本發(fā)明涉及酶工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，又稱f-2毒素，為2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，主要是由禾谷鐮刀菌次級代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素。zen具有雌激素活性，對生殖系統(tǒng)有毒害作用，攝入過量zen導(dǎo)致動物外陰和乳腺腫大甚至陰道及直腸脫垂；影響哺乳動物乳房發(fā)育，導(dǎo)致哺乳推遲、假孕，甚至不孕或?qū)е铝鳟a(chǎn)，胎兒畸形和死胎。zen可以引發(fā)腫瘤，不僅通過增加細胞色素cyp1a1酶活性來刺激人類乳腺癌mcf-7細胞的生長，同時也是食管癌發(fā)病率增加的病因之一。zen對人和動物腎臟、肝臟和血液也具有明顯的毒害作用。

zen的脫毒方法可以分為物理、化學(xué)和生物三大類，其中物理法有高壓加熱、輻照和吸附劑吸附等，化學(xué)法有臭氧、雙氧水和碳酸鈉處理等，生物法有微生物降解、微生物吸附和酶降解等。但傳統(tǒng)的物理和化學(xué)脫毒方法會破壞營養(yǎng)物質(zhì)、引入化學(xué)物質(zhì)造成二次污染等問題，其應(yīng)用受到一定的局限。生物降解法具有反應(yīng)條件溫和、專一性高、無殘留、環(huán)境友好等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2002年，kakeya分離到一株粉紅粘帚霉(clonostachysroseaifo7063)菌株，能夠破壞zen的內(nèi)酯環(huán)，將zen完全轉(zhuǎn)化為無任何雌激素活性的代謝產(chǎn)物，并確定由單拷貝基因zhd101所編碼的堿性乳糖水解酶是降解zen的功能性蛋白質(zhì)(kakeya等，一株粉紅粘帚霉將玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化無雌激素活性的化合物.生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物化學(xué)雜志，2002)。utermark和karlovsky的插入失活實驗證明了zhd101編碼酶對zen的降解作用(utermak和karlovsky，玉米赤霉烯酮內(nèi)酯水解酶在保護粉紅粘帚霉免受玉米赤霉烯酮殺菌作用中的角色，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，2007)，tomok等把zhd101轉(zhuǎn)化到玉米中，發(fā)現(xiàn)玉米也表現(xiàn)出對zen的降解能力(tomok等，通過降解基因來減少玉米籽粒中真菌毒素玉米赤霉烯酮的污染，應(yīng)用與環(huán)境微生物，2007)。

中國發(fā)明專利zl201110082679.x同樣從粉紅粘帚霉(clonostachysrosea)中克隆獲得玉米赤霉烯酮解毒酶zlhy-6(與2002年kakeya獲得的zhd101編碼酶只有4個氨基酸差異，蛋白同源性98％)及其編碼基因。然而，該酶的最適ph為8.5，ph5.0和6.5時該酶的降解能力分別僅為ph8.5時的15％和25％，由此可見酸性條件嚴(yán)重抑制玉米赤霉烯酮解毒酶的活性；該解毒酶主要是作為添加劑混到豬、雞飼料中，在豬、雞體內(nèi)降解玉米赤霉烯酮，而豬、雞腸道ph值在5.5～6.5之間，因此亟需對玉米赤霉烯酮解毒酶進行耐酸改造，使其活性最適ph由8.5變?yōu)槠嵝?。不僅如此，上述技術(shù)方案還將克隆獲得的玉米赤霉烯酮解毒酶編碼基因連接到質(zhì)粒ppic9k并轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得能夠表達玉米赤霉烯酮解毒酶的重組畢赤酵母菌株，但是玉米赤霉烯酮解毒酶的活性(表達量)很低，1ml重組酵母發(fā)酵上清液在2h時只可以降解18.8μg的zen。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的第一個目的是實現(xiàn)玉米赤霉烯酮解毒酶的耐酸性，擴大其解毒活性ph范圍，本發(fā)明的第二個目的是實現(xiàn)該耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶的高效表達。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供一種耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶zde-3，是如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)：

(1)由seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)由seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且在ph為5.0～6.5時仍然具有降解玉米赤霉烯酮活性的由seqidno.1衍生的蛋白質(zhì)。

