專利名稱：通過測定載脂蛋白c－i用于疾病診斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于疾病的診斷、早期檢測、風險評估和進程監(jiān)控的方法，所述方法中，在來自人患者的血清或血漿樣品中將蛋白質(zhì)載脂蛋白C-I作為生物標記測定，并涉及載脂蛋白C-I作為治療活性物質(zhì)的用途。
首先應該說明在下面的描述中一般使用術(shù)語“診斷方法”時，該術(shù)語通常是對用于疾病的診斷、早期檢測、風險評估和進程的監(jiān)控，包括伴隨治療的進程監(jiān)控的方法的簡化表達，除非是由具體的內(nèi)容給出在各處僅對特定限制的對象的測量。
而且，應該說明，在本申請的上下文中，術(shù)語“疾病”通常用于嚴重的慢性和特別是急性疾病而非用意于涉及認為可能是引起動脈硬化癥的危險因素的脂肪代謝疾病。特別地，將腫瘤和敗血癥挑出稱為“疾病”。然而，根據(jù)本發(fā)明的檢測也能與診斷方法聯(lián)合使用，所述的診斷方法用意在于提供有關(guān)患有其它疾病特別是急性心臟病如心肌梗塞、心絞痛和動脈閉塞性疾病或患糖尿病、突眼性甲狀腺腫和克羅恩氏病的患者的狀態(tài)的更進一步的信息。
與脂類(甘油三酸酯、膽固醇、磷脂)一起形成脂蛋白的蛋白稱為“載脂蛋白”。載脂蛋白的一種重要的功能是使得非水溶性脂質(zhì)能在血清或血漿中運輸?；谥鞍自诔匐x心機的密度梯度中的移動行為，將其歸為四種不同的密度類型乳糜微粒、VLDL(來自非常低密度脂蛋白)、LDL(來自低密度脂蛋白)和HDL(來自高密度脂蛋白)。另外，區(qū)分出了稱為脂蛋白(a)的組。脂蛋白的脂質(zhì)部分越小，其密度就越高。不同密度類型的脂蛋白不僅是基于結(jié)合在一起的脂質(zhì)部分的含量而不同而且也與它們的組成有關(guān)。此外，可以把典型的載脂蛋白性質(zhì)歸于各個密度類型。
載脂蛋白是具有不同長度和氨基酸組成的蛋白，其歸屬于稱為A-H的組，接下來在獨立的組中不同蛋白之間進行區(qū)分并通過附上的數(shù)字表征。簡化地僅將這些蛋白稱為Apo A-I，代替全稱如載脂蛋白A-I。不同的載脂蛋白的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)是已知的，對于許多不同的載脂蛋白，特別是和脂質(zhì)相關(guān)，有關(guān)空間結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)或具體的概念也已存在。在相關(guān)科學文獻中可找到更多詳細信息。
已知，與獲取患者的脂肪代謝的測量數(shù)據(jù)相關(guān)，特別是為了早期檢測動脈硬化癥的風險或為了監(jiān)控用降脂藥物治療患者的治療，還測定目標載脂蛋白。利用在上述類型中的個別脂蛋白密度類型的脂蛋白中某種載脂蛋白獨有地出現(xiàn)或至少占優(yōu)地出現(xiàn)的這個事實并測定它的特異性，這樣，通過測定脂蛋白的載脂蛋白部分，也可以測定后者在患者的血清或血漿中的比例。
也已經(jīng)知道，由于影響載脂蛋白或切割載脂蛋白的酶的形成或本身表現(xiàn)為受體缺陷的重要作用，在個別的患者中發(fā)現(xiàn)不同于正常情況的脂蛋白特性以及載脂蛋白特性。而且據(jù)知，脂肪代謝的紊亂(繼發(fā)性的異常脂蛋白血癥)可作為其它疾病的結(jié)果出現(xiàn)，其中所述的這種紊亂是暫時性的并在治愈疾病后再次消失(參見(20)，186-189頁；括號中的數(shù)字形式的參考文獻指附帶的參考文獻目錄)。只要脂肪代謝中的變化通過載脂蛋白組成中的變化表現(xiàn)出來，科學文獻主要記載了涉及載脂蛋白A-I和A-II并通常反映了HDL的異常形式和異常濃度的那些變化。然而，載脂蛋白在作為用于診斷疾病的生物標記上沒有起到任何顯著的實際作用，其中所述的疾病也已知會伴隨有脂肪代謝紊亂。
