本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種赤霉烯酮分解酶及其編碼基因，以及該分解酶的應用。
背景技術：
赤霉烯酮(zen)是由禾谷鐮刀菌產生的一種非甾體霉菌毒素，最初于1962
年由stob等從發(fā)霉的玉米中分離得到。1966年，urry等利用經典化學，核磁共振及質譜分析等方法確定了該物質的化學結構，并稱之為f-2毒素。其化學名稱為：6-(10-羥基-6-氧基-十一碳烯基)-β-雷羧酸內酯。
zen是全球污染范圍最廣的一類真菌毒素，污染范圍包括小麥、玉米、高粱、燕麥等谷物及其制品，其中玉米中的zen檢出率極高，嚴重影響糧食食品安全。zen很強的雌激素作用，主要作用部位為生殖系統(tǒng)，具有導致動物生殖障礙，流產、死胎等生殖毒性。此外還有肝臟毒性、免疫毒性和遺傳毒性，導致動物繁殖功能紊亂。被zen污染的食品、飼料通過食物鏈在人和牲畜體中蓄積，進而威脅人和動物的健康，導致肝癌、食道癌和青春期早熟等疾病。
目前，去除zen的方法主要包括物理法、化學法以及生物法，主要是通過破壞、修飾或吸附的方式作用于真菌毒素，從而達到削減或消除毒素的目的。物理法的毒素降解效果不太明顯，化學法效果雖比物理法較佳，但可能造成營養(yǎng)成分丟失或化學試劑殘留。
生物法主要是基于微生物菌體對毒素的吸附作用，或利用微生物產生的胞內、胞外酶將zen降解成無毒或毒性較低的物質，生物法具有去毒效率高、反應條件溫和不破壞營養(yǎng)等優(yōu)點。采用高效、專一及環(huán)境友好的生物酶法進行綠色解毒，成為近年來國內外研究的新熱點。目前已經發(fā)現(xiàn)包括細菌、真菌在內的多種微生物能夠產生產赤霉烯酮分解酶，有效地分解zen。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種赤霉烯酮分解酶及其編碼基因，該酶可以完全分解赤霉烯酮。
為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術方案：一種赤霉烯酮分解酶，所述赤霉烯酮分解酶的氨基酸序列如seqidno:2所示；或者所述赤霉烯酮分解酶是如seqidno:2所示氨基酸序列經過修飾所得到的具有降解赤霉烯酮功能的蛋白衍生物。本發(fā)明所提供的赤霉烯酮分解酶被命名為zen-jlm，來源于粉紅螺旋聚孢霉。
本發(fā)明提供了上述所述的赤霉烯酮分解酶的編碼基因。
優(yōu)選地，所述赤霉烯酮分解酶的的編碼基因序列如seqidno:1所示；或者所述赤霉烯酮分解酶的的編碼基因是具有與seqidno:1序列至少98％序列同一性且編碼具有降解赤霉烯酮功能的蛋白質的dna分子。
本發(fā)明提供了一種表達載體，所述表達載體是將上述所述的編碼基因連接到基礎載體上而得的，用于表達上述所述的赤霉烯酮分解酶。
優(yōu)選地，所述基礎載體為phy300-plk質粒。
本發(fā)明提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞含有上述所述的表達載體，或其基因組中整合有上述所述的編碼基因。
優(yōu)選地，所述宿主細胞是將權利要求4或5所述的表達載體轉化枯草芽孢桿菌而得到的。
本發(fā)明提供了一種上述所述表達載體表達的重組赤霉烯酮分解酶，或者培養(yǎng)上述所述的宿主細胞得到的重組赤霉烯酮分解酶。
本發(fā)明提供了上述所述的赤霉烯酮分解酶、上述所述的重組赤霉烯酮分解酶在制備用于降解赤霉烯酮或者控制赤霉烯酮霉菌毒素污染的飼料添加劑或者飼料中的用途。
本發(fā)明提供了一種用于降解赤霉烯酮或者控制赤霉烯酮霉菌毒素污染的飼料添加劑或者飼料，所述飼料添加劑或者飼料包括上述所述的赤霉烯酮分解酶、或者上述所述的重組赤霉烯酮分解酶。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明表達的重組赤霉烯酮分解酶，可以對飼料中真菌毒素赤霉烯酮進行分解，對防治豬群霉菌毒素中毒起到有效作用。
具體實施方式
為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1：赤霉烯酮分解酶基因(zen-jlm)的獲得
本發(fā)明人用takara公司smarttmcdna文庫構建試劑盒，構建了粉紅螺旋聚孢霉(gliocladiumroseum)cdna文庫，通過隨機挑取克隆測序，并將測得序列用blast與國際基因庫(genbank)中的序列進行比較，獲得了赤霉烯酮分解酶(zen-jlm)的cdna。
1.粉紅螺旋聚孢霉(gliocladiumroseum)總rna的提取
