本發(fā)明屬于干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，msc)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為胰島、神經(jīng)、血管內(nèi)皮、骨、軟骨、肌肉、肝臟、心肌等多種組織細(xì)胞。mscs因其相對(duì)缺少免疫源性，培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單，并可冷凍保存，因此已成為細(xì)胞及基因治療研究的種子細(xì)胞，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，已成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。然而，現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果不理想，存在細(xì)胞的增殖速度慢、表達(dá)低和獲得增殖的細(xì)胞數(shù)量有限等技術(shù)缺陷。因此，尋找一種可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明公開了一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，用以解決間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度慢、表達(dá)低、獲得增殖的細(xì)胞數(shù)量有限等技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子、珠子參皂苷、香菇多糖、胎牛血清、雙抗、表皮生長(zhǎng)因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為0.5～2ng/ml；所述血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為0.1～0.5ng/ml；所述珠子參皂苷的濃度為0.5～2g/ml；所述香菇多糖的濃度為0.05～0.2g/ml。優(yōu)選的，所述胎牛血清的體積百分比濃度為5vol％～10vol％；所述雙抗的濃度為1vol％；所述表皮生長(zhǎng)因子的濃度為0.5～2ng/ml。優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了一種上述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，將胎牛血清、雙抗、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子、珠子參皂苷、香菇多糖和基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，得到所述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞接種于前述羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的條件為37℃和體積濃度為5％的co2。優(yōu)選的，所述接種的密度為5×104～8×104個(gè)/ml。與現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)基相比，本發(fā)明所提供的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子、珠子參皂苷和香菇多糖，各組分之間合理配伍，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，提高羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)率和細(xì)胞純度，并在較短的時(shí)間內(nèi)獲得足夠的干細(xì)胞數(shù)量，適用于羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的二維或三維培養(yǎng)，滿足研發(fā)需求。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。圖1為實(shí)施例2中p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡照片；其中，圖1-a為40×光學(xué)顯微鏡照片，圖1-b為100×光學(xué)顯微鏡照片；圖2為實(shí)施例2中p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨分化后的光學(xué)顯微鏡照片；其中，圖2-a為40×光學(xué)顯微鏡照片，圖2-b為100×光學(xué)顯微鏡照片；圖3為實(shí)施例2中p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂分化后的光學(xué)顯微鏡照片；其中，圖3-a為40×光學(xué)顯微鏡照片，圖3-b為100×光學(xué)顯微鏡照片。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。實(shí)施例1羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離在無(wú)菌條件下，取產(chǎn)后棄置的新鮮羊膜，剝離羊膜，用pbs緩沖溶液沖洗，將羊膜組織剪成5×5cm2大小的組織碎片，加入3-5倍體積的0.25％胰酶，置于200r/min37℃恒溫?fù)u床上，消化30min，期間每隔10min劇烈搖晃數(shù)次，以去除上皮細(xì)胞。消化完成后，將其轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液瓶中，加入150mlpbs緩沖溶液，劇烈搖動(dòng)，重復(fù)此操作2次。將羊膜組織轉(zhuǎn)移至小燒杯中，剪碎至1mm3。再轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液瓶中，加入0.5％i型膠原酶20ml以及完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，使膠原酶終濃度為0.1-0.2％。置于37℃，250r/min的恒溫?fù)u床中，直到組織塊基本融化。用pbs緩沖溶液稀釋消化后的組織液，1500r/min，離心5min，棄掉上清，用pbs緩沖溶液重懸沉淀，采用100μm過(guò)濾篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液1500r/min，離心5min，獲得原代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例2(1)往dmem/f12培養(yǎng)基中添加下述各種組分，混勻，得到一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基包含以下各組分：胎牛血清：7.5％vol；雙抗：1％vol；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)：1.25ng/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf)：1.25ng/ml；血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(pdgf)：0.3ng/ml；珠子參皂苷：1g/ml；香菇多糖：1g/ml；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基。(2)采用步驟(1)的培養(yǎng)基重懸實(shí)施例1的原代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，然后按5×104～8×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于15cm的培養(yǎng)皿中，再置于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h后換液，之后每2d換一次培養(yǎng)基。待原代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，加入0.25％的edta-trypsin進(jìn)行消化，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至p6代，采用電子顯微鏡進(jìn)行觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖1為p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡照片，如圖1所示，采用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后的細(xì)胞已經(jīng)形成較典型的羊膜間充質(zhì)樣，并有明顯的貼壁現(xiàn)象。待羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，用胰酶消化后使用pbs緩沖溶液洗滌，離心，收集p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。表1為檢測(cè)結(jié)果，如表1結(jié)果所示，采用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的cd105、cd73、cd90和hla-abc的表達(dá)量高于90％，cd45、cd34和hla-dr的表達(dá)量低于1％，顯示羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的屬性。