本申請涉及以診斷為目的測定載脂蛋白C-I。載脂蛋白C-I屬于具有相對低的分子量的載脂蛋白組，稱為載脂蛋白Apo C-I、Apo C-II和Apo C-III。這三種蛋白的一級結(jié)構(gòu)是已知的(參見(1)、(2)，并對于載脂蛋白C-I，特別是參見(3))。關(guān)于載脂蛋白C-I和C-III的功能所知相對要少，并且還沒有關(guān)于人血清或血漿中的載脂蛋白C-I的數(shù)量或形式和結(jié)合形式的變化取決于某些病理狀態(tài)的文獻記載。(1)-(18)的出版物是在涉及C組載脂蛋白或C-I載脂蛋白的科學文獻中有代表性的出版物，特別是根據(jù)(11)的工作，很好地概述了有關(guān)于載脂蛋白C在脂蛋白代謝中的作用哪些是已知的。經(jīng)描述的載脂蛋白C-I的生物學作用主要包括對膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的抑制、對屬于LDL-受體(LDLR)的蛋白質(zhì)(LRP)的抑制和對LDLR本身及VLDL-受體(VLDLR)的抑制，以及對卵磷脂-膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的活化。
從所述的出版物的內(nèi)容中不能推導出將載脂蛋白C-I作為生物標記測定能用于診斷例如敗血癥或腫瘤的疾病的認識，或暗示在所述的診斷內(nèi)容中測定載脂蛋白C-I。
本發(fā)明是申請者系統(tǒng)研究工作的結(jié)果，其目的在于研究患有敗血癥的患者的蛋白組成的變化并使獲得的研究結(jié)果特定地可用于敗血癥和炎癥的診斷。
這些研究的出發(fā)點是發(fā)現(xiàn)在有敗血癥的情況下激素原-原降鈣素-急劇增加并發(fā)現(xiàn)將原降鈣素作為敗血癥的生物標記檢測對診斷和伴隨治療的過程監(jiān)控有重大的實際價值(參見例如EP656121B1)。此外，由申請者通過不同的途徑研究獲得的涉及敗血癥患者的血清或血漿中的蛋白質(zhì)組成中的變化，在例如已公布的專利申請EP 1 121 600 A2和更近期的另外的專利申請如WO 02/085937、WO 03/005035、WO 03/002600、EP 1 355 158 A1、EP 1 318 406 A1、EP 1 318 407A1和EP 1 355 159 A1以及該申請者的另外相關(guān)的仍未發(fā)表的專利申請中可以找到。參考上述的專利申請的內(nèi)容，特別是關(guān)于對術(shù)語敗血癥的最新認識的說明和在敗血癥病例中測定生物標記的重要性。
因為一些研究已經(jīng)表明許多通常僅認為是典型的腫瘤標志的生物標記(參見EP 1 318 402 A1、EP 1 318 403 A1、EP 1 318 404 A1和EP 1 318 405 A1)在敗血癥病例中的也顯著增加，在研究敗血病患者的樣品的同時也不斷增加考慮患有不同惡性腫瘤疾病的患者的血漿和血清樣品。在許多研究的病例中，發(fā)現(xiàn)在敗血癥病例中處于上升水平的個別生物標記在腫瘤患者的病例中也是顯著上升的。然而，許多案例也揭示了明顯的不同，這就不允許以簡化的觀察方式將敗血癥和惡性腫瘤一般性地作為基本相似來處理。
