本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及真菌來源的多結(jié)構(gòu)域酸性纖維素酶及其基因和應用。

背景技術(shù)：

纖維素酶根據(jù)其催化反應功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，在畜牧業(yè)和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。

纖維素酶已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應用價值。

纖維素酶的最主要來源是微生物，不同微生物合成的纖維素酶在組成上差異明顯，對纖維素的降解能力也不盡相同。細菌與放線菌生產(chǎn)的纖維素酶產(chǎn)量均不高，在工業(yè)上很少應用，而真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點。

目前國內(nèi)外，雖然許多纖維素酶被克隆分離及性質(zhì)測定，但這些酶的性質(zhì)特征，均存在一些缺陷，例如，ph作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達量低等，均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到新的能夠滿足實際應用需求的纖維素酶，從而能夠進一步推廣纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用。

本發(fā)明從talaromycesleycettanusjcm12802菌株中得到了一個新的多結(jié)構(gòu)域纖維素酶基因，其編碼的纖維素酶具有以下幾個優(yōu)點：酸性、耐高溫、容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會比一千報道的纖維素酶更有應用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多結(jié)構(gòu)域酸性纖維素酶。

本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶基因的重組菌株。

本發(fā)明的再一目的是提供一種制備纖維素酶的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的應用。

本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用的新的酸性纖維素酶，其氨基酸序列如seqidno.1：

其中，該酶全長654個氨基酸，n端18個氨基酸為信號肽序列“mqvllvatlasfvggawa”。

因此，成熟的纖維素酶cel5的理論分子量為68.5kda，其氨基酸序列如seqidno.2：

該纖維素酶的最適ph為3.0，在ph2.2-4.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其50％以上的酶活力；最適溫度為50℃，在30℃時依然具有約63％的酶活力，在50℃下處理60min，剩余酶活在60％以上，在60℃下處理10min，依然能夠保持20％的酶活力。

本發(fā)明還提供了編碼上述纖維素酶的基因。該酶的全基因序列如seqidno.3所示：

本發(fā)明通過pcr的方法分離克隆了這個纖維素酶基因cel5x，dna全序列分析結(jié)果表明，纖維素酶cel5x結(jié)構(gòu)基因全長2411bp，含有7個內(nèi)含子，+77～152bp，+222～282bp,+637～688bp,+821～873bp，+1225～1285bp，+1308～1368bp，+2168～2249bp為其內(nèi)含子序列，cdna長1965bp，其cdna序列如seqidno.4所示：

其中，信號肽的堿基序列為：

“atgcaagtgttgctcgtcgccaccctcgcatccttcgttggaggtgcctgggcg”

因此，成熟基因的編碼序列為

seqidno.5所示：

成熟蛋白理論分子量為68.5kda，該酶屬于糖基水解酶第5家族。將纖維素酶基因cel5xcdna序列及推導出的氨基酸序列在genbank中進行blast比對發(fā)現(xiàn)，確定cel5x是一種新的纖維素酶基因，與已經(jīng)報道的來源于penicilliumdecumbens的cel5c相似度達到71％。cel5x為多結(jié)構(gòu)域纖維素酶，其n端包含一個家族cbm區(qū)，c端包含一個cbmx2。

本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組載體，優(yōu)選為ppic9-cel5x。將本發(fā)明的纖維素酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將纖維素酶基因插入到質(zhì)粒ppic9上的snabi和noti限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于aoxl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒ppic9-cel5x。

本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株gs115/cel5x。

本發(fā)明還提供了一種制備纖維素酶的方法，包括以下步驟：

1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組纖維素酶的表達；以及

3)回收并純化所表達的纖維素酶。

其中，優(yōu)選所述宿主細胞為畢赤酵母(pichiapastoris)細胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)細胞或多型漢遜酵母(hansenulapolymorpha)細胞，優(yōu)選將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞(pichicpastoris)gs115，得到重組菌株gs115/cel5x。

本發(fā)明還提供了上述纖維素酶的應用。運用基因工程手段來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明提供了一個新的纖維素酶基，可作應用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應用的纖維素酶。

