本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術領域，尤其涉及一種耐脂蛋白干擾的抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體及其應用。

背景技術：

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，as)是冠心病、腦卒中、外周血管病的主要原因。脂質代謝障礙及其伴發(fā)的血管炎癥為動脈粥樣硬化的病變基礎，其特點是受累動脈病變從內膜開始，一般先有脂質和復合糖類積聚、出血及血栓形成，進而纖維組織增生及鈣質沉著，并有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，導致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄。病變常累及大中肌性動脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動脈腔，則該動脈所供應的組織或器官將缺血或壞死。由于在動脈內膜積聚的脂質外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。

脂蛋白相關磷脂酶a2(lipoproteinassociatedphospholipasea2),是磷脂酶a2超家族中的一員，是由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸磷脂酶。最初發(fā)現其能夠降解血小板活化因子，因此又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(plateletactivatingfactoracetylhydrolase，paf-ah)。lp-pla2由血管內膜中的巨噬細胞、t細胞和肥大細胞分泌。動脈粥樣硬化斑塊中l(wèi)p-pla2表達上調，并且在易損斑塊纖維帽的巨噬細胞中有很高的表達^[1]。血液中90％以上的lp-pla2與氧化型低密度脂蛋白相結合，通過水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，生成脂類促炎物質，進而產生多種致動脈粥樣硬化作用，包括內皮細胞死亡和內皮功能異常，刺激粘附因子和細胞因子的產生。這些物質可通過趨化炎癥細胞進一步產生自我強化的循環(huán)，生成更多促炎物質^[2]。

國外大量研究均表明，隨著lp-pla2水平升高，患冠心病和腦卒中風險增加，尤其對于老年人和無癥狀的動脈粥樣硬化疾病人群^[3-6]。卓明峰等人^[7]對138例患者的研究表明，具有頸動脈斑塊組的lp-pla2濃度明顯高于頸動脈正常組及頸動脈內膜中膜增厚組(p<0.05)，說明lp-pla2能夠反映頸動脈粥樣硬化病變的嚴重程度，尤其是斑塊的有無及穩(wěn)定性。楊麗等^[8]針對299例擬診斷冠心病患者的研究表明，冠心病組血漿lp-pla2水平顯著高于對照組(p<0.01)，表面血液lp-pla2升高是冠心病的獨立危險因素之一，與冠脈病變的嚴重程度及動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性相關。

lp-pla2是一種對心腦血管疾病的預測及預后判斷十分有力的生化標志物，能夠為疾病的預防和早期干預提供新的思路和方向。目前國內無法生產能夠應用于臨床診斷的抗lp-pla2的單克隆抗體。lp-pla2在血液中絕大部分與脂蛋白相結合，基于重組抗原生產的lp-pla2單克隆抗體針對的抗原表位很可能被脂蛋白遮蓋，使得這些單克隆抗體無法準確識別血液中的天然lp-pla2蛋白，增加了診斷用單克隆抗體的開發(fā)難度。因此開發(fā)具有自主知識產權的耐脂蛋白干擾的抗lp-pla2單克隆抗體對于研發(fā)心腦血管疾病檢測試劑具有非常重要的意義。

參考文獻：

[1]je11ingerps,smithda,mehtaae,eta1.americanassociationofc1inica1endocrino1ogists'guide1inesformanagementofdys1ipidemiaandpreventionofatherosc1erosis[j].endocrpract,2012,18supp11:1-78.

[2]sudhirk.c1inica1review:lipoprotein-associatedphospho1ipasea2，anove1inf1ammatorybiomarkerandindependentriskpredictorforcardiovascu1ardisease[j].jc1inendocrino1metab,2005,90(5):3100-3105.

[3]packardcj，o'rei11yds，cas1akemj，eta1.lipoprotein-associatedphospho1ipasea2asanindependentpredictorofcoronaryheartdisease.westofscot1andcoronarypreventionstudygroup[j].nengjmed，2000，343(16):1148-1155.

[4]b1akegj,dadan,foxjc,eta1.aprospectiveeva1uationof1ipoprotein-associatedphospho1ipasea21eve1sandtheriskoffuturecardiovascu1areventsinwomen[j].jamco11cardio1,2001,38(5):1302-1306.