在本申請中描述的發(fā)明是進一步研究方法的結(jié)果以用于測定蛋白，所述的蛋白因為它們在敗血癥患者或可能在患有其它嚴重疾病，特別是炎癥疾病或腫瘤的患者中可測的量與健康的人相比有顯著變化，有可能適合作為用于診斷目的的生物標記。為了這一目的，將敗血癥患者與明顯健康的正常人的血清和血漿級分的HPLC圖譜進行比較，并對HPLC色譜圖譜的顯著變化進行進一步的檢測。這些研究提供了成為本發(fā)明的基礎(chǔ)的結(jié)果，即當預先將這些樣品在能與樣品中的疏水性或親脂性成分相互作用并能選擇性結(jié)合這種成份(疏水性相互作用層析)的層析材料的柱上分離，患者的血清或血漿樣品中HPLC洗脫圖譜的明顯變化是可檢測的。如果隨后將與層析材料結(jié)合的經(jīng)分離的樣品的組分以合適的方式洗脫，可獲得初始血清或血漿樣品的次級級分，其中成分特別能夠與疏水性表面相互作用的蛋白質(zhì)性質(zhì)的成分得以選擇性富集。應用于脂蛋白的這種方法的變體在(19)中有描述。
使用高效液相色譜(HPLC)分離患有敗血癥和其它疾病的患者的血漿或血清的這些級分提供了作為本發(fā)明基礎(chǔ)的令人驚訝的認識，在健康的正常人的血清或血漿中處于顯著水平的組分在敗血癥患者和某種其它患者的血清中減少很多或看上去完全不存在。對這種組分的特性的進一步研究表明，明顯減少的組分是載脂蛋白C-I，該研究在后面有更詳細的描述。后來的進一步研究，該研究也在下面有更詳細地描述，隨后得到了更令人驚訝的結(jié)果，在最初的前序評價中指出在敗血癥和腫瘤患者中平行變化的檢驗結(jié)果在實際上是明顯相互區(qū)分的，并且使得能通過測定人患者的血清或血漿中的載脂蛋白C-I而清楚地區(qū)分敗血癥和腫瘤，這一認識可用于診斷目的。
本發(fā)明的一項任務是發(fā)現(xiàn)一種新穎的適合用于診斷檢測的蛋白生物標記并使其可用于診斷目的，其在人血清或血漿中存在的量與在看上去健康的正常人中發(fā)現(xiàn)的量明顯不同并因此其測定構(gòu)成了一種有價值的診斷輔助手段。
該任務是通過如權(quán)利要求1中所述的方法達到。
優(yōu)選的實施方案，特別是關(guān)于在敗血癥患者、腫瘤患者和患有其它疾病的患者中的診斷應用在附屬權(quán)利要求書中給出。
在本申請或權(quán)利要求中，除了載脂蛋白C-I，還指“其衍生物”作為待測定的種類，由此應該理解為特別是片段和聚合體，特別是在各個選擇的檢測方法中如同游離蛋白載脂蛋白C-I的那些衍生物。所述“衍生物”可以例如是缺少個別氨基酸或氨基酸序列的載脂蛋白C-I分子或例如通過聚合在空間上或結(jié)構(gòu)上經(jīng)改變的完整載脂蛋白C-I分子。
使得能使用載脂蛋白C-I作為生物標記的新發(fā)現(xiàn)說明，在患有相關(guān)疾病的患者中，與看上去健康的正常人相比其可測量的載脂蛋白C-I的量減少了很多。以此可以做出結(jié)論，在上述的疾病的情況中載脂蛋白C-I形成的量不足，被消耗和/或不正常結(jié)合，與健康人相比以載脂蛋白C-I缺乏進行判斷。
根據(jù)進一步方面，本發(fā)明因此也涉及將載脂蛋白C-I用作治療劑來治療與疾病相關(guān)的載脂蛋白C-I不足的狀況或用于制備治療疾病的藥物，上述的疾病在診斷水平上自身表現(xiàn)為可測量的載脂蛋白C-I量明顯減少。
本發(fā)明的這些方面形成了權(quán)利要求10的主題。
在簡介和用來參考的權(quán)利要求中反映的事實和待保護的指導在下文中通過實驗數(shù)據(jù)和附屬圖形的參考進行了詳細地解釋，對用于本描述中的個別術(shù)語的含意進行了補充說明。因此下列實施例用于對專利的權(quán)利要求書的說明和對目前所作的一般實施的更精確的說明。
在圖中

圖1顯示已經(jīng)用(a)看上去健康的正常人、(b)患有惡性腫瘤疾病的患者和(c)敗血癥患者的血清或血漿上樣的辛烷基瓊脂糖凝膠層析柱，在用磷酸鹽緩沖液(PBS)對經(jīng)上樣的柱進行其間啟動的洗滌后，用乙酸(50mM)可洗脫的血清和血漿級分的反相C18HPLC的洗脫曲線。
