本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種提高t細(xì)胞活性的方法。

背景技術(shù)：

t淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞(胚胎期則來(lái)源于卵黃囊和肝)。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前t細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的t細(xì)胞。根據(jù)是否表達(dá)cd4或cd8分子,t細(xì)胞可分為cd4t細(xì)胞和cd8t細(xì)胞。

t細(xì)胞活化是屬于細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫t細(xì)胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏t細(xì)胞(也叫效應(yīng)t細(xì)胞)，當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體的細(xì)胞中時(shí)，致敏t細(xì)胞(效應(yīng)t細(xì)胞)對(duì)抗原的直接殺傷作用及致敏t細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞免疫。t細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞。

免疫治療一直以來(lái)是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。cd8t細(xì)胞是腫瘤免疫治療的核心，是腫瘤的特異性殺傷細(xì)胞，其殺傷能力強(qiáng)弱以及在腫瘤組織中的浸潤(rùn)情況直接與腫瘤的預(yù)后直接相關(guān)，而且直接關(guān)系腫瘤免疫治療的成敗。由于腫瘤微環(huán)境是一個(gè)免疫抑制的環(huán)境，cd8t細(xì)胞的功能受到腫瘤微環(huán)境的抑制，目前免疫檢測(cè)點(diǎn)阻斷抗體抗pd-1，抗pd-l1和抗ctla-4抗體在治療黑色素瘤的臨床試驗(yàn)中雖然整體效果不錯(cuò)，但單獨(dú)使用時(shí)各自的客觀反應(yīng)率(objectiveresponserate)以及抗pd-1和抗ctla-4抗體聯(lián)合治療客觀反應(yīng)率還是不盡如人意。這意味著急需新的手段來(lái)提高t細(xì)胞尤其是cd8t細(xì)胞的活性。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝通路包括膽固醇合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及儲(chǔ)存等途徑，其中膽固醇合成通路主要由scap/srebp復(fù)合物以及其下游膽固醇合成限速酶hmgcr調(diào)控；膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的調(diào)控主要受低密度脂蛋白受體(ldlreceptor)、內(nèi)體(endosome)和溶酶體(lysosome)中npc1/2等蛋白及復(fù)合物的調(diào)控；而膽固醇存儲(chǔ)則受膽固醇的酯化修飾以及去酯化修飾的調(diào)控，關(guān)鍵調(diào)控蛋白包括?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1/2和膽固醇酯水解酶(ceh)?，F(xiàn)有技術(shù)并沒(méi)有披露細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平與腫瘤的免疫治療相關(guān)t細(xì)胞活化之間的關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明一方面提供了一種提高t細(xì)胞活性的方法，為提高t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平從而提高t細(xì)胞活性。

提高t細(xì)胞活性包括但不限于：提高t細(xì)胞的效應(yīng)功能。進(jìn)一步的，所述提高t細(xì)胞活性包括提高cd8t細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述t細(xì)胞為cd8t細(xì)胞，通過(guò)上調(diào)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平，提高了cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能，進(jìn)而提高了cd8t細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。該方法亦可被認(rèn)為是一種提高cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能的方法或者提高cd8t細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷能力的方法。

具體的，所述提高t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平可以采用各種化學(xué)、物理、生物的方法。包括但不限于：

1)調(diào)節(jié)膽固醇代謝通路以提高t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平

2)于t細(xì)胞上直接增加質(zhì)膜上膽固醇的量。

可將膽固醇結(jié)合或依附于t細(xì)胞表面以于t細(xì)胞上直接增加質(zhì)膜上膽固醇的量。

調(diào)節(jié)膽固醇代謝通路可以是：促進(jìn)膽固醇的合成、促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制膽固醇的儲(chǔ)存、抑制膽固醇的外排等。根據(jù)現(xiàn)有理論可知，促進(jìn)膽固醇的合成、促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制膽固醇的儲(chǔ)存及抑制膽固醇的外排都將會(huì)上調(diào)膽固醇水平。

具體的，可以在膽固醇合成促進(jìn)劑、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑、膽固醇儲(chǔ)存促進(jìn)劑、膽固醇降解抑制劑、膽固醇轉(zhuǎn)化抑制劑或膽固醇外排抑制劑中的一種或多種存在下培養(yǎng)t細(xì)胞，以分別促進(jìn)膽固醇的合成、促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)膽固醇的儲(chǔ)存、抑制膽固醇的降解、抑制膽固醇的轉(zhuǎn)化、抑制膽固醇的外排，從而上調(diào)t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平。

可以利用對(duì)膽固醇代謝相關(guān)基因或其表達(dá)多肽、蛋白或酶的激活或抑制來(lái)調(diào)節(jié)膽固醇代謝通路。一般情況下，對(duì)于上調(diào)膽固醇的合成和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)基因采用激活的方式，而對(duì)于上調(diào)膽固醇的儲(chǔ)存和外排的基因則采用抑制的方法。激活方法可以是上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)量，例如構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并作用于t細(xì)胞,或者是通過(guò)小分子化合物上調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和/或抑制相關(guān)蛋白的降解。抑制的方法可采用基因敲除，基因敲低使相關(guān)基因失活或活性降低；或者也可利用抗體、蛋白、小分子等與基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合使相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生的多肽、蛋白或酶失活或活性降低。

作為典型的代表，例如可以通過(guò)抑制膽固醇酯化來(lái)抑制膽固醇的儲(chǔ)存，通過(guò)抑制膽固醇酯化相關(guān)的酶如?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1或敲除?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因可明顯促進(jìn)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能，增強(qiáng)其腫瘤細(xì)胞殺傷。

具體的，還可以在膽固醇存在下培養(yǎng)t細(xì)胞，從而使膽固醇結(jié)合或依附于t細(xì)胞表面以增加質(zhì)膜上膽固醇的量。

本發(fā)明實(shí)施例已證實(shí)直接增加質(zhì)膜膽固醇水平將提高cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。而基于現(xiàn)有技術(shù)可知，前述調(diào)節(jié)膽固醇代謝通路的方法均可上調(diào)膽固醇水平，由此可推知，前述調(diào)節(jié)膽固醇代謝通路的方法亦可獲得提高cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能的效果，進(jìn)而認(rèn)為這些方法亦可以提高t細(xì)胞活性。

將膽固醇結(jié)合或依附于t細(xì)胞表面以增加質(zhì)膜上膽固醇的量可以是物理的或者是化學(xué)的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，將環(huán)糊精(mβcd)包被的膽固醇處理cd8t細(xì)胞從而直接上調(diào)質(zhì)膜上膽固醇的量。

所述的提高t細(xì)胞活性的方法可以是體內(nèi)的或體外的。

采用本發(fā)明的方法體外處理后活性提高的t細(xì)胞可被用于治療的或非治療的目的。

本發(fā)明第二方面還提供了質(zhì)膜膽固醇水平促進(jìn)劑在制備t細(xì)胞活性促進(jìn)劑中的用途。

所述質(zhì)膜膽固醇水平促進(jìn)劑包括但不限于：膽固醇合成促進(jìn)劑、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑、膽固醇儲(chǔ)存促進(jìn)劑、膽固醇降解抑制劑、膽固醇轉(zhuǎn)化抑制劑、膽固醇外排抑制劑。

所述的質(zhì)膜膽固醇水平促進(jìn)劑可為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

所述膽固醇合成促進(jìn)劑可促進(jìn)膽固醇的合成從而增加質(zhì)膜膽固醇水平，可以是現(xiàn)有的可促進(jìn)膽固醇合成的化合物。

所述膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑可促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)從而增加質(zhì)膜膽固醇水平，可以是現(xiàn)有的可促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物。

所述膽固醇降解抑制劑可抑制膽固醇的降解從而增加質(zhì)膜膽固醇水平，可以是現(xiàn)有的可抑制膽固醇降解的化合物。

所述膽固醇轉(zhuǎn)化抑制劑可抑制膽固醇的轉(zhuǎn)化從而增加質(zhì)膜膽固醇水平，可以是現(xiàn)有的可抑制膽固醇轉(zhuǎn)化的化合物。如：?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑等。

所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的抑制劑是指對(duì)于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果的化合物。