[5]oeihh，vandermeerim，hofmana，eta1.lipoprotein-associatedphospho1ipasea2activityisassociatedwithriskofcoronaryheartdiseaseandischemicstroke:therotterdamstudy[j].circu1ation,2005,111(5):570-575.

[6]cas1akemj,packardcj,robertsonm,eta1.lipoprotein-associatedphospho1ipasea2,inf1ammatorybiomarkers,andriskofcardiovascu1ardiseaseintheprospectivestudyofpravastatininthee1der1yatrisk(prosper)[j].atherosc1erosis,2010，210(1):28-34.

[7]卓明峰，徐尚華，張忠源.頸動脈粥樣硬化與脂蛋白相關磷脂酶a2的相關性[j].中國動脈硬化雜志,2009,17(9):774-776.

[8]楊麗，劉寅，劉婷，陳倩.普羅布考聯合阿托伐他汀對急性冠脈綜合征血脂蛋白相關脂酶a2的影響[j].天津醫(yī)藥,2011,39(8):704-707.

技術實現要素：

針對上述現有技術存在的不足，本發(fā)明提供一種耐脂蛋白干擾的抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體，還提供了分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞，及該單克隆抗體及其特異性抗原的應用。

本發(fā)明的目的之一在于提供一株分泌抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分類命名為雜交瘤細胞株lp1，于2016年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢大學，其保藏編號為cctccno：c2016204。

本發(fā)明目的之二在于提供由所述的雜交瘤細胞株lp1分泌的耐脂蛋白干擾的抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體lp1。

本發(fā)明所述的單克隆抗體lp1屬于igg1亞型。

本發(fā)明所述的單克隆抗體lp1結合位點位于lp-pla2蛋白的脂蛋白結合區(qū)域之外。

本發(fā)明所述的單克隆抗體lp1親和力為1×10^-6–1×10^-12m。

本發(fā)明目的之三在于提供一種組合物，包括本發(fā)明所述的抗體lp1，和藥學上的常用輔料。

本發(fā)明目的之四在于提供所述的單克隆抗體lp1在制備心血管疾病診斷或檢測試劑中的應用。

本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體lp1在制備心血管疾病早期診斷或輔助診斷試劑中的應用。

本發(fā)明目的之五在于提供包含所述的單克隆抗體lp1的lp-pla2早期檢測、心血管疾病診斷或檢測試劑盒。

所述的試劑盒是膠乳免疫比濁法的診斷試劑盒。

本發(fā)明目的之六在于提供所述的單克隆抗體lp1在制備治療心血管疾病的藥物或抗心腦血管疾病研究生物制劑中的應用。

本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體lp1的特異性抗原作為靶點在制備治療心血管疾病的藥物或抗心血管疾病研究生物制劑中的應用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供一株能穩(wěn)定分泌耐脂蛋白干擾的、高效價的抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株lp1，該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有良好的親和力和特異性，能夠避免血液中脂蛋白所帶來的干擾，可以作為lp-pla2檢測的關鍵原料，為建立快速、靈敏檢測lp-pla2的包括免疫金標、酶聯免疫試劑、免疫比濁法等臨床診斷試劑提供重要原料。

本發(fā)明所提供的一株能穩(wěn)定分泌耐脂蛋白干擾的、高效價的抗人lp-pla2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分類命名為雜交瘤細胞株lp1(亞類igg1)，已經于2016年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢大學，其保藏編號為cctccno：c2016204。

本發(fā)明提供的由所述的雜交瘤細胞株產生的抗人lp-pla2蛋白單克隆抗體，其亞類屬于igg1。它具有以下特性：(a)特異性地與lp-pla2蛋白結合，且結合位點位于lp-pla2蛋白的脂蛋白結合區(qū)域之外，與脂蛋白結合狀態(tài)和非脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白親和力相同，并且(b)所述單克隆抗體親和力為1×10^-6–1×10^-12m。它的制備方法包括以下步驟：