圖2顯示看上去健康的正常人和患有不同疾病(敗血癥、腫瘤、心肌梗塞、心絞痛、動脈阻塞性疾病、克羅恩氏病、突眼性甲狀腺腫、自體免疫性甲狀腺炎、糖尿病I型、糖尿病II型、類風濕性關(guān)節(jié)炎、老年性癡呆癥、HIV陽性血清，每一病例進行獨立地臨床確認診斷)的患者樣品中可洗脫的載脂蛋白C-I相對量，該量通過對圖1中顯示的類型的HPLC洗脫曲線的譜峰積分獲得。
圖3顯示用兩種親和純化多克隆載脂蛋白C-I抗體操作的夾心免疫檢測法的標準曲線，其通過用合成的載脂蛋白C-I作為標準而獲得。
圖4顯示使用載脂蛋白C-I夾心免疫檢測法對看上去健康的正常人、敗血癥患者和腫瘤患者的血清或血漿中的載脂蛋白C-I直接測定的結(jié)果，其典型的校準曲線在圖3中顯示；并且圖5顯示已經(jīng)用辛基瓊脂糖凝膠處理各個樣品后，進行重復測定的結(jié)果，其結(jié)果在圖4中顯示。
實施的試驗及獲得的結(jié)果的描述A.色譜研究1.獲得含有結(jié)合至疏水表面并能從上洗脫的人血清/血漿的組分的血清或血漿級分每一實驗中，將看上去健康的正常人和患有許多獨立地臨床上經(jīng)診斷的疾病的患者的0.5ml血清/血漿樣品與0.5ml辛基瓊脂糖凝膠層析材料(來源Pharmacia公司；0.25ml包裝的材料，在PBS中洗滌)在PBS中混合，于室溫孵育10分鐘并輕微搖晃。其后，將混合物填入聚丙烯柱(直徑為5mm)，通過用20ml PBS洗滌將未結(jié)合的物質(zhì)從與辛基瓊脂糖凝膠材料結(jié)合的物質(zhì)中分離出來。
通過用50mM乙酸(pH 2.5)的洗脫將結(jié)合至辛基瓊脂糖凝膠材料的物質(zhì)(蛋白質(zhì))解吸附。
2.反相C18HPLC在每一情況下將從辛基瓊脂糖凝膠柱獲得的乙酸洗脫液直接通過在μBondapak C18柱(3.9×300mm，Millipore、Waters)上的反相C18 HPLC分析。
將由流動相A(95體積的水，5體積的乙腈，0.1體積的三氟乙酸的混合物)和流動相B(10體積的水，90體積的乙腈，0.1體積的三氟乙酸)形成的梯度用于HPLC層析。
對HPLC柱上載乙酸洗脫液后，以下面的流動相A/流動相B形成的梯度進行分析t＝0-5分鐘從100/0(A/B)至65/35(A/B)t＝5-20分鐘從65/35(A/B)至40/60(A/B)t＝20-22分鐘從40/60(A/B)至0/100(A/B)流速為1ml/分鐘。在214nm連續(xù)地測量柱的洗脫物的吸收值。
圖1顯示樣品的級分的三種典型洗脫曲線，所述樣品來自看上去健康的正?；颊?a)、患有不同腫瘤疾病的患者(b)和患有敗血癥的患者(c)。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)上述人群的HPLC洗脫曲線彼此之間相當?shù)厍蚁到y(tǒng)地不同。對本申請關(guān)鍵的洗脫帶是在17.05分鐘時洗脫的帶。
對所研究的所有血清和血漿通過譜峰積分的方式相對地量化這些洗脫帶，并且對大量對照和患者樣品，以這種方式測定的物質(zhì)的相對量在圖2中以圖形顯示。特定地，研究了下面的樣品
來自腫瘤患者的42件樣品(9×腸癌、7×支氣管癌、13×乳癌、8×卵巢癌、5×胰腺癌)、來自敗血癥患者的22件樣品、來自心肌梗塞患者(Hi)的7件樣品、來自心絞痛患者(APe)的4件樣品、來自動脈阻塞性疾病(AVK)的5件樣品、來自克羅恩氏病(MC)患者的6件樣品、來自突眼性甲狀腺腫患者的11件樣品、來自自體免疫性甲狀腺炎(AIT)患者的4件樣品、來自糖尿病I型(D-型1)患者的10件樣品、來自糖尿病II型(D-型II)患者的6件樣品、來自類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的3件樣品、來自老年性癡呆癥(AD)患者的2件樣品和來自HIV陽性血清患者的6件樣品。
