一種基于多肽的玉米赤霉烯酮抗體模擬物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可作為玉米赤霉烯酮抗體模擬物的十二 肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類(lèi)雌激素樣真菌毒素， 其化學(xué)名為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基）0 -雷鎖酸內(nèi)酯，廣泛存在于霉變的玉米、 高粱、小麥、燕麥、大麥等谷類(lèi)作物以及奶中。由于ZEN在谷物糧食中污染普遍，可通過(guò)食物 鏈的作用對(duì)家禽及人體健康產(chǎn)生毒害作用，因此對(duì)ZEN的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。
[0003] 目前比較常用的檢測(cè)ZEN的方法主要包括：高效液相色譜法（Highperformance liquidchromatography，HPLC)，氣相色譜法（Gaschromatography，GC)，薄層層析法（Thin layerchromatography，TLC)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Highperformanceliquid chromatography-masssepectrum，HPLC-MS)，微生物檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法等，其中免疫學(xué) 分析方法以其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單以及可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；Y選等優(yōu)點(diǎn)，在ZEN的快速檢測(cè)領(lǐng)域 中得到了廣泛的應(yīng)用。
[0004] 免疫學(xué)分析方法的核心在于抗原-抗體間的特異性識(shí)別及結(jié)合，因此制備特異性 結(jié)合抗原的抗體就成為發(fā)展免疫學(xué)分析方法的前提與核心?？贵w的研宄近年來(lái)發(fā)展迅猛， 已經(jīng)從傳統(tǒng)的多克隆、單克隆抗體，發(fā)展至以單鏈抗體、噬菌體展示抗體、單域重鏈抗體、抗 獨(dú)特型抗體等為代表的基因工程抗體領(lǐng)域。新型抗體具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、可自我進(jìn) 化、制備快捷的特點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)。例如，單克隆抗體、單鏈抗體、單域重鏈抗體的分子量逐漸 減少，分別為150、30-50、15-20kDa，以Lipocalin為骨架蛋白的抗體類(lèi)似物為18-20kDa，而 核酸適配體則僅為一小段核酸序列。
[0005] 隨著噬菌體展示多肽庫(kù)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)的淘選，可快速、簡(jiǎn) 單地獲得與特定靶體分子特異性結(jié)合的多肽分子，因此，多肽分子可成為傳統(tǒng)抗體的替代 物并應(yīng)用于免疫學(xué)分析體系。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)的主要特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)靶 體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高 親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用 廣泛，但是上述噬菌體展示多肽技術(shù)的應(yīng)用大多局限于以大分子蛋白質(zhì)為靶體分子進(jìn)行親 和淘選。由于蛋白質(zhì)表面具有多個(gè)拷貝的表位，因此非常容易獲得與之對(duì)應(yīng)結(jié)合的多肽分 子。目前的多肽分子大多作為抗原的模擬表位（抗原替代物）應(yīng)用于免疫學(xué)分析中，而將 多肽分子作為小分子物質(zhì)抗體的替代物應(yīng)用于免疫學(xué)分析的報(bào)道較少，其原因在于，小分 子物質(zhì)體積過(guò)小，且表面沒(méi)有豐富的氨基、羧基基團(tuán)，難以與多肽分子結(jié)合，從而造成淘選 困難。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)噬菌體展示多肽庫(kù)技術(shù)，采用磁珠液相親和淘選并結(jié)合ZEN抗體競(jìng)爭(zhēng) 性洗脫的方式，通過(guò)優(yōu)化孵育、洗脫時(shí)間，溫度等條件，從噬菌體展示多肽庫(kù)中快速篩選到 能與ZEN特異性結(jié)合的多肽分子，該多肽分子具有與傳統(tǒng)的ZEN單克隆抗體分子相似的免 疫學(xué)檢測(cè)特性，可作為傳統(tǒng)ZEN抗體的替代物應(yīng)用于ZEN的免疫學(xué)分析體系。該方法避免了 制備傳統(tǒng)的單克隆抗體分子所需要經(jīng)過(guò)周期長(zhǎng)的免疫過(guò)程、細(xì)胞融合、單克隆篩選等流程， 具有無(wú)需免疫過(guò)程、篩選方便、周期短、制備成本低等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明以ZEN全抗原（ZEN與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物ZEN-BSA)為靶分子，將靶分 子結(jié)合到磁珠上，投入噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫(kù)，進(jìn)行磁珠液相親和淘選，結(jié)合ZEN抗體競(jìng) 爭(zhēng)性洗脫的方式，優(yōu)化淘選、洗脫時(shí)間及溫度等條件，獲得了一種可特異性結(jié)合ZEN的多肽 分子，其氨基酸序列為：SSILMKLRPLKH。