進一步地，編碼前述耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。

為了提高玉米赤霉烯酮解毒酶在酵母菌株中的表達量，本發(fā)明在所述耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶的基礎(chǔ)上，按照酵母密碼子的偏好性進行優(yōu)化，在795bp中改變了181bp，提供了一種可顯著增加表達量的編碼基因zde-3，其含有如seqidno.2所示的核苷酸序列。當(dāng)其為seqidno.2所示的核苷酸序列時，其與原序列的差異性為22.8％。

進一步地，含有所述編碼基因及優(yōu)化后的編碼基因的載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。

當(dāng)所述載體含有上述優(yōu)選編碼基因時，所述載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

(1)用限制性內(nèi)切酶ecori對seqidno.3所示的核苷酸序列α-zde-3和質(zhì)粒pao815進行酶切反應(yīng)；

其中，seqidno.3中274bp～1068bp是zde-3基因，8bp～273bp是α信號肽序列，1bp～7bp及1069bp～1074bp是ecori酶切位點；

其中，酶切體系優(yōu)選為：目的片段或質(zhì)粒15μl，10×ecorⅰbuffer2μl，ecori酶1μl，ddh2o2μl，酶切條件37℃反應(yīng)4h；

(2)將酶切后的質(zhì)粒pao815去磷酸化；

其中，去磷酸化反應(yīng)體系優(yōu)選為：酶切后的質(zhì)粒pao81515μl，antarcticphosphatase1μl，10×reactionbuffer2μl，ddh2o2μl，反應(yīng)條件37℃水浴1h，在65℃加熱5min，使磷酸化失活，處理好的載體備用；

(3)將酶切回收得到的基因片段和去磷酸化的質(zhì)粒pao815進行酶連接反應(yīng)，得到重組表達載體。

其中，酶連接反應(yīng)體系優(yōu)選為：載體pao8154μl，基因片段3μl，5×ligationbuffer2μl，t4ligase酶1μl，反應(yīng)條件22℃鏈接2h，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化；

(4)將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取菌落培養(yǎng)，分別進行pcr鑒定和重組表達載體的酶切鑒定，對pao815-α-zde-3進行測序，證明融合連接到質(zhì)粒pao815的dna序列與序列表seqidno.3相同，獲得含有玉米赤霉烯酮解毒酶基因序列的重組表達載體pao815-α-zde-3；

(5)單拷貝表達框的擴增：以重組表達載體pao815-α-zde-3為模板，用seqidno.4～5所示的引物進行pcr擴增，擴增出完整表達框5’aox-α-zde-3-3’aox-tt3’；

seqidno.4～5所示的引物分別為上游引物p1和下游引物p2：

上游引物p1：5’-ggaagatctaacatccaaagacg-3’，引入bglⅱ酶切位點；下游p2：5’-taggatccgcacaaacgaac-3’，引入bamhⅰ酶切位點。

其中，步驟(5)中的pcr反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，共35個循環(huán)；72℃延伸7min。

(6)單拷貝表達框的ta克?。簩cr擴增得到的完整表達框連接到pgm-t載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得重組菌株，挑取菌落37℃震蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，用bamhi單酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定含有完整表達框；

(7)多拷貝串聯(lián)表達框表達載體構(gòu)建：將步驟(6)中獲得的完整表達框經(jīng)bglⅱ和bamhⅰ雙酶切后，試劑盒回收，得到的表達框與經(jīng)bamhⅰ酶切處理并去磷酸化的重組質(zhì)粒pao815-α-zde-3連接，轉(zhuǎn)化top10，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定篩選2拷貝表達載體pao815-(α-zde-3)2。得到的2拷貝表達載體再與表達框進行酶切、酶連、轉(zhuǎn)化，如此反復(fù)篩選4、6拷貝數(shù)的表達載體pao815-(α-zde-3)4和pao815-(α-zde-3)6。

本發(fā)明還進一步提供一種高效表達所述玉米赤霉烯酮解毒酶的方法，是將前述玉米赤霉烯酮解毒酶的編碼基因連接到pao815載體中，構(gòu)建多拷貝(2-6拷貝)重組表達載體，接著將該重組表達載體導(dǎo)入宿主細胞，高效表達得到玉米赤霉烯酮解毒酶。

其中所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為酵母菌，所述酵母菌優(yōu)選為畢赤酵母(pichiapastoris)。

用于構(gòu)建所述重組大腸桿菌及重組酵母表達載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達外源基因的表達載體，如可在大腸桿菌及巴氏德畢赤酵母(pichiapastoris)中表達的ppic9k、ppic9、ppic3.5k、peb、pao815等。