由圖2直接看出，對于健康的正常人的樣品，發(fā)現(xiàn)對應于在17.05分鐘測量的峰的物質(zhì)明顯地是正值。在來自患有疾病的那些患者的樣品中，非常特別顯著的是在來自敗血癥患者、腫瘤患者、患有明顯/急性的心臟疾病(Hi、APe、AVK)的患者和患有克羅恩氏病的患者的樣品中，測定出同一物質(zhì)的高度顯著減少的份額。對于患有糖尿病I型和糖尿病II型的患者，雖然沒有減少到同樣的程度，但與健康的人相比也測定出明顯減少的值。對于患有突眼性甲狀腺腫、自體免疫性甲狀腺炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、老年性癡呆癥的患者和HI V陽性血清患者，相應的濃度偏差較小或在統(tǒng)計上不顯著。
獲得的獨立樣品組的所測定的相應量的平均值總結(jié)于下面的表格中
3.用于樣品定性的洗脫帶的鑒定(在17.5分鐘時洗脫的帶)為了進行鑒定，將對應于該洗脫帶的洗脫物質(zhì)收集、干燥(speedvac)并將其進行肽分析。在對N-端的序列分析中測定了序列TPDVS。通過質(zhì)譜法(ESI MS)測定的分子量為6630±15D。這些結(jié)果明顯與人載脂蛋白C-I的已知數(shù)據(jù)(參見例如(3))相關(guān)，所述人載脂蛋白C-I具有根據(jù)SEQ ID No.1(也參見SWISS PROT Accession No.3660227)的肽序列并且其理論分子量為6627D。
在胰蛋白酶消化這種物質(zhì)并隨后進行質(zhì)譜分析(ESI MS；“胰蛋白酶-酶解圖譜法”)后，完全證實了所述歸類。
在本申請的上下文中，可通過所描述的層析方法測定的載脂蛋白C-I也指的是“游離載脂蛋白C-I”。它具有從血清或血漿(PBS稀釋液中)樣品結(jié)合至疏水性分子結(jié)構(gòu)如疏水性辛基瓊脂糖凝膠層析材料的辛基基團上的性質(zhì)，在典型的蛋白洗脫條件下，特別是用稀釋的乙酸可以將其從所述的疏水分子結(jié)構(gòu)上洗脫。然而，術(shù)語“游離載脂蛋白C-I”的使用并不一定表示通過疏水性相互作用層析法分離的物質(zhì)必須在初始的樣品中以完全游離的形式存在。在本發(fā)明中使用該術(shù)語的上下文中，在實驗條件下與辛基瓊脂糖凝膠接觸而載脂蛋白C-I在層析材料上的結(jié)合被裂解的締合物或聚集物，還有具有脂質(zhì)的締合物或聚合物，也可認為是“游離載脂蛋白C-I”。
因而這種“疏水性分子結(jié)構(gòu)”也可以是疏水性層析材料表面的部分。然而它們可能也是具有疏水結(jié)構(gòu)區(qū)的獨立的分子，其可通過這種分子與載脂蛋白C-I的鍵結(jié)進行，例如具有可進行標記并例如可在同源檢測法中用來標記樣品液體中的載脂蛋白C-I的疏水性結(jié)構(gòu)的分子。當樣品中的載脂蛋白C-I的可用于這種結(jié)合的區(qū)域沒有被其它物質(zhì)如脂蛋白中的脂質(zhì)阻斷時，就表現(xiàn)出這種結(jié)合至“疏水性分子結(jié)構(gòu)”的能力。即使當，例如，提及測定了結(jié)合至辛基瓊脂糖凝膠上的載脂蛋白C-I的那些部分，這并不表示在測定中真正需要利用與辛基瓊脂糖凝膠的結(jié)合。更確切地，這種揭示應該理解為待檢測的物質(zhì)的一種性質(zhì)，即使這種性質(zhì)由完全不同的方法測定。例如，相應的載脂蛋白C-I可能與通過免疫檢測法所測定的是相同的，所述方法如下面描述。
B.血清/血漿中的載脂蛋白C-I的直接免疫診斷的測定。
