人髓過氧化物酶(mpo)快速定量免疫層析檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法制備的人髓過氧化物酶MPO快速定量免疫層析檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)世界衛(wèi)生組織專家預(yù)測，至2030年，心肌梗死將成為導(dǎo)致人類死亡的頭號疾病。實(shí)際情況也確實(shí)如此，死亡原因檢測結(jié)果顯示，心臟病已成為我國城鎮(zhèn)居民最主要的死因，而且發(fā)病和死亡呈現(xiàn)明顯低齡化趨勢。因此心肌梗死的早期預(yù)防和及時治療對于挽救病人的生命具有極大的意義。髓過氧化物酶(MPO)與心肌梗塞和冠狀動脈的炎癥密切相關(guān)，是心梗的早期預(yù)警生物標(biāo)志物之一。MPO是一種過氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的嗜天青顆粒中，炎癥時激活的嗜中性粒細(xì)胞發(fā)生脫顆粒并釋放髓過氧化物酶，它導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化病灶不穩(wěn)定甚至是破裂，使血管內(nèi)皮下膠原組織暴露，隨之發(fā)生血小板粘附聚集和血栓形成，造成冠狀動脈阻塞，發(fā)生急性冠狀動脈綜合癥(ACS)，甚至是嚴(yán)重的心肌不可逆缺血損傷。MPO通過產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)，促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定性增加，引起急性冠脈綜合癥。大量臨床研宄資料表明，急性冠狀動脈綜合癥的病人血清中MPO水平顯著地升高，是預(yù)測ACS患者發(fā)生不良心血管事件的一個新的預(yù)測因子，特別是在肌鈣蛋白(cTnl)水平較低的患者，MPO能夠識別那些將來發(fā)生心血管事件危險性較高的患者，并可在心梗發(fā)生前3小時發(fā)出預(yù)警。
[0003]目前國內(nèi)外已有檢測MPO的試劑盒，主要采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法、非均相免疫法和半定量膠體金法等，少數(shù)公司的產(chǎn)品已經(jīng)獲得FDA注冊或CE認(rèn)證。酶聯(lián)免疫法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光法的缺陷是檢測時間長，需要大型儀器設(shè)備或經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的技術(shù)人員，此定量檢測的方法耗時I小時以上，對于急性心梗病人而言可能喪失了最佳治療時間。而免疫比濁法雖然檢測時間短，但需要儀器設(shè)備進(jìn)行檢測。定性或半定量膠體金法沒有準(zhǔn)確定量幾個關(guān)鍵的區(qū)間值，必須借助儀器才能半定量地判斷MPO的數(shù)值。而MPO的定量是具有積極臨床價值的，我們對臨床肌鈣蛋白檢測陰性和陽性的心?；颊吒?00例進(jìn)行MPO檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同心梗階段病人的MPO數(shù)值差距巨大，可從6.25至6000ng/ml，而不同階段的數(shù)值又代表心梗的嚴(yán)重程度，因而對MPO進(jìn)行快速定量是具有積極的臨床意義的，尤其對于急性胸痛病人。
[0004]針對上述缺陷，本實(shí)用新型采用免疫層析膠體金技術(shù)，根據(jù)檢測線的強(qiáng)弱和樣品中的濃度呈正相關(guān)原理，發(fā)明了一種即可快速檢測，又可準(zhǔn)確定量MPO濃度的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測時間長、需要配備特殊的儀器設(shè)備和技術(shù)人員、快速檢測試劑不能定量等缺陷。本實(shí)用新型不需使用任何設(shè)備，只需一滴血樣即可在15分鐘內(nèi)檢測出MPO的數(shù)值，可以方便地在各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)、急診中心、老年保健機(jī)構(gòu)進(jìn)行使用，為急性胸痛病人提供一種快速的、初步的心梗分型指南，指導(dǎo)臨床醫(yī)生更好地采取下一步診治措施，以挽救病人的生命。該實(shí)用新型具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，用于心肌梗塞的預(yù)警。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本實(shí)用新型的目的是提供人髓過氧化物酶(MPO)快速定量免疫層析檢測試劑盒，具有全程定量或半定量檢測能力，操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，用于心肌梗塞的預(yù)警。