對(duì)于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性，或者抑制?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

膽固醇外排抑制劑可抑制膽固醇的外排從而增加質(zhì)膜膽固醇水平，可以是現(xiàn)有的可抑制膽固醇外排的化合物。

作為實(shí)施例具體列舉的，所述質(zhì)膜膽固醇水平促進(jìn)劑為?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，如avasimibe、k604、cp113,818等。

所述t細(xì)胞活性促進(jìn)劑能提高t細(xì)胞的效應(yīng)功能和/或提高t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。 在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述t細(xì)胞活性促進(jìn)劑能提高cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供了一種全新的提高t細(xì)胞尤其是cd8t細(xì)胞活性的方法，為腫瘤免疫治療提供了新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1.cd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平直接影響cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能和ctl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。

a.mβcd處理(終濃度0.2–1mm,稀釋于pbs中，37℃處理5分鐘，pbs洗3次，最后換rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng))降低acat1^ckocd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平，隨后通過(guò)鋪板抗體α-cd3(5μg/ml)+α-cd28(5μg/ml)刺激24小時(shí)，然后胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)；

b.mβcd處理(終濃度1mm,37℃處理5分鐘，方法同a)降低acat1^ckoot-ictl細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平,通過(guò)檢測(cè)ldh的釋放分析ot-ictl對(duì)靶細(xì)胞el-4的殺傷效率；

c.mβcd包被的游離膽固醇處理(終濃度1-10μg/ml,稀釋于rpmi1640完全培養(yǎng)基中，37℃處理15分鐘，pbs洗3次，最后換rpmi1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))上調(diào)野生型cd8t細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇水平，隨后通過(guò)鋪板抗體α-cd3(5μg/ml)+α-cd28(5μg/ml)刺激24小時(shí)，然后胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)；

d.mβcd包被的游離膽固醇處理(終濃度1-10μg/ml,37℃處理15分鐘，方法同c)升高野生型ot-ictl細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇水平,通過(guò)檢測(cè)ldh的釋放分析ot-ictl對(duì)靶細(xì)胞el-4的殺傷效率。

t-檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)分析。

圖2.抑制膽固醇代謝相關(guān)通路影響cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。

a-d.分別抑制膽固醇合成(lovastatin：hmgcr抑制劑)、膽固醇運(yùn)輸(u18666a)和膽固醇酯?；揎?cp113，818和k604)后，通過(guò)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd8t細(xì)胞活化(α-cd3(5μg/ml)和α-cd28(5μg/ml)鋪板刺激)后顆粒酶b(gzmb)，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)。

圖3.acat1基因敲除后，cd8t細(xì)胞膽固醇代謝途徑重編程，細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平上調(diào)。

a-b.α-cd3(5μg/ml)和α-cd28(5μg/ml)鋪板刺激活化cd8t細(xì)胞12小時(shí)后，filipiniii染色檢測(cè)活化前后野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞游離膽固醇的分布；細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇的相對(duì)定量結(jié)果通過(guò)leicalasaf軟件處理獲??；

c-d.基于膽固醇氧化的膽固醇定量方法用于定量野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞活化前后的總游離膽固醇、細(xì)胞質(zhì)膜游離膽固醇水平；

e-p.α-cd3(5μg/ml)和α-cd28(5μg/ml)鋪板刺激活化野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量pcr用于檢測(cè)膽固醇代謝相關(guān)基因的mrna水平。

圖4.avasimibe處理上調(diào)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇水平，促進(jìn)tcr微簇和免疫突觸形成，增強(qiáng)tcr信號(hào)通路的活化。

a-b.avasimibe處理cd8t細(xì)胞(37℃，6小時(shí))，filipiniii染色檢測(cè)cd8t細(xì)胞游離膽固醇的分布；細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇的相對(duì)定量結(jié)果通過(guò)leicalasaf軟件處理獲取；

c.avasimibe處理cd8t細(xì)胞后，通過(guò)storm對(duì)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜表面tcr的分布進(jìn)行分析；

d-e.對(duì)圖c獲得的成像信息進(jìn)行ripley’kfunction分析，r代表tcr微簇的大小，l(r)-r代表tcr微簇形成的程度；

f-g.avasimibe處理cd8t細(xì)胞后，通過(guò)tirfm檢測(cè)cd8t細(xì)胞免疫突觸的形成；

h.avasimibe處理ot-ictl細(xì)胞后,用2μg/mlα-cd3和2μg/mlα-cd28激活ctl，然后western-blotting檢測(cè)tcr近端信號(hào)通路和下游信號(hào)通路的活化情況；

i-k.storm對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞質(zhì)膜上tcr進(jìn)行成像以及ripley’kfunction分析。

圖5.acat1敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞增殖以及減少cd8t細(xì)胞凋亡。

a.活細(xì)胞熒光染料cfse標(biāo)記野生型(wt)和acat1基因敲除(cko)cd8t細(xì)胞，然后鋪板抗體刺激細(xì)胞(1-2μg/mlα-cd3+1-2μg/mlα-cd28)，通過(guò)流式檢測(cè)cfse熒光強(qiáng)度檢測(cè)細(xì)胞的分裂情況；

b.小鼠脾臟分離得到的cd8t細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，annexinv和pi(propidiumidiode)染色，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

c.鋪板抗體(5μg/mlα-cd3+5μg/mlα-cd28)刺激野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞24小時(shí)，然后annexinv和pi(propidiumidiode)染色，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

圖6.acat1敲除增強(qiáng)cd8t細(xì)胞抗腫瘤活性。

a-b.野生型小鼠和acat1^cko小鼠中黑色素瘤生長(zhǎng)速度以及小鼠的生存曲線(xiàn)分析。腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)用two-wayanova統(tǒng)計(jì)方法分析，小鼠的生存曲線(xiàn)用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法分析；

c-d.野生型和acat1^cko小鼠在注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞后，在第16天將腫瘤取出，通過(guò)流式分析cd8t細(xì)胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達(dá)，同時(shí)對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的cd8t 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)流式檢測(cè)cd8/cd4t細(xì)胞比率以及cd8t細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67的表達(dá)；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

e.流式檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞表面免疫檢測(cè)點(diǎn)受體pd-1和ctla-4的表達(dá)；

mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

f.胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)的treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

g-h.流式檢測(cè)引流淋巴結(jié)中cd8t細(xì)胞中cd44、ifnγ的表達(dá)，同時(shí)對(duì)cd8t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)流式檢測(cè)cd8/cd4t細(xì)胞比比率；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

i-k.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，在注射黑色素瘤細(xì)胞后第20天，檢測(cè)肺臟中腫瘤數(shù)量，同時(shí)繼續(xù)記錄剩余小鼠的生存率和生存時(shí)間，小鼠的生存曲線(xiàn)用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法分析；

l.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，蘇木精-伊紅染色觀察腫瘤細(xì)胞在肺臟中的浸潤(rùn)情況；

m.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，流式檢測(cè)肺臟中cd8t細(xì)胞cd44、顆粒酶b(gzmb)、ifnγ和tnfα的表達(dá)；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

n-p.將體外誘導(dǎo)分化成熟的野生型和acat1^ckoot-ictl尾靜脈注射到荷瘤b16f10-ova(b16f10黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)ovalbumin)的c57bl/6野生型小鼠中，檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)以及小鼠的生存率。

圖7.acat1敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞tcr微簇形成并增強(qiáng)tcr信號(hào)通路活化。

a.野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞用4μg/mlα-cd3+4μg/mlα-cd28刺激，然后westernblot檢測(cè)tcr近端信號(hào)通路和下游信號(hào)通路的活化情況；

b.流式檢測(cè)野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞表面tcr(cd3)和cd8水平；

c.storm對(duì)野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞活化前后膜表面tcr的分布進(jìn)行成像；

d-e.對(duì)圖c獲得的成像結(jié)果進(jìn)行ripley’skfunction分析，r代表tcr微簇的大小，l(r)-r代表tcr微簇形成的程度。