(a)用重組lp-pla2蛋白免疫小鼠；

(b)將免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，獲得雜交瘤細胞；

(c)從步驟(b)中的雜交瘤細胞中選出能夠分泌對重組lp-pla2蛋白效價為1:10⁶以上的單克隆抗體的雜交瘤細胞；

(d)從步驟(c)中的雜交瘤細胞中選出能夠分泌對脂蛋白結合狀態(tài)和非脂蛋白結合狀態(tài)lp-pla2蛋白具有相同親和力的單克隆抗體的雜交瘤細胞；

(e)從步驟(d)的雜交瘤細胞中制得單克隆抗體。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1.本發(fā)明最終獲得了能穩(wěn)定分泌耐脂蛋白干擾的抗人lp-pla2蛋白的雜交瘤細胞株lp1，該細胞株分泌的單克隆抗體對血清中的天然lp-pla2蛋白的效價高達1:10⁶，對重組lp-pla2蛋白的親和力達到1×10^-12m，該單克隆抗體具有良好的特異性，與血液中其它蛋白沒有交叉反應，且對脂蛋白結合狀態(tài)和非脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白具有相同的親和力。

2.該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有良好的特異性及溫度穩(wěn)定性，37℃保存長達8天效價不下降，可以作為lp-pla2檢測的關鍵原料。

3.采用純化的該lp-pla2單克隆抗體作為原料制備的檢測lp-pla2抗原含量的膠乳增強免疫比濁試劑盒能夠耐受血液中脂蛋白的干擾，進而對病人是否發(fā)生動脈粥樣硬化進行準確診斷。該單克隆抗體的開發(fā)對我國心血管疾病早期篩查試劑的開發(fā)具有重要意義。

附圖說明

圖1：為本發(fā)明lp-pla2蛋白純化后鑒定結果圖，lanem：蛋白質相對分子質量標準品；lane1：離心上清；lane2：陽離子交換柱純化后的蛋白；lane3：分子篩層析純化后的蛋白；

圖2：為本發(fā)明單克隆抗體lp1十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結果圖，lanem：蛋白質相對分子質量標準；lane1：純化前腹水(還原劑處理的樣品)；lane2：純化后單克隆抗體(還原劑處理的樣品)；lane3：純化前腹水(未加還原劑)；lane4：純化后單克隆抗體(未加還原劑)；

圖3：為本發(fā)明單克隆抗體lp1免疫特異性鑒定結果圖，lanem：蛋白質相對分子質量標準；lane1：重組lp-pla2蛋白；lane2：人血清；

圖4：為本發(fā)明抗lp-pla2單克隆抗體lp1的穩(wěn)定性檢測結果圖；

圖5：為本發(fā)明lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的校準曲線圖。附圖中各部件的標記如下：a圖是實施例7中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的校準曲線圖；b圖是實施例8中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的校準曲線圖；

圖6：為本發(fā)明lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的臨床樣本檢測圖。附件中各部件的標記如下：a圖是實施例7中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的臨床樣本檢測圖；b圖是實施例8中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的臨床樣本檢測圖；

圖7：為本發(fā)明lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒抗干擾實驗。附圖中各部件的標記如下：a圖是實施例7中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的抗脂蛋白干擾實驗；b圖是實施例8中制備的lp-pla2膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的抗脂蛋白干擾實驗。

具體實施方式

下面結合附圖通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定，但并不是對本發(fā)明的限制，僅作示例說明。下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照常規(guī)條件，如sambrook等人，分子克隆實驗指南(coldspringharborlaboratorypress,2001)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件執(zhí)行。

實施例1重組lp-pla2蛋白的表達純化和純度鑒定

將含有l(wèi)p-pla2基因序列的原核表達質粒轉化大腸桿菌bl21(de3)，用lb平板培養(yǎng)。從平板上挑取單菌落接種lb培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)后，在菌液od600值達到0.6-0.8時加入終濃度為0.2mm的iptg進行誘導表達。16小時后離心收集菌體，超聲破碎細菌后離心收集上清。上清用陽離子交換柱和分子篩層析柱純化，收集樣品并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定蛋白純度。

經陽離子交換柱和分子篩層析柱純化重組lp-pla2蛋白后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，從凝膠上觀察到50kda左右的目的蛋白條帶(圖1)，即為重組lp-pla2蛋白，純度為90％左右，達到了制備單抗的純度要求。