[0006]一種人髓過氧化物酶(MPO)快速定量免疫層析檢測試劑盒，其可以快速檢測人血漿或血清中的MPO含量，以預(yù)警早期發(fā)生心肌梗塞的風(fēng)險，該試劑盒由試紙卡和比色卡構(gòu)成，其中:
[0007]試紙卡結(jié)構(gòu)為:在塑料底板一端粘貼上樣墊，上樣墊的一端緊密壓接含有標(biāo)記抗人髓過氧化物酶(MPO)特異性抗體的膠體金墊，膠體金墊的一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜，硝酸纖維素NC膜上包被有相互分離的檢測線T和質(zhì)控線C，檢測線T為和標(biāo)記抗體配對的定量MPO抗體，質(zhì)控線C為IgG抗體，硝酸纖維素NC膜的另一端連接吸樣墊形成試紙條，試紙條裝入塑料墊中形成試紙卡，所述定量MPO抗體是定量的MPO捕獲抗體、可以對樣品中的MPO濃度進(jìn)行定量區(qū)間檢測，所述檢測線T有三條，分別對應(yīng)6.25、100、400ng/ml的MPO濃度。
[0008]進(jìn)一步地，所述標(biāo)記抗體為MPO抗體，分別識別人髓過氧化物酶的不同表位，該MPO抗體為純化的人髓過氧化酶特異性單克隆抗體或多克隆抗體。
[0009]進(jìn)一步地，所述比色卡是白色背景上印有7條不同深淺紅色線條，用于對檢測結(jié)果的對比判斷及定量判斷，分別對應(yīng)400、200、100、50、25、12.5,6.25ng/ml的MPO濃度。
[0010]進(jìn)一步地，硝酸纖維素NC膜為孔徑5?12 μ m的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊為吸水濾紙。
[0011 ] 所述試紙卡，NC膜抗體的包被過程為:以0.01MpH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將MPO抗體配制成0.5?2mg/ml的溶液，將羊抗鼠IgG配制成0.5?2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜上以I?1.5ul/cm的參數(shù)進(jìn)行分別劃線，包被C、T線，三條T線的用量比例分別為I倍、16倍、64倍。劃線后將NC膜在溫度20?25°C，相對濕度小于30%的干燥間，干燥2?5小時。
[0012]所述試紙卡，膠體金墊制備過程為:以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30?50nm的膠體金溶液，制備完成后取10ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2MK2C03調(diào)至PH8.0左右，按10ml膠體金溶液加入0.5?2mg和包被MPO配對的另一 MPO抗體，室溫攪拌2小時，加入終濃度為I %牛血清白蛋白，I %聚乙二醇20000封閉20min，12000r/min離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至50ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置溫度20?25°C，相對濕度小于30%的干燥間，干燥2?5小時，制成膠體金墊。
[0013]所述試紙卡的裝配過程為:在溫度20?25°C，相對濕度小于40%的干燥室內(nèi)，取塑料底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/4粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘帖；最后用裁剪機(jī)將貼好的塑料板切成3?5mm寬的試紙條，再裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。
[0014]所述試劑盒，檢測方法為:
[0015]I)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；
[0016]2)精確吸取10 μ I血清、血漿樣本，樣本為全血時吸取20ul，加入潔凈的離心管中，再用樣本稀釋液(生理鹽水或PBS)進(jìn)行10倍稀釋，充分混勻；
[0017]3)用移液槍吸取1ul稀釋后的樣本加入到樣本孔中，15?20分鐘內(nèi)用膠體金比色卡(半)定量判定結(jié)果；
[0018]4)用比色卡判定結(jié)果時，將試紙卡T線顯示的條數(shù)和比色卡上標(biāo)準(zhǔn)線進(jìn)行對比，定量判定樣品的濃度區(qū)間。
[0019]本實(shí)用新型的有益效果是:提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)制備的人髓過氧化物酶(MPO)快速定量免疫層析檢測試劑盒，定量檢測范圍寬，適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，對胸痛患者進(jìn)行心肌梗死預(yù)警。
【附圖說明】
:
[0020]圖1是人髓過氧化物酶(MPO)快速定量免疫層析檢測試劑盒的試紙條。
[0021]附圖符號說明:
[0022]1:塑料底板；2:上樣墊；3:膠體金墊；4:NC膜；
[0023]5、6、7:檢測線T ；8:質(zhì)控線C ；9:吸樣