本發(fā)明涉及一種乳制品中玉米赤霉醇類及其它不得檢出違禁物的可視化單分子檢測技術

背景技術：

玉米赤霉醇及其類似物屬于雷索酸內酯類非甾體同化激素，具有促進畜禽增重的作用，曾以皮埋的方式用于禽畜養(yǎng)殖。然而，殘留在動物組織中的玉米赤霉醇由于具有雌性激素的生物活性，經食物進入人體后，輕則引起人體性激素機能紊亂，重則影響第二性征的正常發(fā)育，且在外因刺激下可能引發(fā)癌癥，嚴重危害人類健康，甚至危及嬰幼兒生命安全。歐盟已于1998年明令禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應用于畜禽養(yǎng)殖；2002年，我國農業(yè)部第193號公告也明確規(guī)定玉米赤霉醇禁用于所有食品動物，所有可食動物不得檢出；2010年衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質名單(第四批)》中再次將玉米赤霉醇列入非食用物質，在動物性食品中不得檢出。但在經濟利益的驅使下，部分違法者仍在畜禽養(yǎng)殖過程中使用玉米赤霉醇，導致玉米赤霉醇可能會殘留在各種食用組織及代謝物中。乳制品作為一種重要的動物源食品，同樣存在被殘留的玉米赤霉醇污染的風險，由于乳制品受眾的特殊性，其食用安全更是備受關注。

目前，乳制品中玉米赤霉醇類物質的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、酶聯免疫法(ELISA)等。國家標準GB/T 21982-2008《動物源食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》中的頒布方法也適用于乳制品基質。但在現有的檢測方法中，大多數方法都具有前處理復雜、耗時長、檢測成本高、儀器昂貴等缺點，在我國當前國情下由于受到人力、物力的雙重制約，許多部門難以普遍推廣高檔分析儀器法；同時其檢測靈敏度往往只能達到ppb級別，大都不能滿足不得檢出的終極目標。酶聯免疫法雖屬于相對較快的檢測方法，但檢測靈敏度較差，且易出現假陽性誤報情況，為后續(xù)工作帶來諸多不便。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高效、低成本的乳制品中玉米赤霉醇類的檢測方法。本發(fā)明結合發(fā)光氧通道免疫分析技術、超聲輻射場非特異性免疫結合消除技術及微流控技術的可視化檢測方法，可實現對乳制品中單分子濃度級別的玉米赤霉醇類物質的快速檢測。本發(fā)明的技術方案如下：

一種乳制品中玉米赤霉醇類的可視化單分子檢測方法，包括下列步驟：

1)分別配制3-6μg/mL質量濃度的經表面改性的聚苯乙烯供體微球溶液和經表面改性的聚苯乙烯受體微球溶液；分別配制物質的量濃度為1-3nM的玉米赤霉醇類抗原溶液和玉米赤霉醇類抗體溶液；將待檢測的乳制品制成懸浮液；

2)按照1:1-1:3的體積比取由步驟1)得到的經表面改性的聚苯乙烯供體微球溶液和玉米赤霉醇類抗體溶液并充分混合，得到混合溶液a；

3)按照1:1-1:3的體積比取由步驟1)得到的經表面改性的受體微球溶液和玉米赤霉醇類抗原溶液并充分混合，得到混合溶液b；

4)將由步驟2)和步驟3)得到的混合溶液a和混合溶液b于恒溫孵化器中避光反應；

5)按照體積比為1:1的配比將經過步驟4)后得到的混合溶液a和混合溶液b與乳制品懸浮液充分混合，得到混合溶液c；

6)將由步驟5)得到的混合溶液c于恒溫孵化器中避光反應；

7)選擇頻率不大于30kHz、功率不大于600W的聚焦超聲輻射場，對經步驟6)后得到的混合溶液c和進行非接觸式處理n，得到消除了非特異性結合的特異性夾心結合體溶液e；