實施例2動物免疫與血清效價檢測

將濃度為1mg/ml的純化的重組lp-pla2蛋白與等量的弗氏完全佐劑用雙注射器互推法混合乳化，用乳化好的抗原免疫6-8周無特定病原體級雌性balb/c小鼠，每只小鼠從跗關節(jié)處注射40μg抗原。2天后，將濃度為1mg/ml的純化的重組lp-pla2蛋白與等量的弗氏不完全佐劑用雙注射器互推法混合乳化，對每只小鼠再次從跗關節(jié)處注射40μg乳化的抗原。8天后，尾靜脈采血，離心取上清，用間接elisa法檢測血清效價。2次免疫后，百萬倍稀釋后血清效價已高達2.0以上(表1)。選取血清效價大于10⁶的小鼠，頸椎脫臼處死后取淋巴細胞進行細胞融合。

表1間接elisa檢測小鼠血清中抗體效價

實施例3細胞融合、陽性雜交瘤細胞篩選與亞克隆

1.高效價雜交瘤細胞株的制備及篩選

以peg1500作為融合劑，融合sp2/0骨髓瘤細胞和免疫小鼠的淋巴細胞，兩種細胞比例為1:2-1:3。融合細胞置于含20％fbs血清的hat-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。一周后觀察融合狀態(tài)并換液，換液3天后取細胞培養(yǎng)上清。用臨床確診發(fā)生動脈粥樣硬化病人的血清包被elisa板，該血清中含有高濃度的天然lp-pla2蛋白，用間接elisa方法篩選陽性克隆，選擇陽性值與細胞數比值較高的細胞進行多次亞克隆，最終得到多株能夠穩(wěn)定分泌抗lp-pla2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞庫。該雜交瘤細胞庫分泌的單克隆抗體與血液中天然lp-pla2蛋白有很高的親和力。

2.耐脂蛋白干擾的雜交瘤細胞株的篩選

將濃度為1mg/ml純化的重組lp-pla2蛋白與濃度為5mg/ml的氧化型低密度脂蛋白(購自sigma)混勻孵育，制備脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白。之后分別用純化的重組lp-pla2蛋白和上述脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白分別包被elisa板。用含20％fbs血清的hat-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)上述雜交瘤細胞庫中的細胞，3天后取細胞培養(yǎng)液，用間接elisa方法分別測定細胞培養(yǎng)液中的單克隆抗體與純化的重組lp-pla2蛋白和脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白的相對親和力。選取與純化的重組lp-pla2蛋白和脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白親和力相同，且親和力最高的單克隆細胞，最終得到一株能夠分泌耐脂蛋白干擾的抗lp-pla2單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為lp1。

實施例4單克隆抗體的產生與純化

在成年balb/c小鼠腹腔注射0.5ml無菌石蠟油，一周后再向腹腔內注入0.5ml的lp1雜交瘤細胞，細胞密度為1×10⁶-2×10⁶/ml。兩周后開始采集腹水。在腹水中緩慢加入等體積飽和硫酸銨，冰上攪拌30分鐘后在4℃下12000g離心10分鐘，沉淀用少量pbs溶解后用20倍體積的bindingbuffer(proteinasefinosekit中提供)透析，用proteina親和柱純化抗體后用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化效果。

經電泳分析，純化后的抗體在還原的膠上呈現分子量為50kda和25kda的重鏈和輕鏈，而在非還原膠上呈現分子量約為150kda的單一條帶(圖2)。這說明經親和柱層析后單克隆抗體達到了相當高的純度，可以用于進一步的研究。

實施例5單克隆抗體亞型、特異性及效價鑒定

1.單克隆抗體亞型鑒定

采用sinobiological公司的mousemonoclonalantibodyisotypingreagents鑒定單克隆抗體亞型，操作按說明書進行。經鑒定，制備的單克隆抗體為igg1亞型。