1.載脂蛋白C-I的免疫檢測法為了對血清中的載脂蛋白C-I進行直接免疫診斷測定，以下面描述的部分建立了夾心型免疫測定a)經(jīng)包被的管將聚苯乙烯小管(Greiner)用商購可得的對抗載脂蛋白C-I的多克隆親和純化抗體(來源Acris Antibody，BadNeuheim，德國)包被。根據(jù)用戶手冊，該抗體通過用人Apo C-I免疫家兔而獲得并用人載脂蛋白C-I在瓊脂糖凝膠親和柱上純化。為了包被，將300μl PBS中的0.2μg抗體結(jié)合至已經(jīng)用綿羊抗-兔I gG抗體(Sigma)包被的聚苯乙烯小管(Greiner，德國)。于室溫在18小時后完成所述結(jié)合。隨后用PBS中3ml的0.5％牛血清白蛋白(BSA)將小管洗滌兩次。將它們在真空中干燥后，將該小管用作載脂蛋白C-I免疫檢測的固相。
b)丫啶酯標記的抗體將100μl PBS中100μg另一種抗人載脂蛋白C-I的抗體(來自家兔；來源Academie Bio-Medical Company，Texas，美國)與10μg丫啶-NHS-酯(在10μl乙腈中)起反應。于室溫孵育10分鐘后，通過在SW 300(Waters)上用HPLC分離反應混合物的未反應的組分進行經(jīng)標記的抗體的純化。為將其用于免疫檢測，將含有0.5％BSA和1mg/ml兔IgG的PBS中的經(jīng)標記抗體調(diào)整為約1百萬RLU/300μl(RLU＝相對光單位)用以飽和小管壁。
2.對血清或血漿樣品中的載脂蛋白C-I實施免疫診斷檢測用PBS、0.5％BSA以1∶10000將血清或血漿樣品稀釋。在每一實驗中將其300μl吸移至上述的用固定化抗體包被的小管中并隨后于室溫搖晃(Heidolph旋轉(zhuǎn)搖晃器上300轉(zhuǎn)/分鐘)孵育4小時。用PBS(用各1ml PBS充滿并倒出四次)將小管內(nèi)容物洗出，將結(jié)合至小管壁上的載脂蛋白C-I與每小管300μl的丫啶酯標記的抗-載脂蛋白C-I抗體在室溫下、300轉(zhuǎn)/分鐘反應20小時。其后，用各1ml的PBS洗滌5次移除未結(jié)合的標記抗體，并以已知的方式在Berthold 952T照度計測量剩余的化學發(fā)光。
將合成的載脂蛋白C-I用于校準檢測法。獲得的用于上述檢測法的典型的標準曲線圖在圖3中顯示。
3.結(jié)果借助于所描述的夾心型的免疫檢測法，檢測也用于色譜研究的看上去健康的正常人的對照血清，以及檢測敗血癥及腫瘤樣品。對來自敗血癥患者的樣品的測定基本上證實了HPLC研究的結(jié)果，從中獲得了與正常人相比顯著減少的載脂蛋白C-I測量值。在測定來自腫瘤患者的樣品中，在色譜研究中測得同樣減少的濃度，然而，所獲得的測量值有增加的趨勢。結(jié)果在圖4中用圖表示。
為了核實關(guān)于一方面在色譜測定中和另一方面在免疫診斷測定中對腫瘤患者的不同結(jié)果是否歸因于前述的使用疏水性相互作用層析中的選擇步驟的問題，在進一步測定在免疫測定中的樣品之前，用辛基瓊脂糖凝膠處理以結(jié)合載脂蛋白C-I的“游離”部分。
4.用辛基瓊脂糖凝膠處理樣品將如免疫測定中描述的已經(jīng)測定的相同的150μl血清或血漿樣品與200μl辛基瓊脂糖凝膠(Pharmacia，50μl PBS中的凝膠)混合并于室溫輕微搖晃地孵育一小時，之后用離心法(15分鐘2000G)將其上結(jié)合有載脂蛋白C-I部分的辛基瓊脂糖凝膠分離。將所獲得的上清液以1∶5000稀釋于PBS/0.5％BSA中并隨后如上描述在免疫檢測法中測定。
獲得的結(jié)果在圖5中顯示。顯然，作為用辛基瓊脂糖凝膠處理的結(jié)果，用上述的夾心型免疫檢測法的測量中可測定的所有“游離”載脂蛋白C-I已經(jīng)與辛基瓊脂糖結(jié)合，所以在上清液中不再能檢測到載脂蛋白C-I。對經(jīng)處理的敗血癥樣品做了類似的觀測，在所述的觀測中，通過用辛基瓊脂糖凝膠處理將大部分可測定的與正常樣品相比已經(jīng)減少了很多的載脂蛋白C-I移除。
令人驚訝地是，然而用辛基瓊脂糖凝膠處理不能將在描述過的類型的免疫檢測法中可測定的載脂蛋白C-I從腫瘤患者的樣品中移除。