將粉紅螺旋聚孢霉在液體pda培養(yǎng)基中培養(yǎng)(200轉/分鐘，30℃，48h)，培養(yǎng)完成后，12000r/min離心10min收集沉淀。depc處理水配制的75％乙醇溶液洗滌。室溫干燥，rnase-free水溶解沉淀rna，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測可以見到清晰的28s和l8s兩條帶；以od260/od280比值鑒定總rna的純度，其比值為1.95；-80℃保存。
2.第一鏈cdna的合成
(1)rna的熱變性：
將以上成分混勻，在離心機上甩一下，于65℃孵育變性5min，立即放于冰上。
(2)反應液配置：
(3)逆轉錄反應：
將反應液輕輕混勻，加1滴礦物油后進行如下操作：室溫10min；42℃恒溫1h；冰浴5min；合成cdna第一鏈。瞬時離心后進行下一步操作或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.ld-pcr合成雙鏈cdna
以合成的cdna第一鏈為模板，進行pcr擴增。pcr反應體系如下：
將反應液輕輕混勻，在離心機上甩一下。加2滴礦物油，將反應管置于已預熱至95℃的pcr儀上，進行l(wèi)d-pcr。
反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸lmin，共循環(huán)30次；72℃延伸5min后結束反應。
擴增產物用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，電壓4v/cm，電泳1h，凝膠成像儀下觀察。
4.ld-pcr產物的蛋白酶k消化
50μl雙鏈cdna(2μg)，加入2μl蛋白酶k(20μg/μl)，45℃水浴20min，以消化樣品中殘存的酶類。加入50μl去離子水，100μl酚仿醇(酚：仿：醇＝50:49:1)14000r/min離心5min，取上層水相，向其中加入100μl氯仿和異戊醇的混合物14000r/min離心5min后，取上層水相并向其中加入10μl乙酸鈉(3mol/l)，1.3μl糖原(20μg/μl)，2.5倍體積的95％乙醇，14000r/min下迅速離心20min，超凈臺中干燥沉淀。
5.cdna進行sfiⅰ酶切
進行sfiⅰ(a，b)酶切，向上步驟中得到的沉淀中加入下列試劑：
將反應液輕輕混勻，在離心機上甩一下，50℃保溫2h。加入2μl二甲苯胺(1％)，輕輕混勻備用。
6.cdna分級分離
按試劑盒使用說明操作，將100μlsfiⅰ(a，b)酶切過的雙鏈cdna和二甲苯胺的混合物，用chromaspin-400柱分級分離，將分離后的cdna片段大于300bp的收集管合并，并經進一步純化后備用。
7.cdna片段和載體pdnr-lib的連接
雙鏈cdna片段與經相同的sfiⅰ(a，b)酶切的載體pdnr-lib(1μl)的連接反應體積比分別采用0.5:1，1:1和1.5:1，以此來測試連接效率，將測試后余下的cdna以最優(yōu)化條件進行連接，在t4dna連接酶作用下16℃連接過夜。重新純化連接產物，以除去其中的離子，為電轉化做準備。
8.細菌dh5α感受態(tài)細胞的制備
挑取平板上的dh5α單菌落接種于3mllb培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)。取此培養(yǎng)液按1/100體積接種于新鮮的lb培養(yǎng)液中，37℃200r/min劇烈振蕩培養(yǎng)至od600為0.4左右。將錐形瓶取出立即置冰浴15min。將菌液轉移到滅菌并經預冷的50ml離心管中，4℃，3000r/min離心10min。棄去上清液，加預冷的無菌雙蒸水10ml重懸菌體。將兩個離心管中的菌液合并，4℃，3000r/min離心10min。棄去上清液，加預冷的0.1mcacl210ml重懸菌體，冰浴15min。4℃，3000r/min離心10min。盡量棄去上清液，然后加入2ml預冷的0.1mcacl2，輕輕重懸細胞。將上述菌液分裝于1.5ml離心管中，每管200μl。4℃存放24h后使用。4℃存放一周可滿足轉化的要求，加甘油至15％放置于-80℃可保存較長時間。
9.重組質粒的轉化和篩選
將連接產物加入100μl制備的感受態(tài)細胞中，冰上靜置30min。42℃熱擊45s，立即放回冰中l(wèi)min。加入890μllb培養(yǎng)基，37℃靜置10min后，再于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)60min，使菌體復蘇并表達抗性基因。在含有氯霉素(100μg/ml)的選擇性平板上涂布10μliptg(20mg/ml)和40μlx-gal(200mg/ml)，待其完全吸收后涂布200μl菌液，37℃正置60min，待液體全部吸收后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)18h。采用α-互補法對重組質粒進行藍白斑初步篩選。