表1流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果標(biāo)記抗體陽(yáng)性比率(％)標(biāo)記抗體陽(yáng)性比率(％)cd340.01cd10599.75cd9099.96hla-abc99.91cd450.07hla-dr0.01cd7399.6//(3)取步驟(2)中收集得到的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，染色，拍照。圖2為p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡照片，如圖2所示，p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化可成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，說(shuō)明由本發(fā)明干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力。以上鑒定結(jié)果參照“國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(isct)”所定制的標(biāo)準(zhǔn)，可證明本發(fā)明所制備的細(xì)胞具備間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。實(shí)施例3(1)往dmem/f12培養(yǎng)基中添加下述各種組分，混勻，得到一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基包含以下各組分：胎牛血清：7.5％vol；雙抗：1％vol；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)：1ng/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf)：1ng/ml；血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(pdgf)：0.3ng/ml；珠子參皂苷：1g/ml；香菇多糖：1g/ml；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基。(2)將實(shí)施例2中的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞采用步驟(1)的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于15cm的培養(yǎng)皿中，接種五皿，共接種5×106個(gè)，再置于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h后換液，之后每3d換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后，用胰酶消化，用pbs緩沖溶液洗滌，離心，收集p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例4(1)往dmem/f12培養(yǎng)基中添加下述各種組分，混勻，得到一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基包含以下各組分：胎牛血清：5％vol；雙抗：1％vol；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)：0.5ng/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf)：0.5ng/ml；血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(pdgf)：0.1ng/ml；珠子參皂苷：0.5g/ml；香菇多糖：0.05g/ml；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基。(2)將實(shí)施例2中的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞采用步驟(1)的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于15cm的培養(yǎng)皿中，接種5皿，共接種5×106個(gè)，再置于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h后換液，之后每3d換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后，用胰酶消化，用pbs緩沖溶液洗滌，離心，收集p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例5(1)往dmem/f12培養(yǎng)基中添加下述各種組分，混勻，得到一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基包含以下各組分：胎牛血清：10％vol；雙抗：1％vol；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)：2ng/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf)：2ng/ml；血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子(pdgf)：0.5ng/ml；珠子參皂苷：2g/ml；香菇多糖：0.2g/ml；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基。(2)將實(shí)施例2中的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞采用步驟(1)的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于15cm的培養(yǎng)皿中，接種5皿，共接種5×106個(gè)，再置于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h后換液，之后每3d換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后，用胰酶消化，用pbs緩沖溶液洗滌，離心，收集p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。對(duì)比例1(1)往dmem/f12培養(yǎng)基中添加下述各種組分，混勻，得到一種羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基包含以下各組分：胎牛血清：8％vol；雙抗：1％vol；表皮生長(zhǎng)因子(egf)：1ng/ml；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：dmem/f12培養(yǎng)基。(2)將實(shí)施例2中的p6代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞采用步驟(1)的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于15cm的培養(yǎng)皿中，接種5皿，共接種5×106個(gè)，再置于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h后換液，之后每3d換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后，用胰酶消化，用pbs緩沖溶液洗滌，離心，收集p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例6收集實(shí)施例3～5和對(duì)比例1的p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。表2為檢測(cè)結(jié)果，如表2結(jié)果所示，采用本發(fā)明培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)得到的p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的cd105、cd73、cd90和hla-abc的表達(dá)量高于90％，cd45、cd34和hla-dr低于1％，說(shuō)明采用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞繼續(xù)保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。與對(duì)比例1的結(jié)果相比，實(shí)施例3～5的流式結(jié)果更優(yōu)。表2流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果對(duì)實(shí)施例3～5和對(duì)比例1的p7代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示，說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)基可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且細(xì)胞純度更高。表3流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5對(duì)比例1細(xì)胞數(shù)(個(gè))2.83×1072.75×1072.78×1071.1×107當(dāng)前第1頁(yè)12