[0008] 上述多肽分子結(jié)構(gòu)中，大寫(xiě)英文字母分別代表已知天然L-型氨基酸殘基或其 D-型異構(gòu)體的一種，即S代表絲氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，M代表 甲硫氨酸殘基，K代表賴(lài)氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，H代表組氨酸殘 基。
[0009] 本發(fā)明還涉及編碼上述多肽分子氨基酸序列的核苷酸，其序列為：
[0010] TCTTCTATTCTTATGAAGCTTAGGCCTCTTAAGCAT
[0011] 本發(fā)明提及多肽分子可通過(guò)噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn) 行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有多肽分子的噬菌體，通過(guò)生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖 生產(chǎn)展示有多肽分子的噬菌體粒子?；瘜W(xué)合成是指依據(jù)公布的模擬表位的氨基酸序列，通 過(guò)化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成。基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼多肽分子的基 因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行多肽分子的大量制備。
[0012] 本發(fā)明還涉及所述多肽分子在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)的類(lèi)型包括 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類(lèi)型。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所提及的多肽分子可替代傳統(tǒng)的ZEN抗體分子，作 為ZEN的結(jié)合分子直接應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)分析，基于多肽分子的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 其線(xiàn)性范圍寬廣，該多肽分子具有無(wú)需免疫過(guò)程、獲取方便、快速、周期短等特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1基于多肽的ZEN抗體模擬物的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1.基于多肽的ZEN抗體模擬物的磁珠液相親和淘選及其鑒定
[0016] 1)親和淘選與ZEN特異性結(jié)合多肽分子的具體方法為：為高效獲得可與ZEN分子 特異性結(jié)合的多肽分子，采用了磁珠液相親和淘選并結(jié)合ZEN抗體競(jìng)爭(zhēng)性洗脫的方式，具 體方法為：取I.Omg羧基化的磁珠分子（直徑1500nm)，用PBST洗滌3次。加入10yL噬菌 體隨機(jī)展示十二多肽庫(kù)（2X10npfu，NEB公司），后加入900yLPBST，與磁珠混合，室溫下 輕搖震蕩反30min，磁分離后（此步驟的目的在于去除噬菌體展示肽庫(kù)中與磁珠表面修飾 基團(tuán)結(jié)合的多肽分子，這類(lèi)多肽分子吸附在磁珠表面并通過(guò)磁分離而去除掉），小心吸取上 清液（不與磁珠表面修飾基團(tuán)結(jié)合的多肽分子）至另一新離心管，加入I.OmgZEN-BSA偶聯(lián) 的磁珠（直徑1500nm，ZEN-BSA的偶聯(lián)量為I.Omg，ZEN=BSA的偶聯(lián)比為10:1，偶聯(lián)物的制備 方法參見(jiàn)Burkineaal.，2000,Appliedbiochemistryandmicrobiology, 36, 282-288))， 室溫下震蕩反應(yīng)30min。磁分離后，用TBST洗滌6次，洗去未結(jié)合的噬菌體。加入ImL50ng/ mLZEN抗體（PBS體系），室溫下輕搖震蕩30min。磁分離后，小心吸取上清，獲得第一輪 親和淘選產(chǎn)物，留10UL測(cè)滴度，將剩余噬菌體投入處于對(duì)數(shù)前期的ER2738進(jìn)行擴(kuò)增，然 后依次進(jìn)行第2輪和第3輪淘選，淘選步驟與第一輪大體相同，每次加入的噬菌體量均為 2X10npfu，不同之處在于：第2、3輪篩選的噬菌體展示多肽與ZEN-BSA偶聯(lián)磁珠的孵育時(shí) 間分別為20min、10min，競(jìng)爭(zhēng)洗脫液（ZEN抗體）的濃度分別為25ng/mL，15ng/mL。
[0017] 2)陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒定：從第三輪淘選后測(cè)定噬菌體滴度的平板中隨機(jī)挑 取80個(gè)噬菌體斑，進(jìn)行噬菌體的擴(kuò)增，采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法進(jìn)行陽(yáng)性噬菌體 克隆的鑒定，具體方法為：首先，用IOmMPBS(pH7.