附圖說明

圖1為重組纖維素酶的sds-page電泳圖。

圖2顯示本發(fā)明的纖維素酶的酶學性質(zhì)。

具體實施方式

試驗材料和試劑

1、菌株及載體：畢赤酵母(pichiapastorisgs115)為本實驗室保存；畢赤酵母表達載體ppic9及菌株gs115購自于invitrogen公司。

2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自takara公司，連接酶購自invitrogen公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

3、培養(yǎng)基：

(i)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：30g/l麥麩，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l大麥葡聚糖，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去離子水中，121℃，15磅條件下滅菌處理20min

(2)大腸桿菌培養(yǎng)基lb(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126naci，ph7.o)。

(3)bmgy培養(yǎng)基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。

(4)bmmy培養(yǎng)基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均與bmgy相同，ph4.0。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。

實施例1纖維素酶編碼基因cel5x的克隆

提取talaromycesleycettanusjcm12802基因組dna，以talaromycesleycettanus總dna為模板，以cel5x-f和cel5x-r為引物進行pcr擴增(見表1)，pcr反應參數(shù)為：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,30個循環(huán)，得到一約1400bp片段，將該片段回收后送睿博生物技術(shù)有限公司測序。

表1本實驗所需的引物

實施例2纖維素酶cdna的獲得

提取talaromycesleycettanusjcm12802總rna，利用oligo(dt)20和反轉(zhuǎn)錄酶得到cdna的一條鏈，然后以cel5x-f和cel5x-r(見表1)，擴增該單鏈cdna，獲得纖維素酶的cdna序列，擴增得到產(chǎn)物回收后送睿博生物技術(shù)有限公司測序。

通過對纖維素酶cel5x的基因組序列和cdna序列比對后發(fā)現(xiàn)該基因有含有7個內(nèi)含子,cdna長1965bp，編碼654個氨基酸和一個終止密碼子，n端18個氨基酸為其信號肽序列，經(jīng)比對證明從talaromycesleycettanusjcm12802中分離克隆得到的編碼纖維素酶的基因為新基因。

實施例3纖維素酶工程菌株的構(gòu)建

(1)表達載體的構(gòu)建及在酵母的表達

以測序正確的纖維素酶cel5x的cdna為模板，設(shè)計合成了帶有snabi和noti限制性酶切位點的引物cel5x-f和cel5x-r(見表1)，對cel5x的成熟蛋白的編碼區(qū)進行擴增，并利用snabi和noti酶切pcr產(chǎn)物，連接進入表達載體ppic9(invitrogen,sandiego)，纖維素酶cel5x成熟蛋白的序列插入到上述表達載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達載體ppic9-cel5x，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞trans1。陽性轉(zhuǎn)化子進行dna測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶bglii進行線性化表達質(zhì)粒載體dna，電擊轉(zhuǎn)化酵母gs115感受態(tài)細胞，30℃培養(yǎng)2-3天，挑取在md平板上生長的轉(zhuǎn)化子進行進一步的表達實驗，具體操作請參考畢赤酵母表達操作手冊。

以同樣的方式構(gòu)建含cel5x信號肽序列的cdna的表達載體，并轉(zhuǎn)化。

(2)高纖維素酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選

用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的md板上挑取單菌落，按照編號先點到md平板上，將md平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，至菌落長出。按編號從md平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有3mlbmgy培養(yǎng)基的離心管中，30℃、220rpm搖床培養(yǎng)48h；將搖床培養(yǎng)48h的菌液3,000×g離心15min，去上清，離心管中再加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培養(yǎng)基，在30℃、220rpm誘導培養(yǎng)；誘導培養(yǎng)48h后，3,000×g離心5min，取上清用于酶活性檢測，從中篩選出高纖維素酶活性的轉(zhuǎn)化子，具體操作請參考畢赤酵母表達操作手冊。