8)通過微流控系統(tǒng)使由步驟7)得到的溶液e進入所選用的微流控芯片，并由其中的不小于500nm的小孔捕獲樣品中的特異性夾心結合體；

9)用波長不超過680nm的激光照射微流控芯片，用單光子檢測器記錄微流控芯片小孔位置發(fā)出的光信號，得到可視化圖像檢測結果；

10)根據檢測結果圖像中有無發(fā)光信號判斷樣品中是否含有玉米赤霉醇類。

本發(fā)明針對牛奶中玉米赤霉醇類物質的檢測，與現有技術相比具有以下優(yōu)點：

(1)檢測速度快：本方法基于發(fā)光氧通道均相免疫識別技術，可迅速標記目標分子并實現后續(xù)檢測，其單樣檢測周期控制在20分鐘以內。若借助96孔板或384孔板，則最高可以實現1152樣品/小時的檢測通量。與現有技術相比，檢測效率提升數千倍。

(2)假陽性概率極低：本方法采用低強度聚焦超聲輻射場對免疫標記體系進行非接觸式干預，通過精準控制超聲輻射場的強度，既能破壞體系中的非特異性吸附又不對特異性結合造成影響，最大限度地降低了檢測結果出現假陽性的概率。

(3)檢測靈敏度高：在破壞非特異性結合的基礎上，本方法通過微流控芯片對特異性夾心結合體進行單個捕捉，再經激發(fā)點亮過程，單個橋連結構的納米微球對即可產生10⁴～10⁵光子，進而可以方便地采用單光子檢測器或高靈敏CCD進行單分子級濃度的計數檢測，具備極限靈敏度。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的免疫發(fā)光單分子可視化檢測流程示意圖。

圖2是本發(fā)明提供的發(fā)光氧通道免疫分析原理示意圖。

圖3的A和B分別是實施例1中含α-玉米赤霉醇為1ppt的牛奶樣品和空白對照牛奶樣品的檢測結果對比圖是實施例1中含α-玉米赤霉醇為1ppt的牛奶樣品和空白對照牛奶樣品的檢測結果對比圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

圖1示出了本發(fā)明提供的免疫發(fā)光單分子可視化檢測流程示意圖。詳述如下：

(1)標記目標分析物：采用發(fā)光氧通道免疫分析技術，通過基于均相免疫原理的雙抗夾心特異性結合對目標分析物進行標記。當體系中存在目標分析物時，分別填充有光敏劑與化學發(fā)光劑的供體微球和受體微球因與目標分析物發(fā)生特異性結合而相互靠近，形成橋連結構的特異性夾心結合體，其橋連結構距離不超過200nm。當供體微球和受體微球通過橋連而距離小于200nm時，后續(xù)的激發(fā)發(fā)光過程才能正常進行。具體操作過程需取一定量的適合濃度的抗體和供體微球、抗原和受體微球分別混和后，在恒溫孵化器中經過一段時間的反應，再與一定量的待測樣品混合并再次于恒溫孵化器中反應一段時間，完成對目標分子的標記，促使供體微球及受體微球完成橋連結構的形成。

(2)消除非特異性結合干擾：在發(fā)光氧通道免疫分析中，非特異性結合影響其檢測靈敏度及假陽性率，本方法在精確測量特異性結合與非特異性吸附兩種結合方式作用力差別的基礎上，發(fā)現特異性結合作用力一般為150pN，而非特異性吸附作用力往往小于50pN，因此可以通過精確力學調控的方式消除非特異性結合的干擾，不僅顯著提升本方法的檢測靈敏度并有效降低檢測結果的假陽性率。本方法采用超聲波作為動力源，通過低強度聚焦超聲輻射場對免疫標記體系進行非接觸式干預，通過選擇合適的超聲輻射力的強度和作用時間，破壞體系中的非特異性吸附而不影響特異性結合，以有效避免非特異性吸附對最終檢測過程的干擾。