圖8.acat1敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞免疫突觸的形成。

a-b.tirfm對(duì)cd8t細(xì)胞的tcr進(jìn)行活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像，檢測(cè)野生型和acat1^ckocd8t細(xì)胞免疫突觸的形成；two-wayanova方法用于分析組間差異顯著性。

c-e.對(duì)免疫突觸中tcr微簇的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行分析；追蹤了來(lái)自19個(gè)野生型cd8t細(xì)胞和20個(gè)acat1^ckocd8t細(xì)胞中超過(guò)1400個(gè)tcr微簇的運(yùn)動(dòng)，分析其平均平方位移msd(meansquaredisplacement),擴(kuò)散系數(shù)的累計(jì)概率分布cpd(cumulativeprobability distribution)和擴(kuò)散系數(shù)diffusioncoefficient。

圖9.acat抑制劑avasimibe處理增強(qiáng)cd8t細(xì)胞抗腫瘤能力。

a.野生型cd8t細(xì)胞用avasimibe處理(37℃，6小時(shí)，即于rpmi1640完全培養(yǎng)基中加藥后，37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理6小時(shí)，處理完之后用培養(yǎng)基或pbs離心清洗3次)，隨后通過(guò)鋪板抗體α-cd3(5μg/ml)+α-cd28(5μg/ml)刺激24小時(shí)，然后胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)；

b.avasimibe處理ot-ictl(37℃，6小時(shí))處理方式同a,通過(guò)檢測(cè)ldh的釋放分析ot-ictl對(duì)靶細(xì)胞el-4的殺傷效率；

c.mts方法檢測(cè)avasimibe處理對(duì)黑色素瘤細(xì)胞b16f10細(xì)胞活率的影響；one-wayanova用于統(tǒng)計(jì)分析，p>0.25。

d-f.avasimibe處理b16f10黑色素瘤荷瘤c57bl/6野生型小鼠，檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)和小鼠生存率；

g-h.在注射腫瘤后第18天將腫瘤取出，通過(guò)流式分析腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達(dá)，同時(shí)對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)流式檢測(cè)cd8/cd4t細(xì)胞比比率以及cd8t細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67的表達(dá)；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

i.流式檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞表面免疫檢測(cè)點(diǎn)受體pd-1和ctla-4的表達(dá)；

mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

j.胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)的treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

k.流式檢測(cè)腫瘤組織中mdsc細(xì)胞(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)的比例；mann-whitneyu檢驗(yàn)用于差異顯著性分析。

圖10.acat抑制劑增強(qiáng)人pbmc中cd8⁺t細(xì)胞的效應(yīng)功能

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控t細(xì)胞的膽固醇代謝，可以提高cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。通過(guò)對(duì)該現(xiàn)象的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：這種功能增強(qiáng)表型的獲得來(lái)自于cd8t細(xì)胞質(zhì)膜表面膽固醇水平的上升。進(jìn)一步的，本發(fā)明又經(jīng)試驗(yàn)證明，單純提高t細(xì)胞質(zhì)膜表面膽固醇水平同樣可以增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明認(rèn)為采用直接或間接的手段最終達(dá)到提 高t細(xì)胞質(zhì)膜表面膽固醇水平的效果，則均可增強(qiáng)t細(xì)胞的效應(yīng)功能，從而上調(diào)t細(xì)胞的活性。

膽固醇合成促進(jìn)劑

是指對(duì)于膽固醇合成具有促進(jìn)效果，從而增加質(zhì)膜膽固醇水平的化合物。對(duì)于膽固醇合成具有促進(jìn)效果包括但不限于：提高上調(diào)膽固醇合成的多肽、蛋白或酶的活性，抑制下調(diào)膽固醇合成的多肽、蛋白或酶的活性，或者使促進(jìn)膽固醇合成的多肽、蛋白或酶的基因過(guò)表達(dá)，或者抑制下調(diào)膽固醇合成的多肽、蛋白或酶基因的表達(dá)。膽固醇合成相關(guān)基因如：srebp1,srebp2,acaca,fasn,hmgcs,hmgcr和sqle等。

膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑

是指對(duì)于膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(包括細(xì)胞從胞外吸收膽固醇，并轉(zhuǎn)運(yùn)到其他相應(yīng)細(xì)胞器整個(gè)過(guò)程)具有促進(jìn)效果，從而增加質(zhì)膜膽固醇水平的化合物。對(duì)于膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)具有促進(jìn)效果包括但不限于：提高上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽、蛋白或酶的活性，抑制下調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽、蛋白或酶的活性，或者使促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽、蛋白或酶的基因過(guò)表達(dá)，或者抑制下調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽、蛋白或酶基因的表達(dá)。膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因如ldlr(ldlreceptor)、idol(inducible-degredatorofldlreceptor)等。

膽固醇儲(chǔ)存抑制劑

是指對(duì)于膽固醇儲(chǔ)存具有抑制效果，從而增加質(zhì)膜膽固醇水平的化合物。游離膽固醇在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酯?；揎椶D(zhuǎn)化成膽固醇酯(cholesterylester)進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行儲(chǔ)存，而抑制膽固醇的酯?；揎椈蛘邷p少膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存則可促進(jìn)未經(jīng)修飾的游離膽固醇向細(xì)胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)于膽固醇儲(chǔ)存具有促進(jìn)效果包括但不限于：抑制上調(diào)膽固醇儲(chǔ)存的多肽、蛋白或酶的活性，促進(jìn)下調(diào)膽固醇儲(chǔ)存的多肽、蛋白或酶的活性，或者使抑制膽固醇儲(chǔ)存的多肽、蛋白或酶的基因過(guò)表達(dá)，或者促進(jìn)下調(diào)膽固醇儲(chǔ)存的多肽、蛋白或酶基因的表達(dá)，或者促進(jìn)膽固醇酯水解相關(guān)多肽、蛋白和酶的表達(dá)。

膽固醇外排抑制劑

是指對(duì)于膽固醇外排具有抑制效果，從而增加質(zhì)膜膽固醇水平的化合物。對(duì)于膽固醇外排具有抑制效果包括但不限于：提高下調(diào)膽固醇外排的多肽、蛋白或酶的活性，抑制上調(diào)膽固醇外排的多肽、蛋白或酶的活性，或者使下調(diào)膽固醇外排的多肽、蛋白或酶的基因過(guò)表達(dá)，或者抑制上調(diào)膽固醇外排的多肽、蛋白或酶基因的表達(dá)。膽固醇外排相關(guān)基因如abca1和abcg1等。

所述的膽固醇合成促進(jìn)劑、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑、膽固醇儲(chǔ)存促進(jìn)劑、膽固醇降解抑制劑、膽固醇轉(zhuǎn)化抑制劑或膽固醇外排抑制劑包括但不限于為sirna、shrna、抗體、小分子化合物、轉(zhuǎn)基因載體等。

酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat

酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的平衡的一種酶，在生物體內(nèi)催化膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸形成膽固醇酯。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)兩種同工異構(gòu)酶acat1和acat2。acat1選擇性地在組織與細(xì)胞中表達(dá)，與細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝平衡有關(guān)；而acat2則廣泛存在于肝臟、胃腸道等細(xì)胞中，主要參與飲食中膽固醇的吸收和載脂蛋白的裝配。

?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑

是指對(duì)于酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果的化合物。對(duì)于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性，或者抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

所述的?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑包括但不限于為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑可以是對(duì)acat1與acat2沒(méi)有選擇性的acat抑制劑，已知的例如purpactins，manassantina,diphenylpyridazinederivatives,glisoprenina，cp113,818、avasimibe、pactimibe等，也可以是對(duì)acat1具有選擇性抑制的抑制劑，已知的例如k604等。還可以選自ci976、tmp-153、ym750、geri-bp002-a、sandoz58-035、vulm1457、cl-283,546、ci-999、e5324、ym17e,fr182980、pd132301-2、f-1394、hl-004、f-12511(eflucimibe)、cinnamicacidderivatives、dup128、rp-73163、pyripyropenec、fo-1289、as-183、spc-15549、beaui、beauiii、fo-6979、angelica、ginseng、decursin、terpendolec、beauvericin、spylidone、pentacecilides、cl-283,546、cinnamicderivatives、betulinicacid、shikoninderivatives、esculeogenina和wu-v-23等。

抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性是指使酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1酶活力下降。優(yōu)選的，相比抑制前，?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1酶活力降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)是指：使?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因不轉(zhuǎn)錄，或降低?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因的轉(zhuǎn)錄活性，或者使?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因不表達(dá)，或降低?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因的表達(dá)活性。

優(yōu)選地，與野生型相比，acat1基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地acat1基因完全沒(méi)有表達(dá)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如采用基因敲除、同源重組， 干擾rna等下調(diào)基因的表達(dá)，采用轉(zhuǎn)基因的方法上調(diào)基因的表達(dá)等。。

基因表達(dá)的增強(qiáng)或抑制可以通過(guò)pcr及westernblot檢測(cè)表達(dá)量驗(yàn)證。

t細(xì)胞活性促進(jìn)劑

指對(duì)t細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用的化合物。優(yōu)選的，本發(fā)明所指的t細(xì)胞活性促進(jìn)劑至少能促進(jìn)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能，或者所述t細(xì)胞活性促進(jìn)劑至少能促進(jìn)cd8t細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。

小分子化合物

本發(fā)明中指由幾個(gè)或幾十個(gè)原子組成，分子質(zhì)量在1000以下的化合物。

avasimibe(ci-1011)

化學(xué)名稱(chēng)：2,6-diisopropylphenyl2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate

分子式：c29h43no4s

ic50:acat,3.3μm；cyp2c9,2.9μm；cyp1a2,13.9μm；cyp2c19,26.5μm

casno.166518-60-1

結(jié)構(gòu)式如下

k604

化學(xué)名稱(chēng)：

2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-n-[2,4-bis(methyllthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide

ic50:acat1,0.45μm；acat2,102.85μm

結(jié)構(gòu)式：

在文獻(xiàn)ikenoya,m.etal.aselectiveacat-1inhibitor,k-604,suppressesfattystreaklesionsinfat-fedhamsterswithoutaffectingplasmacholesterollevels..atherosclerosis191,290-297, doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公開(kāi)。

cp113,818

化學(xué)名稱(chēng)：(-)-n-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoicamide

ic50:17-75nm

結(jié)構(gòu)式：

在文獻(xiàn)hutter-paier,b.etal.theacatinhibitorcp-113,818markedllyreducesamyloidpathologyinamousemodelofalzheimer'sdisease.neuron44,227-238,doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公開(kāi)

u18666a

casno.3039-71-2

ci976

化學(xué)名稱(chēng)：2,2-dimethyl-n-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide

分子式：c23h39no4

casno.114289-47-3；

ic50:soat1:ic50＝73nm(human)；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝73nm(rat)；sterolo-acyltransferase,soat:ic50＝110nm(rat)；foamcellformation:ic50＝3.8μm(ratperitonealmacrophages)；golgi-associatedlpatactivity:ic50＝15μm

結(jié)構(gòu)式

tmp-153

分子式：c24h18cif2n3o

casno.128831-46-9

ic50:cholesterolacyltransferase(acat):ic50＝5-10nm；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝5.8nm(rattusnorvegicus)

ym750

分子式：c31h36n2o

casno.138046-43-2

ic50:0.18μm

geri-bp002-a

化學(xué)名稱(chēng)：2,2'-methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol)；

分子式c23h32o2

casno.119-47-1

sandoz58-035

化學(xué)名稱(chēng)：

3-[decyldimethylsilyl]-n-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiidesa58-035

分子式：c30h47nosi

casno.78934-83-5

ic50:acat1,0.3μm(rat)

vulm1457

化學(xué)名稱(chēng)：

n-[2,6-bis(1-methylethyl)phenyl]-n'-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea；

分子式：c25h27n3o3s

casno.228544-65-8

lovastatin，

結(jié)構(gòu)式如下：

u18666a

casno.3039-71-2

ctl細(xì)胞

ctl細(xì)胞即為細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte,ctl)，是一種終末分化的cd8t細(xì)胞，可以通過(guò)其tcr識(shí)別相應(yīng)抗原并對(duì)表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞或者受感染的細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

cd8t細(xì)胞

cd8t細(xì)胞即為cd8陽(yáng)性t細(xì)胞。cd8(群集分化8)是作為協(xié)同受體的t細(xì)胞受體(tcr)的跨膜糖蛋白。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān) 領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

1.材料和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基(dmem)、胎牛血清(fbs)購(gòu)自lifetechnologies；filipiniii,lovastatin,mβcd,mβcd-cholesterol購(gòu)自sigma；α-cd3和α-cd28購(gòu)自biolegend；流式分析抗體α-mcd4(rm4-5),α-mcd8(53-6.7),α-mcd3ε(145-2c11),α-ifn-γ(xmg1.2),α-tnf-α(mp6-xt22),α-granzymeb(ngzb),α-cd44(im7),α-cd69(h1.2f3),α-pd-1(j43),α-ctla-4(uc10-4b9),α-ki67(16a8),α-foxp3(fjk-16s),α-gr1(rb6-8c5),α-cd11b(m1/70)和α-cd45(30-f11)購(gòu)自ebioscience；western-blotting抗體α-pcd3ζ購(gòu)自abcam,α-cd3ζ購(gòu)自santacruze,α-pzap70,α-zap70,α-plat,α-lat,α-perk1/2和α-erk1/2購(gòu)自cellsignaling；mts檢測(cè)試劑盒購(gòu)自promega；u18666a購(gòu)自merck；avasimibe購(gòu)自selleck；k604由中科院上海藥物研究所合成；cp113,818由pierrefabre提供；el-4,b16f10細(xì)胞系和llc(lewislungcarcinoma)細(xì)胞系最初來(lái)源于atcc,由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

c57bl/6小鼠購(gòu)自slac；ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)自jackson實(shí)驗(yàn)室；cd4^cre轉(zhuǎn)基因小鼠由中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所劉小龍研究組提供(最初來(lái)源于jaxmice)；acat1^flox/flox來(lái)自ingeneiouslabs，該試驗(yàn)動(dòng)物在acat1基因的14號(hào)外顯子毗鄰的兩個(gè)內(nèi)含子上分別有一個(gè)loxp位點(diǎn)，該外顯子編碼有his460位點(diǎn)，該位點(diǎn)是acat1的酶活所必需的，acat1^flox/flox可采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)中所有的動(dòng)物都飼養(yǎng)在spf設(shè)施中。

3.t細(xì)胞分離，培養(yǎng)和流式檢測(cè)

t細(xì)胞來(lái)自小鼠脾臟和淋巴結(jié)，通過(guò)cd8或者cd4陰性篩選磁珠(stemcell)進(jìn)行分離得到。對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)t細(xì)胞的分離，小鼠在注射腫瘤后14-18天，將腫瘤取出，剪成 1-2mm碎片，膠原酶iv(sigma)消化1小時(shí)，然后通過(guò)40–70％percoll(ge)密度梯度離心得到腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞群。為進(jìn)一步得到腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞，進(jìn)一步用cd8陽(yáng)性磁珠分選試劑盒(stemcell)進(jìn)行分離。

分離得到的細(xì)胞用含50μmβ-巰基乙醇的rpmi1640完全培養(yǎng)基在37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。為進(jìn)一步分析t細(xì)胞的功能表型，針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物如cd8,cd44,cd69，細(xì)胞離心后直接用percp-α-cd8，fitc-α-cd44，pe-α-cd69進(jìn)行染色，然后流式檢測(cè)；而針對(duì)胞內(nèi)顆粒酶和細(xì)胞因子的檢測(cè)，分離到的細(xì)胞繼續(xù)用1μmionomycin和50ng/mlpma刺激培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中加入5μg/mlbrefieldina(bfa)，以阻斷顆粒酶和細(xì)胞因子向胞外分泌。刺激結(jié)束后，4％多聚甲醛(pfa)室溫固定10分鐘，然后胞內(nèi)染色檢測(cè)胞內(nèi)顆粒酶和細(xì)胞因子的水平。