2.單克隆抗體特異性鑒定

用臨床確診發(fā)生動脈粥樣硬化病人的血清和純化的重組lp-pla2蛋白分別進行westernblotting實驗鑒定lp1單克隆抗體的特異性。結果顯示于病人血清中天然lp-pla2蛋白及重組表達lp-pla2蛋白處均可見抗lp-pla2單克隆抗體lp1的特異結合條帶，且在其它位置沒有明顯雜帶(圖3)，說明lp1單克隆抗體能夠特異性識別血液中的lp-pla2蛋白，與血液中的其他抗原沒有非特異反應，適合用來檢測病人血液中l(wèi)p-pla2蛋白的含量，具有良好的特異性。

3.單克隆抗體效價鑒定

用表面等離子體共振法(spr)在biacore3000儀器上測定lp1單克隆抗體的親和力。用10μg/ml的純化的重組lp-pla2抗原包被cm5芯片，偶聯方式為edc/nhs化學偶聯抗原表面的伯氨基和芯片表面的羧基。加入梯度稀釋的抗lp-pla2單克隆抗體lp1，測定lp1單克隆抗體與重組lp-pla2蛋白的結合常數和解離常數。經過儀器附帶的軟件計算，lp1單克隆抗體的親和力達到1pm，即1×10^-12m。結果表明，lp1單克隆抗體具有極高的親和力，能夠作為高靈敏度lp-pla2檢測試劑盒的原料。

實施例6單抗穩(wěn)定性的鑒定

將純化后的抗lp-pla2單克隆抗體lp1分別置于-20℃、4℃和37℃環(huán)境中，濃度為1mg/ml，每24小時取樣一次，間接elisa檢測其免疫反應活性的變化。結果顯示在-20℃、4℃和37℃孵育24小時后，效價無差別，超過8天后37℃組抗體的效價才開始下降(圖4)，說明lp1單克隆抗體具有良好的溫度穩(wěn)定性。

實施例7lp-pla2含量檢測試劑盒的制備(膠乳增強免疫比濁法)

本試劑盒包含雙試劑，試劑1為膠乳反應緩沖液，試劑2為包被上述抗lp-pla2單克隆抗體的膠乳顆粒。

制備試劑1時，稱取60.57mg的tris，58.44mg的nacl，50mg的peg6000，3.9mg的nan3溶于8ml的蒸餾水中，調節(jié)ph至8.0，定容至10ml。攪拌混勻，經過0.22μm濾膜抽濾后，即得試劑1。

制備試劑2時，取0.1ml濃度為10％粒徑為220nm的聚苯乙烯膠乳于10ml離心管中，再向離心管中加入8.9ml0.1mmes緩沖溶液(ph5.0)，混合均勻，得到稀釋膠乳溶液。準確稱取0.34mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺用1ml0.1mhepes緩沖溶液(ph7.5)溶解，并將此溶液加入稀釋膠乳溶液中，震蕩混合均勻，并置于25℃恒溫搖床上，200轉/分鐘反應30分鐘；之后將上述反應溶液分成等量的兩份，分別加入0.5ml1mg/ml抗lp-pla2單克隆抗體lp1和另一株抗lp-pla2單克隆抗體lp3(來自南京諾唯贊生物科技有限公司)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉/分鐘反應2小時。反應完成后，向兩反應體系中分別加入1ml5％濃度的bsa溶液，混合均勻，并置于37℃恒溫搖床上，200轉/分鐘，反應1小時。將上述體系于16000g，離心30分鐘，棄上清，將沉淀分別用5ml含50mmtris，ph6.5，50mmnacl，1‰nan3的緩沖液重懸，將兩種膠乳等體積混合后超聲分散膠乳，即得試劑2。

實施例8lp-pla2含量檢測試劑盒的制備(膠乳增強免疫比濁法)

本試劑盒包含雙試劑，試劑1為膠乳反應緩沖液，試劑2為包被上述抗lp-pla2單克隆抗體的膠乳顆粒。

制備試劑1時，稱取60.57mg的tris，58.44mg的nacl，50mg的peg6000，3.9mg的nan3溶于8ml的蒸餾水中，調節(jié)ph至8.0，定容至10ml。攪拌混勻，經過0.22μm濾膜抽濾后，即得試劑1。