C.討論所述的發(fā)現(xiàn)表明至少大部分的腫瘤患者的血清或血漿中的載脂蛋白C-I以一種形式存在，所述的形式中載脂蛋白C-I喪失了結(jié)合至疏水表面的能力，但仍然能在免疫檢測法中以免疫反應性被測到。對這些觀察到的結(jié)果可能的解釋是，在載脂蛋白C-I存在于腫瘤患者的血清中的情況下，可用于疏水性相互作用的分子區(qū)域被飽和了或受到阻斷，并且不能被結(jié)合配對體從辛基瓊脂糖凝膠擠走。這些結(jié)合配對體的性質(zhì)至今未知。然而，不能排除它們是腫瘤特異性物質(zhì)，所述這種物質(zhì)作為或基于對例如載脂蛋白C-I的疏水性結(jié)合配對體的鈍化，對腫瘤發(fā)展起重要作用，例如通過對自然免疫反應的不利影響或通過積極促使腫瘤生長。雖然在用免疫診斷方法研究的樣品中沒有觀察到載脂蛋白C-I部分的顯著減少，但平行的層析研究表明這不是上述意義中的“游離”，而是以另一種具有降低的與疏水性結(jié)合配對體的結(jié)合能力的形式存在?！坝坞x”，即結(jié)合至疏水性結(jié)合配對體上的載脂蛋白C-I如在其它疾病如敗血癥中的情況，相反在腫瘤患者的血清中下降。
基于所述的發(fā)現(xiàn)，可以猜測通過外源供給載脂蛋白C-I來補償在“游離”脂蛋白C-I的份額減少的意義上的被破壞的平衡對于腫瘤患者是有利的，并由此例如通過用外源的載脂蛋白C-I飽和腫瘤典型的結(jié)合配對體和提供額外的游離載脂蛋白C-I而對病理過程產(chǎn)生積極影響。
類似地觀點，即用于補償“游離”載脂蛋白C-I的被破壞的水平的載脂蛋白C-I的外源供給是有利的，也可應用于其它疾病例如敗血癥的情況中。在敗血癥病例中如果載脂蛋白C-I的產(chǎn)生被破壞，外源性供給能補償由此導致的不足。如果在敗血癥患者的血清/血漿中“游離”載脂蛋白C-I的減少歸因于通過結(jié)合至病理組織結(jié)構(gòu)或可能地不可溶性細菌結(jié)構(gòu)使得載脂蛋白C-I從循環(huán)中去除，則載脂蛋白C-I的外源供給能補償所導致的不足或使病理組織中或細菌結(jié)構(gòu)上的結(jié)合位點的飽和。通過監(jiān)控由于外源供應而增加的游離載脂蛋白的濃度或受治患者血液樣品中載脂蛋白的免疫反應性可以測定，每種情況下所需的量可以以簡單的方式監(jiān)控。
因此本發(fā)明也使得能將載脂蛋白C-I或其合適的衍生物、或模擬其生理行為的化合物具有新穎的治療用途，其用于治療腫瘤、敗血癥以及其它與相對于健康人可觀察到的游離載脂蛋白C-I的減少有關(guān)的疾病。
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<141>
<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>57<212>PRT<213>智人<400>1Thr Pro Asp Val Ser Ser Ala Leu Asp Lys Leu Lys Glu Phe Gly Asn1 5 10 15Thr Leu Glu Asp Lys Ala Arg Glu Leu Ile Ser Arg Ile Lys Gln Ser20 25 30Glu Leu Ser Ala Lys Met Arg Glu Trp Phe Ser Glu Thr Phe Gln Lys35 40 45Val Lys Glu Lys Leu Lys Ile Asp Ser50 5權(quán)利要求