在實際操作過程中，為了獲取低強度聚焦超聲輻射場的最佳實施參數，對體系進行如下規(guī)范：設微粒為各向同性材料，其受力產生的形變各向均勻；所處環(huán)境為連續(xù)的、沒有粘性的理想介質；并且整個受力過程絕熱。超聲波場為平面駐波場，納米顆粒為剛性顆粒，則所受的聲輻射力F可通過公式(1)計算：

$F=-\frac{3}{2}{\mathrm{kV}}_{p}sin2kx\·G({\mathrm{\ρ}}_f/{\mathrm{\ρ}}_p)\·E---\left(1\right)$

其中k為滲透系數，x為微粒到聲場駐點的距離，V和ρ為體積和密度，下標f和p分別表示液體和微粒，G為顆粒和液體的聲對比因數，E為時均聲能密度，A為超聲波壓振幅。

(3)捕捉特異性夾心結合體：通過微流控系統(tǒng)，使經超聲輻射場作用后的免疫反應體系以連續(xù)流動狀態(tài)進入微流控芯片的微米級通道，并由上百萬個具有納米尺寸級小孔捕獲其中的特異性夾心結合體。

(4)點亮并記錄目標分析物：用特定波長的激光照射微流控芯片，供體微球上的光敏劑將被激發(fā)產生單體氧，單體氧擴散至特異性結合體另一端的受體微球上，并與受體微球上的化學發(fā)光劑發(fā)生反應，從而產生另一種波長的光信號，如圖2所示。用單光子檢測器用單光子檢測器記錄受體微球發(fā)出的光信號，利用顯微成像技術以圖像形式讀出目標分子，由此實現可視化單分子檢測。

實施例1

以牛奶中α-玉米赤霉醇(α-ZAA)的檢測為例，具體步驟如下：

1)配制質量濃度為3μg/mL的經表面改性的聚苯乙烯供體微球溶液和質量濃度為5μg/mL的經表面改性的聚苯乙烯受體微球溶液、物質的量濃度為2nM的α-ZAA抗原溶液和物質的量濃度為2nM的α-ZAA抗體溶液及含α-玉米赤霉醇為1ppt的牛奶樣品和空白對照牛奶樣品；

2)按照1:1的體積比取由步驟1)得到的供體微球溶液和α-ZAA抗體溶液各22μL并充分混合，得到混合溶液a；

3)按照1:1的體積比取由步驟1)得到的受體微球溶液和α-ZAA抗原溶液各22μL并充分混合，得到混合溶液b；

4)將由步驟2)和步驟3)得到的混合溶液a和混合溶液b于恒溫孵化器中避光反應10min；

5)取體積比為1:1的經步驟4)后得到的混合溶液a和混合溶液b各20μL及濃度為1ppt的待測牛奶樣品10μL，將三者充分混合，得到混合溶液c；

6)取體積比為1:1的經步驟4)后得到的混合溶液a和混合溶液b各20μL與10μL空白對照牛奶樣品充分混合，得到混合溶液d；

7)將由步驟5)步驟6)得到的混合溶液c和混合溶液d于恒溫孵化器中避光反應5min；

8)選擇頻率為30kHz、功率為600W的聚焦超聲輻射場，對經步驟7)后得到的混合溶液c和混合溶液d分別進行非接觸式處理，持續(xù)5min，得到消除了非特異性結合的特異性夾心結合體溶液e和空白對照溶液f；

9)通過微流控系統(tǒng)使由步驟8)得到的溶液e和空白對照溶液f分別進入所選用的微流控芯片，并由其中的孔徑約為500nm的小孔捕獲樣品中的特異性夾心結合體；

10)用波長為650nm的激光照射步驟9)中描述的微流控芯片，用單光子檢測器記錄微流控芯片小孔位置發(fā)出的光信號，得到可視化圖像檢測結果，如圖3所示。

11)根據檢測結果圖像中有無發(fā)光信號判斷樣品中是否含有α-玉米赤霉醇。