10.重組質粒的鑒定
用無菌牙簽挑取lb平板上的白色菌落，接種到5mllb液體培養(yǎng)基中(100pg/ml氯霉素)，37℃培養(yǎng)過夜，對菌液進行pcr鑒定、酶切鑒定和測序鑒定。重組質粒的pcr鑒定：以培養(yǎng)的白色菌落的菌液為模板進行pcr鑒定。pcr的引物為m13+和m13-(pdnr-lib載體上含有m13±序列)，pcr擴增條件：94℃變性5min；94℃2min，53℃1min，72℃2min，進行30個循環(huán)；72℃保溫20min。1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測重組率和插入cdna片段大小。
重組質粒的測序鑒定：將pcr鑒定正確的重組質粒，送測序公司進行測序。
11.擴增文庫滴度測定
取1μl原始文庫(總體積1ml)，分別進行l(wèi):1000，1:10000，1:100000稀釋后，各取1μl加入用適量lb培養(yǎng)基稀釋后涂布于含氯霉素的lb平板上，培養(yǎng)18h計數(shù)克隆數(shù)。
文庫滴度(cfu/ml)＝克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103
將原始文庫在數(shù)個lb平板上涂布以擴增文庫，擴增文庫滴度以同樣方法測量。用lb培養(yǎng)基洗下平板上菌落，加入滅菌后的甘油，分裝于離心管中，-80℃保存。
12.分解酶基因cdna的序列分析
利用blast工具，與genbank的數(shù)據庫進行同源比較。發(fā)現(xiàn)一個序列與其它赤霉烯酮分解酶的cdna有一定的同源性，經分析確認為是赤霉烯酮分解酶cdna序列，該序列如seqidno:1所示，對應的氨基酸序列如seqidno:2所示。
實施例2：赤霉烯酮分解酶在枯草芽孢桿菌中的重組表達
1.根據seqidno：1，設計引物如下：
p1：5’-gtggggttcaagaaaggcctg-3’(seqidno:3)；
p2：5’-cccaagcttctagaacttgccaaggaacttggc-3’(引入hindⅲ酶切位點)(seqidno:4)。
以pet30a-zenjlm質粒為模板擴增zen-jlm基因，pcr體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；變性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物。
2.以枯草芽胞桿菌基因組dna為模板，根據genbank中已知的序列設引物擴增p43啟動子序列，引物p3中引入ecorⅰ酶切位點，設計的引物如下：
p3：5’-cggaattccttgtagagctcagcattattg-3’(seqidno:5)；
p4：5’-gtgtacattcctctctttataatggtaccgctatcac-3’(seqidno:6)。
以枯草芽孢桿菌基因組為模板來擴增p43基因，pcr反應體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
3.以枯草芽胞桿菌基因組dna為模板，根據genbank中已知的序列設計引物擴增中性蛋白酶基因nprb的信號肽編碼序列，在p5中將起始密碼子(ttg)改為atg，設計的引物如下：
p5：5’-aagagaggaatgtacacatgcgcaacttgaccaag-3’(seqidno:7)；
p6：5’-ttgaaccccactgaggcatgtgttac-3’(seqidno:8)。
以枯草芽孢桿菌基因組為模板來擴增nprb信號肽基因，pcr反應體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
4.以純化后的p43啟動子和nprb信號肽pcr產物混合物為模板，以p3、p6為引物，利用重疊延伸法(soe)擴增，將p43啟動子和nprb信號肽編碼序列融合，得到p43+nprb；純化回收后的產物與zen-jlm回收產物混合作為模板，以p3、p2為引物，利用重疊延伸法(soe)擴增，將p43啟動子和nprb信號肽編碼序列及peat基因序列融合，得到p43+nprb+zenjlm。
p43+nprb融合pcr反應體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；72℃10min。
p43+nprb+zenjlm融合pcr反應體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。