應(yīng)當(dāng)理解的是，含有所述載體的工程菌或宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。

最后，本發(fā)明提供了所述耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其編碼基因在降解谷物或飼料中zen的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中玉米赤霉烯酮解毒酶不耐酸的問題。本發(fā)明通過對玉米赤霉烯酮解毒酶的氨基酸序列進行優(yōu)化，改變了解毒酶的8個氨基酸殘基(與zlhy-6解毒酶有8個氨基酸差異)，使重組表達玉米赤霉烯酮解毒酶最適反應(yīng)ph由8.5降低到6.5，與豬、雞腸道ph非常吻合，當(dāng)ph低至5.0時，解毒酶酶活仍保留40％以上，大大提高該玉米赤霉烯酮解毒酶作為飼料添加劑在實際應(yīng)用中的解毒效率。氨基酸改造后1ml酵母發(fā)酵上清液處理24h，可以將2g玉米碴中的zen含量由2000μg/kg降低到489.80μg/kg，降解率為75.51％，表明重組表達的玉米赤霉烯酮降解酶對玉米碴等谷物和飼料中zen具有非常好的降解效果。

不僅如此，本發(fā)明還通過對玉米赤霉烯酮解毒酶基因進行密碼子優(yōu)化，并將該基因在重組酵母基因組中的拷貝數(shù)增加到4，大大提高了玉米赤霉烯酮解毒酶的表達量，使同體積重組酵母發(fā)酵上清液的酶活是專利zl201110082679.x中酶活的72倍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中不同拷貝重組表達載體pao815-α-zde-3、pao815-(α-zde-3)2、pao815-(α-zde-3)4、pao815-(α-zde-3)6、轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物的sds-page圖。

圖2為本發(fā)明實施例4中重組玉米赤霉烯酮解毒酶的降解活性測定。

圖3為本發(fā)明實施例5中不同ph對玉米赤霉烯酮解毒酶降解活性的影響。

圖4為本發(fā)明實施例6中玉米赤霉烯酮解毒酶對玉米碴中zen的降解。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1玉米赤霉烯酮解毒酶的耐酸改造和密碼子偏好性優(yōu)化

1、對玉米赤霉烯酮解毒酶進行耐酸改造：在zlhy-6解毒酶的基礎(chǔ)上(zl201110082679.x，seqidno.6)，將52位精氨酸r、66位賴氨酸k、118位精氨酸r、148位賴氨酸k、175位精氨酸r、185位精氨酸r、189位氨基酸r和204位精氨酸替換為谷氨酸。得到玉米赤霉烯酮解毒酶(zde-3)，具體氨基酸序列見seqidno.1。

2、玉米赤霉烯酮解毒酶的編碼基因，在氨基酸殘基改造的基礎(chǔ)上，按照酵母密碼子的偏好性進行優(yōu)化，得到玉米赤霉烯酮解毒酶基因(zde-3)，具體核苷酸序列見seqidno.2。

實施例2重組表達載體的構(gòu)建

1、在實施例1中設(shè)計的玉米赤霉烯酮解毒酶基因(zde-3)前端添加α信號肽編碼序列，即α-zde-3，并在序列兩端引入ecori(gaattc)酶切位點。全序列核苷酸序列見seqidno.3。該核苷酸序列通過化學(xué)方法合成獲得。

2、含有玉米赤霉烯酮解毒酶編碼基因序列的重組表達載體的構(gòu)建

(1)用限制性內(nèi)切酶ecori對合成的α-zde-3核苷酸序列和質(zhì)粒pao815(美國invitrogen公司)進行酶切反應(yīng)，酶切體系20μl：目的片段或質(zhì)粒15μl，10×ecorⅰbuffer2μl，ecori酶1μl，ddh2o2μl，酶切條件37℃反應(yīng)4h。

(2)載體pao815去磷酸化反應(yīng)體系：酶切后載體15μl，antarcticphosphatase1μl，10×reactionbuffer2μl，ddh2o2μl，反應(yīng)條件37℃水浴1h，在65℃加熱5min，使磷酸化失活，處理好的載體備用。

(3)將酶切回收得到的基因片段和載體進行酶連接反應(yīng)，反應(yīng)體系10μl：載體pao8154μl，基因片段3μl，5×ligationbuffer2μl，t4ligase酶1μl，反應(yīng)條件22℃鏈接2h，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。