制備試劑2時，取0.1ml濃度為10％粒徑為220nm的聚苯乙烯膠乳(購自日本合成橡膠公司)于10ml離心管中，再向離心管中加入9.9ml50mmhepes緩沖溶液(ph7.5)，混合均勻，得到稀釋膠乳溶液。之后將上述反應溶液分成等量的兩份，分別加入0.5ml1mg/ml抗lp-pla2單克隆抗體lp1和另一株抗lp-pla2單克隆抗體lp3(來自南京諾唯贊生物科技有限公司)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉/分鐘反應2小時。反應完成后，向兩反應體系中分別加入1ml5％濃度的bsa溶液，混合均勻，并置于37℃恒溫搖床上，200轉/分鐘，反應1小時。將上述體系于16000g，離心30分鐘，棄上清，將沉淀分別用5ml含50mmtris，ph6.5，50mmnacl，1‰nan3的緩沖液重懸，將兩種膠乳等體積混合后超聲分散膠乳，即得試劑2。

實施例9lp-pla2含量檢測試劑盒臨床實驗

1.標準曲線的建立。稱取60.57mg的tris、87.66mg的nacl、186.12mg的edta·na2和100mg的bsa，溶于溶于8ml的蒸餾水中，調節(jié)ph值至7.5，定容至10ml，攪拌使其完全混勻，并經過0.22μm濾膜抽濾，得到標準品稀釋液。用上述標準品稀釋液溶解純化的重組lp-pla2蛋白，制備不同濃度的標準品(0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)。用上述制備的兩種lp-pla2含量檢測試劑盒測定不同濃度標準品中l(wèi)p-pla2的含量。該方法為兩點終點法，采用日立7170生化分析儀測定，包括以下步驟：向10μl待檢測樣本(校準管以校準品做樣品，空白以蒸餾水為樣品)中加入200μl的試劑1充分混勻，于37℃孵育5分鐘，再向混合體系中加入50μl試劑2，混勻，37℃恒溫1分鐘后，空白管調零，波長546nm，測定各管吸光度a1，4分鐘后測定各管吸光度a2。計算δa＝a2-a1。根據多點校準品濃度和對應吸光度變化值δa，采用多點非線性校準模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在工作曲線上相對應的濃度值即為測定濃度。

采用實施例7和8中制備的試劑盒及測量方法，采用日立7170生化分析儀測得的上述6種不同含量的lp-pla2標準品的曲線(圖5)，每個點代表一個含量的參考標準品，其中x軸表示lp-pla2含量(ng/ml)；y軸表示吸光度。

2.lp-pla2含量檢測試劑盒的臨床實驗

分別選取50例健康人血清和20例臨床確診已發(fā)生動脈粥樣硬化病人的血清，按照上述條件，用實施例7和8中制備的lp-pla2含量檢測試劑盒分別測定各血清中l(wèi)p-pla2蛋白的含量。結果表明實施例7和8中制備的lp-pla2含量檢測試劑盒能夠明顯區(qū)分出正常組和病理組樣本(圖6),說明基于lp1單克隆抗體制備的lp-pla2含量檢測試劑盒能夠對動脈粥樣硬化進行準確診斷，能夠滿足臨床檢測的需求。

實施例10lp-pla2含量檢測試劑盒干擾性實驗

將濃度為1mg/ml純化的重組lp-pla2蛋白與濃度為5mg/ml的氧化型低密度脂蛋白(購自sigma)混勻孵育，制備脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白。用不含lp-pla2的血清作為稀釋液，分別配制濃度為10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的重組lp-pla2蛋白和脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白。按照實施例9中的實驗條件，用實施例7和8中制備的lp-pla2含量檢測試劑盒分別測定各稀釋樣品的濃度。

結果表明實施例7和8中制備的lp-pla2含量檢測試劑盒測定純化的重組lp-pla2蛋白和脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白濃度的線性相關系數和回歸直線斜率均達到了0.99以上(圖7)，說明用lp1單克隆抗體制備的lp-pla2檢測試劑盒測定脂蛋白結合狀態(tài)和非脂蛋白結合狀態(tài)的lp-pla2蛋白時沒有差異，試劑盒能夠耐受脂蛋白結合對lp-pla2含量測定的干擾。