5.p43+nprb+zenjlm與pmdl8-tsimple載體連接，轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，制備陽性克隆，并選用引物p3/p2進行菌液pcr來篩選陽性克隆。
p43+nprb+zenjlm融合pcr產物和pmdl8-tsimple載體的連接反應體系如下，16℃過夜連接。
6.從陽性克隆中提取質粒，將提取的含有p43+nprb+zenjlm的t載體質粒和phy300-plk質粒進行雙酶切。將回收到的雙酶切目的片段進行連接，得到重組的穿梭表達載體phy43n-zenjlm。將連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，進行陽性克隆檢測，并提取質粒phy43n-zenjlm進行雙酶切鑒定。
陽性克隆檢測反應體系如下：
反應程序：94℃預變性3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
含有p43+nprb+zenjlm的t載體質粒和phy300-plk質粒按以下反應體系進行雙酶切：
37℃，反應3h。
將回收到的酶切目的片段，按照以下反應體系進行連接，16℃過夜連接，得到重組的穿梭表達載體phy43n-zenjlm。
將從鑒定正確的陽性克隆中提取的phy43n-zenjlm質粒按照下列反應體系，37℃水浴，反應3h，進行酶切鑒定：
7.以枯草芽孢桿菌wb800為受體菌，通過電擊轉化的方法，將構建好的重組表達載體phy43n-zen-jlm轉入枯草芽孢桿菌中，采用pcr、rt-pcr及酶切等方法對轉化結果進行了檢測，獲得了重組菌株wb800-zen-jlm。利用sds-page檢測了赤霉烯酮分解酶(zen-jlm)在枯草芽孢桿菌wb800中的分泌表達情況，得知該酶在枯草芽孢桿菌wb800中大量表達。
實施例3：重組赤霉烯酮分解酶的分離純化
種子液的制備:將重組菌株wb800-zen-jlm菌種接種入lb培養(yǎng)基中,250ml三角瓶的裝液量為50ml,然后放入37℃恒溫振蕩搖床中,200r/min,培養(yǎng)24h。
發(fā)酵上清液的制備及分離純化:在20l發(fā)酵館中裝入14llb培養(yǎng)基,高壓蒸汽滅菌后按5％(v/v)的接種量接種搖瓶種子液。發(fā)酵時,溶氧量為60％,磁力攪拌速度為200r/min,在37℃下發(fā)酵培養(yǎng)24h發(fā)酵結束后,將發(fā)酵液在4℃冷凍離心機中5000r/rnin離心lomin,離心得到的發(fā)酵上清液用于蛋白沉淀。用飽和度為40％的(nh4)2so4溶液，4℃,5h，沉淀上清蛋白。經檢測，重組赤霉烯酮分解酶的濃度為29.80μg/ml。
實施例4：重組赤霉烯酮分解酶的活性測定
本實施例取成功表達赤霉烯酮分解酶的枯草芽孢桿菌和對照菌株的上清液對zen進行降解。反應體系1000μl:上清液50μl；0.5mg/mlzen50μl；0.05mtris-hcl(ph7.5)900μl。反應體系混勻后37℃反應30min加入等體積甲醇終止反應，利用hplc檢測zen殘留量。檢測表明，上清液降解了15μgzen，酶活力達15u/ml。
實施例5：重組赤霉烯酮分解酶對玉米粉中zen的降解測定
本實施例用酶發(fā)酵液對含zen(2mg/kg)的玉米粉進行處理，玉米粉中酶液的添加量為0.5ml/g。處理6h，zen的降解率即達到64.29％，處理24h，玉米碴中zen的降解率為85.5％。該實施例表明，該重組赤霉烯酮分解酶對玉米粉中zen有很好的降解效果。
實施例6：重組赤霉烯酮分解酶對采食玉米赤霉稀酮污染日糧母豬的作用效果
重組赤霉烯酮分解酶經深層液體發(fā)酵而精制而成，酶活力為60u/mg，由廣州和仕康生物技術有限公司生產制備。
選用平均體重為38.94±1.32kg的杜長大三元雜交母豬36頭,分為3個處理組,每個處理6個重復,每個重復2頭豬,各處理間初始體重差異不顯著(p＞0.05)，實施期30天。
實施例分為三個處理,其中對照組(c)飼喂正常玉米型日糧,處理組1(t1)飼喂霉變玉米型日糧(使用等量霉變玉米全部替換對照組的正常玉米型日糧中的玉米),處理組1(t2)日糧為在t1組的日糧中添加30g/kg的重組赤霉烯酮分解酶,t1和t2組日糧中zea的含量實測值為245.67±1.41μg/kg。
在實施0-3d中，各組間母豬陰戶面積均沒有出現(xiàn)顯著差異(p>0.05),且沒有出現(xiàn)明顯的紅腫現(xiàn)象。在實施3-10d中,t1和t2兩個處理組中豬陰戶面積大小水平相同,均明顯高于c組,并且出現(xiàn)紅腫癥狀。在實施10-17d中,t2處理組母豬的陰戶面積逐漸恢復至正常c組水平,紅腫癥狀逐漸消失,而t1處理組中母豬的陰戶面積始終大于c組,且陰戶紅腫癥狀越來越嚴重。在實施17-24d中，t1組中豬的陰戶面積仍然高于c組和t2組的豬的陰戶面積,且紅腫現(xiàn)象仍未消失,而t2組與c組的豬陰戶面積趨于一致。
