一種黃曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a的復(fù)合免疫親和柱的制作方法
【專利說明】 一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉?fàn)N酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免
疫親和柱
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本實(shí)用新型屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免疫親和柱。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌毒素是由真菌生長產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，在糧食或飼料生產(chǎn)過程中，由于溫度、濕度等因素的影響，為真菌的生長繁殖提供適宜條件，從而引起真菌毒素的污染。據(jù)世界糧農(nóng)組織報(bào)告，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其毒素污染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。真菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，許多國家在近幾十年來制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類和動(dòng)物的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商的經(jīng)濟(jì)利益。到2003年末，大約有100個(gè)國家已經(jīng)為食品和飼料中的真菌毒素制定了各種特定的限量標(biāo)準(zhǔn)，而且該數(shù)目還在繼續(xù)增加之中。黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素是糧食飼料中常見的真菌毒素。
[0003]黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定出包括黃曲霉毒素&、82、61、62、]\11、]\12等17種之多，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最強(qiáng)，其毒性為氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，是目前發(fā)現(xiàn)的真菌類毒素中毒性最大、污染范圍最廣的毒素之一，與人的肝癌有密切關(guān)系，能使家畜、家禽及多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘發(fā)癌癥，國際癌癥中心將其定為一類致癌劑。玉米赤霉烯酮主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，具有雌激素樣作用，具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、返情等生殖異常現(xiàn)象，對(duì)家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。赭曲霉毒素由曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生，有A、B、C、D 4種化合物，赭曲霉毒素A分布最廣。赭曲霉毒素A已被國際癌癥研宄機(jī)構(gòu)確定為II B類致癌物的一種霉菌毒素，它能致癌、致畸、致突變、破壞免疫系統(tǒng)，對(duì)肝、腎臟造成損害，還可導(dǎo)致神經(jīng)中毒。
[0004]目前，真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法，免疫分析法及精密儀器分析法。其中，免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法，可以對(duì)樣品中的真菌毒素進(jìn)行快速的定量、定性檢測；精密儀器分析法主要有高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法，可以對(duì)樣品中的真菌毒素進(jìn)行精確定性、定量分析，是真菌毒素檢測的確認(rèn)方法。但是，由于需要檢測樣品種類繁多，影響因素各種各樣，要想使這些檢測方法能夠達(dá)到理想的檢測效果，則需要將樣品進(jìn)行不同程度的前處理。
[0005]免疫親和柱是利用抗原抗體反應(yīng)的高特異性和高親和力，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑻禺愋缘目贵w結(jié)合到固相載體上，以便有效的分離、純化目標(biāo)物質(zhì)，具有選擇性高、富集能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，用于真菌毒素檢測的樣本前處理，可以更好的消除影響因素，減小基質(zhì)效應(yīng)，減少假陽性和假陰性的出現(xiàn)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006]本實(shí)用新型的目的在于提供一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免疫親和柱，用于樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A檢測的樣品前處理方法。
[0007]本實(shí)用新型所述的免疫親和柱由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。其所用瓊脂糖凝膠為CNBr-S印harose 4B，每根親和柱含量為0.3ml_0.5ml ;每根親和柱所含抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體分別為0.4 mg -lmg、0.5 mg -2mg 和 0.4 mg -1mg ;柱管為 3ml 或 Iml 的柱管。
[0008]本實(shí)用新型所述的免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
[0009](I)抗體預(yù)處理:將純化好的抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3緩沖液中透析 12h ；
[0010](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCOgl沖液快速抽洗3次；
[0011](3)偶聯(lián):將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHCO3緩沖液抽洗；
[0012](4)封閉:將凝膠轉(zhuǎn)入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h ；
[0013](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0014](6)裝柱:將偶聯(lián)好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0015]本實(shí)用新型試紙條具有如下有益效果:
[0016](I)特異性好。本實(shí)用新型親和柱使用的是分別針對(duì)黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的單克隆抗體，只特異性純化富集黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A。
[0017](2)減少了樣品前處理過程中有機(jī)化合物的使用。
[0018](3)可以對(duì)樣品中的黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A同時(shí)進(jìn)行純化、富集。
【附圖說明】
[0019]圖1:親和柱結(jié)構(gòu)示意圖。其中I為上帽，2為柱管，3、5為篩板，4為凝膠，6為下帽。圖2:親和柱樣本純化流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]1、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免疫親和柱的制備
[0021](I)抗體預(yù)處理:將純化好的抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3緩沖液中透析 12h ；
[0022](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCOgl沖液快速抽洗3次；
[0023](3)偶聯(lián):將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHCO3緩沖液抽洗；
[0024](4)封閉:將凝膠轉(zhuǎn)入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h ；
[0025](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0026](6)裝柱:將偶聯(lián)好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0027]2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A復(fù)合免疫親和柱的使用方法
[0028](I)取25g粉碎的樣品與10ml甲醇-水(7:3)溶液混合；
[0029](2)加入5.0g氯化鈉以均質(zhì)器高速攪拌，提取2分鐘；
[0030](3) 4000r/min離心5min或用定性濾紙過濾；
[0031](4)取1ml濾液并加入40ml水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾；
[0032](5)取20ml (4)步濾液，以約6ml/min流速緩慢通過免疫親和柱；
[0033](6)以10.0ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2ml~3ml空氣通過柱體；
[0034](7)準(zhǔn)確加入1.0ml色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為I ml/min ~2ml/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種黃曲霉毒素B 1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠為CNBr-Sepharose4B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含抗黃曲霉毒素Bi單克隆抗體、抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體分別為0.4 mg -lmg、0.5mg _2mg和 0.4 mg -1mg0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含瓊脂糖凝膠為0.3ml_0.5ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的柱管為3ml或Iml的柱管。
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的復(fù)合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成，瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部，柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。本實(shí)用新型能夠與黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A特異結(jié)合，可用于飼料、食品等樣本中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A污染檢測的樣本前處理，起到凈化、富集作用。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號(hào)】CN204330779
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201420839759
【發(fā)明人】張波, 王松雪, 謝剛, 付曉玲, 雷達(dá), 劉向陽
【申請(qǐng)人】北京康源泰博生物科技有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日