4.膽固醇定量

a.filipin染色和激光共聚焦成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇進(jìn)行相對(duì)定量

filipiniii溶于甲醇中至5mg/ml。t細(xì)胞用4％pfa固定，然后用50μg/mlfilipiniii于4℃染色30分鐘，然后pbs洗5次以去除游離filipin。成像圖片由leicasp8激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)獲取，相對(duì)定量結(jié)果由leicalasaf軟件分析得到。

b.基于膽固醇氧化的膽固醇定量方法

細(xì)胞經(jīng)0.1％戊二醛固定15分鐘后，pbs洗3次，然后用2u/ml膽固醇氧化酶室溫處理15分鐘以氧化細(xì)胞質(zhì)膜上游離膽固醇；氧化反應(yīng)結(jié)束后pbs洗3次以去除殘留的膽固醇氧化酶，細(xì)胞內(nèi)未被氧化的游離膽固醇用甲醇/氯仿(v:v＝1:2)提取，然后用amplexredcholesterol檢測(cè)試劑盒(lifetechnology)對(duì)游離膽固醇進(jìn)行定量。細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇的含量由未被氧化酶處理的樣品膽固醇含量減去氧化酶處理過(guò)的樣品膽固醇含量得到。

5.mβcd和mβcd-cholesterol處理改變細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平

為降低細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平，0.1–1mmmβcd37℃處理cd8t細(xì)胞5分鐘，然后pbs洗三次。為提高細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平，1-10μg/mlmbcd-cholesterol37℃處理cd8t細(xì)胞15分鐘，然后pbs洗三次。

6.ova抗原激活ot-icd8t細(xì)胞

將c57bl/6小鼠脾臟細(xì)胞中的t細(xì)胞用t細(xì)胞陽(yáng)性磁珠分選試劑盒(miltenyibiotech)去除，然后分別遞呈ova抗原ova257-264(siinfekl，簡(jiǎn)稱(chēng)n4)，及突變體sainfekl(簡(jiǎn)稱(chēng)a2)，siitfekl(簡(jiǎn)稱(chēng)t4)，siigfekl(簡(jiǎn)稱(chēng)g4)以及自身抗原rtytyekl(簡(jiǎn)稱(chēng)catnb)和陽(yáng)性選擇抗原siirfekl(簡(jiǎn)稱(chēng)r4)作為抗原遞呈細(xì)胞(apc)。具體的，為分別將ova抗原 ova257-264，a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb與前述處理后的小鼠脾臟細(xì)胞一起在37℃孵育以得到抗原呈遞細(xì)胞，同時(shí)；將陰性磁珠分選得到的ot-icd8t細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞共同培養(yǎng)(1：5)24小時(shí)，在培養(yǎng)的最后4小時(shí)加入5μg/mlbfa(是布雷菲德菌素a)，以阻止細(xì)胞因子向胞外分泌，最后通過(guò)胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。

7.檢測(cè)cd8t細(xì)胞(ctl)的細(xì)胞殺傷能力。

分離ot-i轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后用5nmova257-264(n4)刺激，并在培養(yǎng)基中加入10ng/mlil-2，3天后換液補(bǔ)加il-2并繼續(xù)培養(yǎng)2天得到分化成熟的殺傷性cd8t細(xì)胞(ctl)。將el-4小鼠淋巴瘤細(xì)胞分別與2nm抗原肽ova257-264及其突變體a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb在37℃孵育30分鐘以遞呈相關(guān)抗原，pbs洗3次后將遞呈抗原的el-4細(xì)胞和ctl重懸在無(wú)酚紅rpmi1640培養(yǎng)基(含2％fbs)中，然后以1：1，1：2，1：5比例混合(el-4細(xì)胞數(shù)量為1×10⁵)加入96孔板中，200g離心2分鐘。37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，200g離心5分鐘，取培養(yǎng)上清液，通過(guò)cytotox96non-radioactivecytotoxicity試劑盒(promega)檢測(cè)培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶ldh的釋放以計(jì)算ctl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率。

8.小鼠b16黑色素瘤模型

b16f10黑色素瘤細(xì)胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過(guò)40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(cè)(100μl體積)，從第10天開(kāi)始，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，每?jī)商鞙y(cè)一次，腫瘤大?。介L(zhǎng)度×寬度。當(dāng)腫瘤其最長(zhǎng)軸超過(guò)20mm時(shí)，將小鼠安樂(lè)死，并記錄死亡時(shí)間點(diǎn)。

10.小鼠黑色素瘤t細(xì)胞過(guò)繼治療

表達(dá)雞卵清蛋白o(hù)valbumin的b16f10-ova黑色素瘤細(xì)胞(可參考文獻(xiàn)：yangjetal.,kuper-typeimmunologicalsynapsecharacteristicsdonotpredictanti-braintumorcytolytict-cellfunctioninvivo.procnatlacadsciusa.2010.197(10):4716-21；或zhoupetal.,invivodiscoveryofimmunotherapytargetsinthetumourmicroenvironment.nature.2014,506(7486):52-7獲得)用胰酶消化后，pbs洗3次后過(guò)40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(cè)(100μl)。在注射腫瘤細(xì)胞后第10天，將成瘤且腫瘤大小一致的小鼠隨機(jī)分成3組，以尾靜脈注射(i.v.)的方式分別注射200μlpbs，野生型ot-ictl和acat1基因敲除的ot-ictl(1.5×10⁶)，3天后開(kāi)始測(cè)量腫瘤大小，每?jī)商鞙y(cè)一次。當(dāng)腫瘤其最長(zhǎng)軸超過(guò)20mm時(shí)，將小鼠安樂(lè)死，并記錄死亡時(shí)間點(diǎn)。

acat1基因敲除的ot-i小鼠的獲得：cd4^cre小鼠與acat1^flox/flox小鼠交配獲得cd4^cre-acat1^flox/flox,然后與otitcr轉(zhuǎn)基因小鼠交配，最終獲得ot-i-cd4^cre-acat1^flox/flox小鼠和相應(yīng)的對(duì)照小鼠ot-i-^e-acat1^flox/flox小鼠。

ctl的誘導(dǎo)方法是：取野生型或acat1基因敲除的oti小鼠脾臟，分別用10nm的ova257-264(n4)肽段刺激，并提供10ng/mlil-2，刺激2天后，在第3天換無(wú)n4肽段的培養(yǎng)基(含10ng/mlil-2)繼續(xù)培養(yǎng)2天即可獲得成熟的ctl。

11.小鼠llc肺癌模型

llc(lewislungcarcinoma)肺癌細(xì)胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過(guò)40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至10⁷/ml，然后尾靜脈注射(i.v.)到8-10周雄鼠體內(nèi)(200μl體積)。在注射腫瘤細(xì)胞后第11天，將荷瘤小鼠隨機(jī)分成2組，以腹腔注射(i.p.)的方式給小鼠注射avasimibe，劑量為15mg/kg，3天注射一次，連續(xù)給藥9次。在注射腫瘤細(xì)胞后7周，取部分小鼠的肺臟，對(duì)腫瘤斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以評(píng)估腫瘤治療效果，同時(shí)記錄剩余小鼠的死亡時(shí)間點(diǎn)。

12.超高分辨率隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡storm(super-resolutionstochasticalopticalreconstructionmicroscopy)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)膜上tcr(抗原受體)的分布。

超高分辨率隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡storm成像在nikonn-storm成像系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)配有eclipseti-e電動(dòng)相差顯微鏡，apochromat100倍tirf油鏡和emccd。熒光染料選用alexa647，通過(guò)647nm連續(xù)可見(jiàn)光激光器(200mw)和450nm二極管激光器激發(fā)熒光染料。成像時(shí)tirf角度參數(shù)在3900-4000，以保證樣品成像深度在1μm左右。cd8t細(xì)胞和激活的cd8t細(xì)胞(10μg/mlα-cd3抗體37℃刺激10分鐘)通過(guò)多聚賴(lài)氨酸貼在ibidi35mmμ-dish上，然后4％pfa固定；pbs洗3次后用2μg/mlalexa647-α-cd34℃標(biāo)記2小時(shí)。成像前，將pbs替換成成像緩沖液(tbs，含100mmmea)。成像速度保持在90-95幀/秒，重構(gòu)的圖像用niselementsar獲取，圖像信息由20,000-25,000幀圖片組成。

