型基因
<220>
<221>cds
<222>(1)..(1941)
<400>1
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