實施例4重組纖維素酶的制備

(1)纖維素酶基因cel5x在畢赤酵母中搖瓶水平的大量表達

篩選出酶活較高的轉(zhuǎn)化子，接種于300mlbmgy液體培養(yǎng)基的1l三角瓶中，30℃，220rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h；5,000rpm離心5min，輕柔棄上清，再向菌體加入100ml含有0.5％甲醇的bmmy液體培養(yǎng)基，30℃，220rpm誘導培養(yǎng)72h。誘導培養(yǎng)期間，間隔24h補加一次甲醇溶液以補償甲醇的損失，使甲醇濃度保持在0.5％左右；12,000×g離心10min，收集上清發(fā)酵液，檢測酶活性并進行sds-page蛋白電泳分析。

(2)重組纖維素酶的純化

收集搖瓶表達的重組纖維素酶上清液，通過10kda膜包進行濃縮，同時用低鹽緩沖液置換其中的培養(yǎng)基，然后用10kda超濾管進一步的濃縮。濃縮能稀釋到一定倍數(shù)的重組cel5x，通過離子交換層析進行純化。具體地，取cel5x濃縮液2.0ml經(jīng)預先用10mmtris-hcl(ph7.8)平衡過的hitrapqsepharosexl陰離子柱，然后用0-1mol/l的nacl進行線性梯度洗脫，對分步收集的洗脫液檢測酶活性和進行蛋白濃度的測定。

實施例5重組纖維素酶部分性質(zhì)分析

采用dns法對本發(fā)明的纖維素酶進行活性分析。具體方法如下：在ph5.0，60℃條件下，1ml的反應體系包括l00μl適當?shù)南♂屆敢海?00μl底物，反應l0min，加入1.5mldns終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm測定od值。纖維素酶活性單位定義：在一定條件下，每分鐘分解羧甲基纖維素生成lμmol還原糖所需的酶量為1個活性單位(u)。

(1)纖維素酶cel5x的最適ph及ph穩(wěn)定性

經(jīng)純化的實施例3表達的纖維素酶cel5x在不同的ph下進行酶促反應以測定其最適ph。所用緩沖液為ph1.0～3.0甘氨酸-鹽酸緩沖液,ph2.2～8.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉系列緩沖液。所用底物為cmc-na。純化的cel5x在不同ph的緩沖體系，50℃下測定的ph適性結(jié)果(圖2，a)表明：cel5x的最適ph為3.0,呈酸性。

將酶液在不同ph值的緩沖液中于37℃下處理60min，再測定酶活性以研究酶的ph穩(wěn)定性。所用緩沖液為ph1.0～2.0甘氨酸-鹽酸緩沖液，ph3.0～8.0檸檬酸-磷酸氫二鈉系列緩沖液,ph9.0～l2.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。結(jié)果表明(圖2，b)，分析結(jié)果表明ph3.0-ph10.0之間能夠維持60％以上的酶活力，說明該酶具有優(yōu)良的ph穩(wěn)定性。

(2)纖維素酶cel5x反應最適溫度及熱穩(wěn)定性

純化的纖維素酶cel5x在ph3.0條件下，測定不同溫度(30℃-90℃)下的酶活性，分析實驗結(jié)果表明顯示，該酶的最適反應溫度為50℃，在30℃時依然具有60％以上的酶活力(圖2，c)。耐溫性測定為纖維素酶在不同溫度下處理不同時間，再在50℃下進行酶活性測定。熱穩(wěn)定性實驗表明：該纖維素酶在50℃下處理60min，剩余酶活在70％以上，即使該酶在60℃下處理10min，依然能夠保持22％的酶活力(圖2，d)。

(3)纖維素酶cel5x對多種底物的比活性

在最適ph與最適溫度下，將該纖維素酶與不同種類的底物反應相同時間，分析實驗結(jié)果表明，該酶能夠降解大麥葡聚糖(269u/mg)，羧甲基纖維素鈉(166u/mg)，地衣多糖(460u/mg)，葡甘露聚糖(26u/mg),木聚糖(5.5u/mg)。此外，過夜反應，cel5x還能檢測到角豆膠活性。結(jié)果表明，對于纖維素半纖維素類的底物，該酶均可以降解，具有廣泛的底物特異性，這使得cel5x更適合應用于工業(yè)生產(chǎn)。

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所

<120>真菌來源的多結(jié)構(gòu)域酸性纖維素酶及其基因和應用

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