為了分析tcr在質(zhì)膜上的成簇情況，對(duì)圖片中tcr微簇的位置信息用ripley’skfunction和matlab分析，l(r)-r值代表在一定半徑(r)內(nèi)分子聚集的概率，而l(r)-r最大值對(duì)應(yīng)的r即分析選定區(qū)域內(nèi)tcr微簇的半徑。

13.全內(nèi)反射熒光顯微成像tirfm(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy，)方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)t細(xì)胞免疫突觸形成過(guò)程。

dopc(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)與生物素標(biāo)記的dope(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩爾比混合，超聲形成脂質(zhì)體。使用no.1.5h厚度玻璃底的細(xì)胞培養(yǎng)皿，食人魚(yú)酸液處理玻璃底表面并用雙蒸水清洗 干凈。用濃度0.1mm的生物素標(biāo)記的脂質(zhì)體孵育玻片20分鐘。pbs充分清洗后，用鏈霉親和素(streptavidin)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用生物素標(biāo)記的小鼠cd3ε抗體(bionylatedα-mcd3ε,145-2c11)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用1％酪蛋白封閉20分鐘。pbs充分清洗，平面脂雙分子層準(zhǔn)備完畢。

α-mtcrβ抗體(biolegend)進(jìn)行熒光染料標(biāo)記(alexafluor568nhsester，lifetechnologies),經(jīng)脫鹽柱脫鹽后使用papain蛋白酶酶切(piercefabmicropreparationkit,thermoscientific),最后經(jīng)proteina柱分離(proteinaplusspincolumn,thermoscientific)得到alexa568-α-mtcrβ-fab。

新鮮分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞用alexa568-α-mtcrβ-fab和fitc-α-mcd8a(ebioscience)冰上染色，pbs清洗2次。重懸的細(xì)胞加入如上所述的鋪有平面脂雙分子層的培養(yǎng)皿，置于37℃加熱臺(tái)，以3秒每幀的速度拍攝，進(jìn)行活細(xì)胞全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像?；蛘咧貞业募?xì)胞加入上文所述鋪有平面脂雙分子層的培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱，刺激一定時(shí)間后用4％pfa固定，全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像。fitc陽(yáng)性的cd8t細(xì)胞用imageproplussoftware(mediacybernetics)、imagej(nih)和matlab(mathworks)軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)分析。

14.mts方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活率。

b16f10細(xì)胞(5×10³)重懸于100μl含有1μmavasimibe或dmso對(duì)照的培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)24、48、或72小時(shí)。加入20μlmts試劑(promega)，孵育1-3小時(shí)后，測(cè)量490nm吸光度。490nm處的吸光值與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。avasimibe對(duì)細(xì)胞活性的影響通過(guò)以dmso處理的細(xì)胞為對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理得到，設(shè)定dmso處理組的細(xì)胞活性為1。

15.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

除在圖釋中特別注明外，本文所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)都是用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法采用two-tailedunpairedstudent’st-test；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns：無(wú)顯著差異(nosignificantdifference)。

16.t細(xì)胞特異性敲除acat1小鼠的構(gòu)建及acat1^ckocd8t、acat1^ckocd4t細(xì)胞的獲得

將acat1^flox/flox小鼠與cd4^cre小鼠交配，獲得的小鼠經(jīng)pcr及westernblot檢測(cè)表達(dá)量驗(yàn)證為t細(xì)胞特異性敲除acat1小鼠(cd4^cre-acat1^flox/flox,簡(jiǎn)稱(chēng)acat1^cko)。

acat1^ckocd8t細(xì)胞的獲得：采用cd8磁珠分選得到(分選試劑盒來(lái)自stemcell)

acat1^ckocd4t細(xì)胞的獲得：采用cd4磁珠分選得到(分選試劑盒來(lái)自stemcell)

17.cd8t細(xì)胞活化方法

通過(guò)磁珠分選得到的新鮮t細(xì)胞，重懸于rpmi1640完全培養(yǎng)基中，α-cd3(5μg/ml) 和α-cd28(μg/ml)鋪板刺激,37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激24小時(shí),為進(jìn)一步用胞內(nèi)染色-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)，在最后4小時(shí)補(bǔ)加5μg/mlbrefeldina以阻斷細(xì)胞因子向細(xì)胞外分泌。

實(shí)施例1細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平影響cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能

本實(shí)施例用環(huán)糊精mβcd處理acat1^ckocd8t細(xì)胞，然后檢測(cè)cd8t細(xì)胞顆粒酶b和細(xì)胞因子的表達(dá)，以及殺傷性cd8t細(xì)胞(ctls)的靶細(xì)胞殺傷能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)mβcd處理下調(diào)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平后，其顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ，tnfα的表達(dá)顯著下降，且呈一定的劑量效應(yīng)。相應(yīng)地，ctl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力也明顯減弱(圖1.a-b)。實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步通過(guò)mβcd包被的膽固醇(chol)處理野生型cd8t細(xì)胞，上調(diào)其細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平。結(jié)果顯示，野生型cd8t細(xì)胞被上調(diào)質(zhì)膜膽固醇水平后，其顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ，tnfα的表達(dá)明顯上升，且呈劑量效應(yīng)，相應(yīng)地，ctl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力也明顯增強(qiáng)(圖1.c-d)。這些證據(jù)表明cd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇對(duì)其效應(yīng)功能的實(shí)現(xiàn)是必需的，而acat1^ckocd8t細(xì)胞是通過(guò)其質(zhì)膜膽固醇水平上調(diào)獲得更強(qiáng)的免疫應(yīng)答效應(yīng)。

實(shí)施例2抑制膽固醇酯化可以增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能

試驗(yàn)方法：磁珠分選得到的細(xì)胞重懸于rpmi1640完全培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)濃度的抑制劑，37度co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理6小時(shí)，然后rpmi1640完全培養(yǎng)基清洗3次，最后重懸于rpmi1640完全培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到鋪有激活抗體α-cd3和α-cd28的孔板中，37度co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激20小時(shí)，然后加入brefeldina(5μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，抑制細(xì)胞因子的分泌。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，進(jìn)行cd8抗體表面標(biāo)記，然后用4％多聚甲醛室溫固定10分鐘，0.1％triton-x100對(duì)細(xì)胞膜打孔后加抗granzymeb,ifnγ,tnfα抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白，最后通過(guò)流式檢測(cè)檢測(cè)cd8陽(yáng)性細(xì)胞中相應(yīng)蛋白如granzymeb,ifnγ和tnfα的表達(dá)水平。

本實(shí)施例的目的是研究膽固醇代謝與cd8t細(xì)胞功能的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列抑制劑抑制膽固醇代謝相關(guān)通路，然后檢測(cè)cd8t細(xì)胞的功能是否發(fā)生相應(yīng)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞膽固醇合成抑制劑lovastatin和細(xì)胞膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑u18666a都顯著抑制cd8t細(xì)胞顆粒酶b(granzymeb,gzmb)的釋放以及細(xì)胞因子如ifnγ和tnfα的表達(dá)，且抑制效果呈劑量效應(yīng)(圖2.a,b)。通過(guò)cp113,818抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1和acat2的活性，則明顯促進(jìn)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能(圖2.c)。在cd8t細(xì)胞中acat1的轉(zhuǎn)錄水平約是acat2的20倍，選取acat1的特異性抑制劑k604處理cd8t細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， k604處理同樣增強(qiáng)cd8t相比的效應(yīng)功能(圖2.d)。表明通過(guò)抑制acat1的功能則增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的效應(yīng)功能。