(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取菌落37℃震蕩培養(yǎng)12h，分別進行pcr鑒定和重組表達載體的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為pao815-α-zde-3。對pao815-α-zde-3進行測序，證明融合連接到質(zhì)粒pao815的dna序列與序列表seqidno.3相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮解毒酶基因序列的重組表達載體pao815-α-zde-3正確。

(5)單拷貝表達框的擴增。設(shè)計上游引物p1：5’-ggaagatctaacatccaaagacg-3’，引入bglⅱ酶切位點；下游p2：5’-taggatccgcacaaacgaac-3’，引入bamhⅰ酶切位點；以重組表達載體pao815-α-zde-3為模板，用引物p1/p2pcr擴增完整表達框5’aox-α-zde-3-3’aox-tt3’。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，(95℃30s，56℃30s，72℃60s)共35個循環(huán)，72℃延伸7min。

(6)單拷貝表達框的ta克隆。將pcr擴增得到的完整表達框連接到pgm-t載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得重組菌株，挑取菌落37℃震蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，用bamhi單酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定含有完整表達框。

(7)多拷貝串聯(lián)表達框表達載體構(gòu)建。步驟(6)中獲得的完整表達框經(jīng)bglⅱ、bamhⅰ雙酶切后，試劑盒回收。得到的表達框與經(jīng)bamhⅰ酶切處理并去磷酸化的重組表達載體pao815-α-zde-3連接，轉(zhuǎn)化top10，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定篩選2拷貝表達載體pao815-(α-zde-3)2。得到的2拷貝表達載體再與表達框進行酶切、酶連、轉(zhuǎn)化，如此反復(fù)篩選4、6拷貝數(shù)的表達載體pao815-(α-zde-3)4和pao815-(α-zde-3)6。

實施例3玉米赤霉烯酮解毒酶的高效表達

將重組表達載體pao815-α-zde-3、pao815-(α-zde-3)2、pao815-(α-zde-3)4和pao815-(α-zde-3)6用sali使之線性化后，采用電擊方式，將線性化載體的導(dǎo)入畢赤酵母gs115中，經(jīng)md選擇性培養(yǎng)基(1.34％ynb無氨基酵母氮源(yeastnitrogenbasewithoutaminoacids)、2％葡萄糖(d-glucose)、4×10^-5生物素(biotin)、2％瓊脂(agar))篩選高表達菌株。

挑取選擇性培養(yǎng)基上長出的單菌落接種于5mlbmgy(1％甘油，1％酵母提取物(yeastextract)，2％蛋白胨(peptone)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，100mm磷酸鉀ph6.0)培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)36h，5000rpm室溫離心5min收集菌體。菌體用2mlbmmy(0.5％甲醇，1％酵母提取物(yeastextract)，2％蛋白胨(peptone)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，100mm磷酸鉀ph6.0)培養(yǎng)基重懸，30℃、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)3d，期間每隔24h補加甲醇至0.5％，培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm離心5min收集上清液進行sds-page電泳篩選。

為比較不同拷貝轉(zhuǎn)化子的蛋白表達量，用相同菌密度的轉(zhuǎn)化子在同體積的bmmy培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，sds-page電泳比較pao815-α-zde-3、pao815-(α-zde-3)2、pao815-(α-zde-3)4、pao815-(α-zde-3)6轉(zhuǎn)化子上清液的蛋白量。結(jié)果如圖1所示(泳道1、2、3、4分別為1、2、4、6拷貝的轉(zhuǎn)化子上清液蛋白條帶)，表明重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下表達的蛋白質(zhì)的分子量約30kda，回收后經(jīng)ms-ms鑒定分子量為28.8kda，與理論蛋白分子量29.3kda大小相當(dāng)；通過比較蛋白條帶的亮度，發(fā)現(xiàn)4拷貝轉(zhuǎn)化子的玉米赤霉烯酮解毒酶表達量最高。

實施例4玉米赤霉烯酮解毒酶的活性檢測(液體中)

重組4拷貝畢赤酵母菌株(解毒酶)和野生型畢赤酵母菌株(對照組、空質(zhì)粒整合的畢赤酵母菌株)接入bmgy培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至菌液od600＝2-3，室溫離心收集菌體，重懸于bmmy培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)3d，期間每隔24h補加甲醇至0.5％，培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm離心5min收集上清液進行zen降解活性測定。