本實施例發(fā)現(xiàn),日糧中zea含量為238.57ng/kg時,即可導致母豬的陰戶紅腫；而在zea霉變日糧中添加重組赤霉烯酮分解酶,能顯著改善母豬陰戶紅腫癥狀,使其達到正常c組水平。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
序列表
<110>廣州和仕康生物技術有限公司
<120>一種赤霉烯酮分解酶及其編碼基因和用途
<160>8
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>477
<212>dna
<213>粉紅螺旋聚孢霉(gliocladiumroseum)
<400>1
cgcattcgcagcacaatctcgaccccgggtaccggacccgacgttgtcctcgtccctcgc60
tccgtgtcgcagattgctgctcaaggcacctacactgaggtcacggcccagaagctgctg120
ttgctcggttaccccgacaggatacgcggctcggaggcgtggcaagccatgggggacgag180
gctctgcgtgggaagcccctggactggttctttgacaacattgttaccgctaccaagccg240
gtttgggctcgaggataccctcgcactctcgaagacgaggaaatctcaaagatcctgctt300
gacatcaagcacgctactgtctggggcctactggaccacctttcaaacaccgctgtgatg360
catttcccttatgtttcccacccggacgctggtgtcaacattgggttgcttccagggttc420
agggtcactacgtttgatatgcccggacagaagtatcttaagttccttggcaagttc477
<210>2
<211>159
<212>prt
<213>粉紅螺旋聚孢霉(gliocladiumroseum)
<400>2
argileargserthrileserthrproglythrglyproaspvalval
151015
leuvalproargservalserglnilealaalaglnglythrtyrthr
202530
gluvalthralaglnlysleuleuleuleuglytyrproaspargile
354045
argglyserglualatrpglnalametglyaspglualaleuarggly
505560
lysproleuasptrpphepheaspasnilevalthralathrlyspro
65707580
valtrpalaargglytyrproargthrleugluaspglugluileser
859095
lysileleuleuaspilelyshisalathrvaltrpglyleuleuasp
100105110
hisleuserasnthralavalmethispheprotyrvalserhispro
115120125
aspalaglyvalasnileglyleuleuproglypheargvalthrthr
130135140
pheaspmetproglyglnlystyrleulyspheleuglylysphe
145150155
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gtggggttcaagaaaggcctg21
<210>4
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
cccaagcttctagaacttgccaaggaacttggc33
<210>5
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
cggaattccttgtagagctcagcattattg30
<210>6
<211>37
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
gtgtacattcctctctttataatggtaccgctatcac37
<210>7
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
aagagaggaatgtacacatgcgcaacttgaccaag35
<210>8
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
ttgaaccccactgaggcatgtgttac26