實(shí)施例3acat1敲除上調(diào)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平

本實(shí)施例進(jìn)一步研究acat1基因敲除后cd8t細(xì)胞抗腫瘤活性增強(qiáng)的具體分子機(jī)理。首先，檢測(cè)了cd8t細(xì)胞活化前后，膽固醇代謝相關(guān)途徑是否受acat1敲除的影響。通過(guò)實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)了膽固醇代謝的主要通路包括膽固醇合成、吸收和外排，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^ckocd8t細(xì)胞在活化后其膽固醇合成通路明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為固醇合成通路相關(guān)基因如srebp1,srebp2,acaca,fasn,hmgcs,hmgcr以及sqle的mrna水平明顯升高，而膽固醇的吸收和外排途徑相關(guān)基因mrna水平只有輕微改變(圖3.e-p)。進(jìn)一步通過(guò)filipiniii成像和基于膽固醇氧化的定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞膽固醇水平是否受acat1敲除的影響，結(jié)果表明acat1^ckocd8t細(xì)胞在活化前后，其總游離膽固醇水平及質(zhì)膜膽固醇水平較野生型cd8t細(xì)胞顯著升高(圖3.a-d)。這些證據(jù)表明acat1基因敲除改變了cd8t細(xì)胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)，使得膽固醇合成增加，膽固醇酯化減少，從而使得細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇水平增加。

實(shí)施例4avasimibe通過(guò)抑制acat1促進(jìn)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性。

本實(shí)施例的目的是驗(yàn)證avasimibe是否是通過(guò)抑制acat1發(fā)揮其腫瘤免疫能力。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，在體外用avasimibe對(duì)cd8t細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)其細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平的變化。通過(guò)filipiniii對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理后，cd8t細(xì)胞質(zhì)膜游離膽固醇水平明顯上升(圖4.a,b)。通過(guò)storm對(duì)cd8t細(xì)胞表面tcr的定位進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，avasimibe處理促進(jìn)tcr微簇的形成(圖4.c-e)；通過(guò)tirfm對(duì)t細(xì)胞活化過(guò)程中免疫突觸的形成進(jìn)行分析，也表明avasimibe處理促進(jìn)cd8t細(xì)胞免疫突觸的形成(圖4.f,g)。進(jìn)一步通過(guò)western-blotting方法檢測(cè)avasimibe處理后tcr信號(hào)通路的活化情況，結(jié)果也表明avasimibe處理增強(qiáng)tcr信號(hào)通路的活化(圖4.h)。這些結(jié)果與acat1敲除的cd8t細(xì)胞的表現(xiàn)一致。同時(shí)，為進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證該機(jī)制，實(shí)驗(yàn)從avasimibe給藥的荷瘤小鼠的腫瘤中分離腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞，通過(guò)storm對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞上tcr的分布進(jìn)行成像分析，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理(于rpmi1640完全培養(yǎng)基中加藥后，37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理6小時(shí)，處理完之后用培養(yǎng)基或pbs離心清洗3次)后，腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞表面tcr微簇更大(圖4.i-k)。這些證據(jù)表明avasimibe確實(shí)是通過(guò)抑制acat1促進(jìn)cd8t細(xì)胞的活化，從而增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

實(shí)施例5acat1基因敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞的增殖并減少凋亡

本實(shí)施例的目的是為了檢測(cè)acat1對(duì)cd8t細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)cfse標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，用α-cd3+α-cd28抗體刺激cd8細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)acat1對(duì)cd8t細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)與野生型cd8t細(xì)胞相比，acat1^ckocd8t細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)(圖5.a)。同時(shí)通過(guò)annexinv和pi染色檢測(cè)cd8t細(xì)胞激活后的凋亡，結(jié)果顯示acat1^ckocd8t細(xì)胞annexinv^-pi^-的活細(xì)胞所占比例相比較與野生型細(xì)胞的明顯增多，而處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞(annexinv⁺pi^-和annexinv⁺pi⁺)所占比例則顯著減少(圖5.b,c)。

實(shí)施例6利用三種黑色素瘤模型研究acat1基因敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性

免疫治療是當(dāng)前治療腫瘤的熱點(diǎn)，而cd8t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力直接關(guān)系到腫瘤免疫治療的效果。為了驗(yàn)證acat1敲除對(duì)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤能力的影響，本實(shí)施例首先建立了皮下黑色素瘤模型，在acat1^cko小鼠和野生型小鼠中皮下注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠黑色素瘤的進(jìn)程被顯著延緩，表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)更慢，小鼠的生存率和生存期更長(zhǎng)(圖6.a,b)。對(duì)荷瘤小鼠的t細(xì)胞的表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在acat1^cko小鼠中，腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞活性更強(qiáng)，表現(xiàn)為acat1^cko小鼠腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞中，cd44高表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞更多，表達(dá)顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高；而且acat1^cko小鼠腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞的數(shù)量、cd8/cd4細(xì)胞的比例也要高于野生型、細(xì)胞增殖的標(biāo)志物ki-67的表達(dá)水平也更高(圖6.c,d)。免疫檢測(cè)點(diǎn)受體如pd-1和ctla-4目前是腫瘤免疫治療的熱門(mén)靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞表面pd-1和ctla-4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在acat1^cko和野生型小鼠中沒(méi)有明顯差異(圖6.e)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了腫瘤中cd4t細(xì)胞中treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例,發(fā)現(xiàn)acat1敲除并不改變treg細(xì)胞在cd4t細(xì)胞中的比例(圖6.f)。以上結(jié)果表明acat1敲除使cd8t細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)功能增強(qiáng)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證cd8t細(xì)胞在該腫瘤模型中的應(yīng)答反應(yīng)受acat1的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)在皮下注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞后第7天，將acat1^cko和野生型小鼠的引流淋巴結(jié)(draininglymphnode)取出，分析其中t細(xì)胞的表型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠引流淋巴結(jié)中的cd8t細(xì)胞cd44水平和細(xì)胞因子ifnγ的表達(dá)上升(圖6.g)，而且cd8t細(xì)胞的數(shù)量以及cd8/cd4的比率也顯著升高(圖6.h)，表明acat1缺陷促進(jìn)cd8t細(xì)胞的初始免疫應(yīng)答反應(yīng)。

相比較與皮下實(shí)體瘤，轉(zhuǎn)移型腫瘤的進(jìn)程更為復(fù)雜，其治療更為艱難。為進(jìn)一步檢測(cè) acat1缺陷是否影響cd8t細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)建立了黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，向acat1^cko和野生型小鼠尾靜脈注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞，然后檢測(cè)肺臟中黑色素瘤的發(fā)展進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在acat1^cko小鼠中，與野生型對(duì)照小鼠相比，其肺臟腫瘤數(shù)量明顯減少，而且小鼠的生存率和生存期更長(zhǎng)(圖6.i-k)。通過(guò)蘇木精-伊紅(h&e)對(duì)肺臟組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)acat1基因敲除后，黑色素瘤在肺臟中的浸潤(rùn)明顯減弱(圖6.l)。對(duì)肺臟t細(xì)胞的表型進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠cd8t細(xì)胞中cd44高表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞更多，表達(dá)顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高(圖6.m)。這些結(jié)果表明acat1缺陷增強(qiáng)cd8t細(xì)胞在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移型腫瘤中的抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)。

由于acat1^cko中所有的t細(xì)胞都缺失acat1，為了驗(yàn)證acat1基因敲除是對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞而非cd4t細(xì)胞的功能的影響而獲得更強(qiáng)抗腫瘤作用，在野生型c57小鼠皮下注射b16f10-ova黑色素瘤細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)ovalbumin，可以被黑色素瘤細(xì)胞的h2kb遞呈在細(xì)胞表面，從而被ot-icd8t細(xì)胞識(shí)別。在野生型小鼠成功誘導(dǎo)黑色素瘤后，在注射腫瘤后第10天以尾靜脈注射的方式，將來(lái)自acat1^cko小鼠和野生型小鼠的ot-ictl注射到荷瘤野生型小鼠體內(nèi)，然后監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)并記錄小鼠的生存情況(圖6.n)，結(jié)果表明，注射了acat1^ckoot-ictl的實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)比注射了野生型ot-ictl的對(duì)照組更慢，而且小鼠的生存時(shí)間更長(zhǎng)(圖6.o,p)，進(jìn)一步表明acat1特異性敲除的cd8t細(xì)胞有更好的抗腫瘤作用。

實(shí)施例7acat1基因敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)膜上t細(xì)胞抗原受體tcr的微簇形成并增強(qiáng)tcr信號(hào)通路的活化。