反應(yīng)體系1000μl：上清液40μl、0.5mg/mlzen40μl、0.05mtris-hcl(ph7.5)920μl，zen終濃度為20μg/ml。反應(yīng)體系混勻后37℃反應(yīng)30、60、120min加入等體積甲醇終止反應(yīng)，利用高效液相色譜(hplc)檢測zen殘留量，檢測方法參考gb/t23504-2009方法進行。hplc檢測條件：waters2695高效液相色譜儀，配備waters2475熒光檢測器，激發(fā)光exc＝360nm、發(fā)射光em＝440nm；agilenttc-c18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，柱溫30℃；流動相(水：甲醇：乙腈，4：1：1)，流速0.5ml/min，進樣量20μl。

通過hplc檢測得知，重組酵母上清液(酶液)處理zen60分鐘時，檢測不到zen的殘留，如圖2所示，而對照組控制質(zhì)粒的發(fā)酵上清液中zen基本上沒有降解?？梢员砻?，該優(yōu)化后的zde-3基因重組表達出的解毒酶具有高效、快速降解zen的活性。

對重組解毒酶活力進行定義：在上述條件下，每毫升發(fā)酵液每分鐘降解1μgzen為1個活力單位(u)。

本發(fā)明：40μl上清液在30min降解了13.8μg的zen，計算該上清液的酶活力為：11.5u。

專利zl201110082679.x：980μl上清液在2h降解了18.8μg的zen，該上清液的酶活力為：0.16u。

經(jīng)過對玉米赤霉烯酮解毒酶基因的密碼子進行優(yōu)化，并將該基因在重組酵母基因組中的拷貝數(shù)增加到4，大大提高了玉米赤霉烯酮解毒酶的表達量，最終使同體積重組酵母發(fā)酵上清液的zen解毒酶活性達到專利zl201110082679.x中降解酶酶活的72倍。

實施例5玉米赤霉烯酮解毒酶的最適ph

配制0.05m的tris-hcl緩沖液，ph分別設(shè)5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5共8個水平；反應(yīng)體系1000μl：40μl酶上清液+40μl0.5mg/mlzen+920μl設(shè)定的tris-hcl緩沖液；空白對照為40μl沸水浴5分鐘的上清液+40μl0.5mg/mlzen+920μl0.05mtris-hcl緩沖液。反應(yīng)體系混勻后37℃水浴30min，再加入等體積(1000μl)甲醇終止反應(yīng)。樣品過0.22μm微孔濾膜后用hplc檢測zen殘留量，計算zen的降解率。

如圖3所示，氨基酸改造后重組玉米赤霉烯酮解毒酶的最適ph由8.5降低到6.5，與豬、雞腸道ph非常相近，大大提高該重組玉米赤霉烯酮解毒酶作為飼料添加劑在實際應(yīng)用中的降解效率；而且在ph5.0-8.0范圍內(nèi)玉米赤霉烯酮解毒酶保持較高的降解活性，zen降解率均在40％以上，擴大了該解毒酶的ph適用范圍。

實施例6玉米赤霉烯酮解毒酶對玉米中zen的降解

收集污染zen的玉米碴，檢測zen含量為2450μg/kg。用緩沖液將酵母發(fā)酵上清液(酶液)分別稀釋2、5、10倍。按照發(fā)酵液與玉米碴(v：w)1:1的比例混合均勻(即酶液添加量分別為0.1、0.2、0.5ml/g)，37℃反應(yīng)0、3、6、12、24h，不加酶液作為對照。按照gb/t23504～2009提取玉米碴中的zen，利用hplc檢測zen的殘留量，計算玉米碴中zen的降解率。

如圖4所示，隨著降解時間的延長，樣品中zen含量逐漸降低，反應(yīng)前6h降解速率較快，6h以后降解速率趨于平緩。酶液添加量越高降解速率越快，降解率也越高，當(dāng)酶液的添加量為0.1ml/g玉米時，反應(yīng)6hzen的降解率僅為15.32％，反應(yīng)24h后，zen降解率為45.18％。而當(dāng)酶液添加量為0.5ml/g玉米時，處理6h玉米碴中zen含量由2450μg/kg降低到712.5μg/kg，降解率為70.9％；處理24h，玉米碴中zen含量降低到483.5μg/kg，降解率為80.3％?？梢员砻鳎亟M表達的玉米赤霉烯酮降解酶對玉米碴等谷物和飼料中zen具有較好的降解效果。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所

<120>一種耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其編碼基因與應(yīng)用

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