1.用于疾病診斷、早期檢測、風險評估和進程監(jiān)控的方法，其特征在于，在人患者的血清或血漿中測定載脂蛋白C-I和/或它的衍生物的含量，并且基于明顯偏離于健康正常人的測定值范圍的測定結(jié)果而確定疾病的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定所有存在于樣品中的具有結(jié)合疏水性分子結(jié)構(gòu)(“游離載脂蛋白C-I”)能力的載脂蛋白C-I級分。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定所有存在于樣品中的通過夾心型免疫檢測法(“載脂蛋白C-I免疫反應性”)在樣品中可直接測定的載脂蛋白C-I級分。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，實施所述的方法用于疾病的診斷、早期檢測、風險評估和進程監(jiān)控，上述的疾病選自腫瘤、敗血癥、急性心臟疾病、糖尿病、突眼性甲狀腺腫和克羅恩氏病。
5.如權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，實施所述的方法用于敗血癥的診斷、早期檢測、風險評估和進程監(jiān)控，并將患者的血清或血漿樣品中結(jié)合至疏水性分子結(jié)構(gòu)的載脂蛋白C-I(“游離載脂蛋白C-I”)的相對于健康的正常人顯著降低的比例，和/或下降的載脂蛋白C-I免疫反應性與敗血癥狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
6.如權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，實施所述的方法用于腫瘤的診斷、早期檢測、風險評估和進程監(jiān)控，并將患者的血清或血漿樣品中結(jié)合至疏水性分子結(jié)構(gòu)的載脂蛋白C-I(“游離載脂蛋白C-I”)的相對于健康的正常人顯著降低的比例，以及升高的載脂蛋白C-I免疫反應性與腫瘤疾病相關(guān)聯(lián)。
7.如權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于，當患者的血清或血漿樣品中發(fā)現(xiàn)升高的載脂蛋白C-I免疫反應性時，通過額外的對照檢測檢查該測量值，在所述的對照檢測中，實施檢查以測定樣品中可檢測免疫反應性的值是否由于用具有疏水表面的吸附劑處理樣品而明顯地改變，當該值沒有偏離或沒有顯著偏離初始測定值時，腫瘤疾病的存在得以高可能性的確定。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其特征在于，將結(jié)合至疏水性分子結(jié)構(gòu)上的載脂蛋白C-I(“游離載脂蛋白C-I”)通過使血清或血漿樣品進行疏水性相互作用層析而得以測定，其中載脂蛋白C-I與層析材料結(jié)合，并隨后測定洗脫蛋白級分中的載脂蛋白C-I。
9.如權(quán)利要求8中所述的方法，其特征在于，將辛基瓊脂糖凝膠用作層析材料，通過洗滌層析材料將未結(jié)合的樣品組分移除，所結(jié)合的蛋白質(zhì)用稀釋的酸特別是乙酸洗脫，并且隨后通過HPLC和/或免疫診斷法測定洗脫液中的載脂蛋白C-I的量。
10.載脂蛋白C-I在用于制備經(jīng)注射施用的藥物中的用途，其中所述的藥物用于治療處理敗血癥或腫瘤疾病。
全文摘要
用于疾病的診斷、早期檢測、風險評估和進程控制的方法，在所述的方法中測定來自人患者血清或血漿樣品中的載脂蛋白C－I和/或它的衍生物的量并基于顯著偏離的健康的正常人測得的值的范圍的結(jié)果而對疾病特別是腫瘤疾病或敗血癥的存在做出結(jié)論。本發(fā)明也涉及載脂蛋白C－I在治療和預防疾病中的用途，其中疾病患者的血液中的載脂蛋白C－I的量或結(jié)合能力與正常人有明顯不同。
文檔編號G01N33/92GK1856707SQ200480027413
公開日2006年11月1日 申請日期2004年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者A·伯格曼 申請人:B.R.A.H.M.S.股份公司