本實(shí)施例研究了acat1敲除對(duì)tcr的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)α-cd3加α-cd28抗體激活acat1^ckocd8t細(xì)胞，檢測(cè)tcr和其下游信號(hào)分子的活化情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，acat1敲除明顯促進(jìn)tcr磷酸化和tcr近端活化信號(hào)的增強(qiáng)，表現(xiàn)為cd3ζ、zap70和lat的磷酸化明顯增強(qiáng)。同時(shí)tcr的下游通路信號(hào)分子如erk1/2的磷酸化也顯著升高(圖7.a)。實(shí)驗(yàn)采用了超高分辨率隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微成像技術(shù)(super-resolutionstochasticalopticalreconstructionmicroscopy,storm)對(duì)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜表面的tcr微簇進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，acat1基因敲除不改變cd8t細(xì)胞質(zhì)膜上tcr的表達(dá)水平(圖7.b)，但是能明顯促進(jìn)tcr微簇的形成：acat1^ckocd8t細(xì)胞的tcr微簇比野生型cd8t細(xì)胞的更大。由于tcr微簇的形成受tcr活化信號(hào)的影響，t細(xì)胞活化后其tcr微簇會(huì)明顯增大，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了活化后tcr微簇的形成情況。結(jié)果表明，cd8t細(xì)胞活化后其tcr微簇增大， 而且活化的acat1^ckocd8t細(xì)胞的tcr微簇比活化的野生型cd8t細(xì)胞的更大(圖7.c-e)。這些結(jié)果表明acat1基因敲除后cd8t細(xì)胞tcr微簇的增大，從而使得tcr及其下游信號(hào)通路活化增強(qiáng)。

實(shí)施例8acat1基因敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞免疫突觸(immunologicalsynapse,is)的形成。

t細(xì)胞在識(shí)別抗原后，與靶細(xì)胞在細(xì)胞-細(xì)胞接觸面形成免疫突觸結(jié)構(gòu)(immunologicalsynapse)，免疫突觸的形成有助于維持信號(hào)體(signalsome)的穩(wěn)定，以保證t細(xì)胞的充分活化并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。對(duì)于起細(xì)胞殺傷作用的cd8t細(xì)胞，免疫突觸的形成不僅有助于穩(wěn)定signalsome，還能通過(guò)這個(gè)突觸結(jié)構(gòu)向靶細(xì)胞釋放顆粒酶等，增強(qiáng)其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。本實(shí)驗(yàn)研究了acat1敲除的cd8t細(xì)胞對(duì)免疫突觸形成的影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)活細(xì)胞全內(nèi)反射熒光顯微鏡技術(shù)(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy，tirfm)，實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)免疫突觸的形成過(guò)程，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^ckocd8t細(xì)胞能更有效地形成免疫突觸結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為tcr所在的csmac結(jié)構(gòu)形成更快，而且收斂更好(圖8.a,b)。對(duì)免疫突觸形成過(guò)程中tcr微簇的分子動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行分析，結(jié)果表明acat1^ckocd8t細(xì)胞的免疫突觸中可運(yùn)動(dòng)的tcr微簇占全部的tcr微簇的比例更高，且向心移動(dòng)速度更快，有助于免疫突觸的進(jìn)一步穩(wěn)定(圖8.c-e)。

實(shí)施例9acat抑制劑avasimibe增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤功能。

本實(shí)施例目的是進(jìn)一步驗(yàn)證acat1抑制劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。acat1作為用作治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)，目前已有一系列小分子藥物在進(jìn)行動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)。avasimibe是其中一種，目前多次臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了avasimibe在的安全性。因此選用avasimibe，驗(yàn)證acat1作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的可能性。體外實(shí)驗(yàn)表明，avasimibe與其他acat抑制劑如cp113,818和k604一樣，可以促進(jìn)cd8t細(xì)胞顆粒酶b的釋放和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)(圖9.a)。體外殺傷實(shí)驗(yàn)也表明avasimibe增強(qiáng)ctl的靶細(xì)胞殺傷能力，且呈劑量效應(yīng)(圖9.b)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在小鼠黑色素瘤模型中驗(yàn)證avasimibe的作用，通過(guò)對(duì)黑色素瘤荷瘤野生型小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥(15mg/kg)處理，與對(duì)照小鼠相比，avasimibe給藥的小鼠腫瘤生長(zhǎng)減慢，小鼠的生存時(shí)間也顯著延長(zhǎng)(圖9.d-f)。為了驗(yàn)證avasimibe不是通過(guò)直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體外實(shí)驗(yàn)中用avasimibe處理b16f10黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理不影響b16f10細(xì)胞的活性(圖9.c)。對(duì)小鼠腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，avasimibe給藥的小鼠中：其腫瘤浸潤(rùn)的cd8t細(xì)胞活性更高，表現(xiàn)為cd8t細(xì)胞表面活化標(biāo)記cd44的表達(dá)比例更高，而且表達(dá)顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的細(xì)胞比例 也更高。對(duì)小鼠腫瘤浸潤(rùn)的t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)avasimibe給藥組的腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞數(shù)量更多，且cd8/cd4比率更高。另外avasimibe給藥組腫瘤浸潤(rùn)cd8t細(xì)胞中的細(xì)胞增殖標(biāo)記物ki-67的表達(dá)水平也更高(圖9.g-h)?？紤]到腫瘤微環(huán)境的免疫抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了cd8t細(xì)胞上的免疫抑制受體pd-1和ctla-4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)avasimibe給藥并未改變這些免疫檢測(cè)點(diǎn)受體的表達(dá)(圖9.i)。

腫瘤微環(huán)境中還存在有一些抑制型的免疫細(xì)胞如treg(regulatorytcell)和mdsc(myeloid-derivedsuppressorcell)，這些細(xì)胞通過(guò)抑制cd8t細(xì)胞等腫瘤殺傷細(xì)胞的活性，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵的作用。因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了腫瘤組織中treg和mdsc的比例，avasimibe給藥后，treg(cd4⁺foxp3⁺)細(xì)胞在cd4t細(xì)胞中的比例沒(méi)有明顯改變，而mdsc(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)在cd45⁺免疫細(xì)胞中的比例有較輕微的降低(圖9.j，k)，考慮到avasimibe給藥組的腫瘤組織中cd8t細(xì)胞的數(shù)量明顯上升，mdsc在cd45⁺細(xì)胞中的比例降低可能是由于cd8t細(xì)胞在cd45⁺細(xì)胞中的比例上升所致(圖9.h)。這些證據(jù)表明，acat抑制劑avasimibe可以通過(guò)上調(diào)cd8t細(xì)胞殺傷性效應(yīng)而在腫瘤治療中起作用。

實(shí)施例10acat抑制劑增強(qiáng)人pbmc中cd8⁺t細(xì)胞的效應(yīng)功能

本試驗(yàn)的目的是驗(yàn)證acat1作為藥物靶點(diǎn)在臨床上使用的潛在價(jià)值，在人cd8t細(xì)胞中分別用acat抑制劑avasimibe和cp113,818抑制acat的活性，然后通過(guò)抗體交聯(lián)的方式激活cd8t細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd8t細(xì)胞細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)。

試驗(yàn)方法：通過(guò)ficoll從健康志愿者體內(nèi)獲得的外周血中分離pbmc，然后用5μg/mlpha刺激獲得cd8⁺殺傷性t細(xì)胞。3天后換成不含pha的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以降低本底信號(hào)。再使用相應(yīng)濃度的avasimibe或cp113,818孵育處理12小時(shí)，細(xì)胞換液并通過(guò)鋪板刺激的方式用5μg/mlα-cd3+5μg/mlα-cd28抗體刺激24小時(shí)，在最后4小時(shí)加入5μg/mlbrefeldina以阻斷細(xì)胞因子的分泌，最后通過(guò)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd8⁺t細(xì)胞中細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)。雙尾非配對(duì)t-test用于差異顯著性分析。

試驗(yàn)結(jié)果：acat抑制劑cp113,818和avasimibe均能促進(jìn)人cd8t細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)，且具劑量效應(yīng)，表明acat1作為增強(qiáng)cd8t細(xì)胞效應(yīng)功能的靶點(diǎn)同樣適用于人的cd8t細(xì)胞(圖10)。

以上的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案，并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前 提下對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施例。事實(shí)上，各種如上所述的對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的修改來(lái)獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。