本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體地指一種黃顙魚β防御素基因及其β防御素抗菌肽及其應用。
背景技術：
黃顙魚是我國重要的中小型淡水經濟魚類，因其無肌間刺、肉味鮮美、營養(yǎng)豐富而受到廣大消費者的青睞，近年來成為我國水產養(yǎng)殖業(yè)中重要的名優(yōu)養(yǎng)殖魚類。2015年，我國黃顙魚總產量達到355,725噸，在我國所有淡水魚類產量中位居第十三位。隨著市場需求量的不斷增加，當前黃顙魚的養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，然而大規(guī)模、高密度的養(yǎng)殖，必然造成養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，養(yǎng)殖池塘中各種細菌性疾病頻繁發(fā)生。尤其是黃顙魚的紅頭病、腹水病、腐皮綜合癥等細菌性疾病以及小瓜蟲感染等寄生蟲病愈演愈烈，導致黃顙魚產量降低，給黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重經濟損失，制約了黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。在黃顙魚等水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病防治方面，目前許多養(yǎng)殖戶仍然使用抗生素來抑制其蔓延，但長久盲目的大量使用抗生素類藥物，會導致細菌耐藥性的出現，甚至是“超級細菌”的產生，給魚病的防治帶來嚴重的影響。隨著人們對水產品質量和安全問題越來越關注，如何開展綠色健康水產養(yǎng)殖，生產出優(yōu)質、安全的水產品已成為水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展方向。由于抗生素的過量使用及其它藥物殘留問題是威脅水產品質量安全的主要因素，尋找替代抗生素類的無殘留的綠色藥物并應用于黃顙魚等水產養(yǎng)殖動物的病害防治已成為水產科學研究的熱點。
魚類的免疫系統(tǒng)分為非特異性免疫和特異性免疫兩種。非特異性免疫是機體抵抗病原體感染的第一道防線，這種免疫是與生俱來的，受遺傳基因控制，并具有相對穩(wěn)定性。魚類作為低等脊椎動物，其特異性免疫系統(tǒng)和免疫反應發(fā)展不夠完善，相對于高等脊椎動物而言都比較原始。因此，在魚類受到細菌等外界病原體入侵時，非特異性免疫往往較特異性免疫發(fā)揮更大的作用。非特異性免疫包括由血細胞引起的細胞免疫和體內抗菌肽等組成的體液免疫來執(zhí)行對外界病原微生物的免疫防御。而黏膜免疫又是魚類先天性免疫的第一道防線，其重要地位不言而喻，黏膜系統(tǒng)主要是在對抗病原體的時候依靠機體分泌一系列的抗菌物質來抵御病原菌的入侵，其中發(fā)揮重要作用的一類抗菌物質則是抗菌肽。
抗菌肽類是一種機體分泌的小分子類多肽，其廣泛存在于各種生物體中，它們在結構和功能上十分相似，分子量一般都少于100個氨基酸，通常帶正電荷，它們既參與非特異性免疫過程，又介導機體的特異性免疫反應。研究表明，抗菌肽顯示出廣譜抗菌活性，能夠有效的抑制和殺滅細菌、真菌、病毒以及一些原生動物。它與傳統(tǒng)的抗生素有著不同的作用機制，導致細菌不易對它產生耐藥性，因此，研究抗菌肽類物質在魚類病害防治中的作用具有十分重要的意義。防御素作為抗菌肽大家族中的重要成員，被認為是抗菌肽進化的起源，了解防御素的結構和功能，研究其在魚類機體非特異性免疫系統(tǒng)，尤其是在黏膜免疫中的作用具有十分重大的意義，將為水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展奠定重要的基礎。
β防御素成熟肽是抗菌肽家族的重要成員之一，一般由個36～42個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸組成的保守區(qū)域。分子間二硫鍵的連接方式是c1-c5、c2-c4、c3-c6，這些二硫鍵形成了2對反向平行的β折疊片層和一個α螺旋，這些片層結構緊密，不容易被蛋白酶水解，從而表現出穩(wěn)定活性。近年來，關于魚類β防御素的研究較少，將研究成果應用于養(yǎng)殖生產實踐的更是少之又少。如對草魚的腸道β防御素的研究，雖然發(fā)現其對多種革蘭氏陰性、陽性菌有抑菌作用，但僅僅作了籠統(tǒng)的描述，并沒有深入研究該β防御素的不同濃度重組蛋白對不同細菌的抑菌差異性。對其它少數魚類β防御素的研究也不深入，缺乏足夠、可靠的重組蛋白抑菌實驗和抑菌效果統(tǒng)計數據是目前影響魚類β防御素抑菌效果評價并應用于魚類病害防控實踐的問題所在。由于不同魚類的β防御素序列存在差異性，必定導致其重組蛋白抑菌效果的不同。而黃顙魚是一種無鱗魚類，從進化角度分析，其先天性免疫能力比有鱗魚類強，推測其β防御素的抑菌效果要更好。因此，對黃顙魚β防御素基因及其重組蛋白的抑菌效果進行深入的研究，并將β防御素應用于魚類病害防治中十分必要。所以在此基礎上，研發(fā)、篩選效果優(yōu)良的抗菌肽藥品取代抗生素已成為未來魚類病害防控的必然發(fā)展趨勢。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是一種黃顙魚β防御素基因及其β防御素抗菌肽及其應用，本發(fā)明在克隆黃顙魚β防御素基因核心區(qū)編碼序列的基礎上，利用基因工程技術進行重組表達制備而成的，實驗表明其重組產物對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌，以及革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌、柱狀黃桿菌都具有一定的生長抑制作用。。
為實現上述目的，本發(fā)明提供的一種黃顙魚β防御素基因，所述黃顙魚β防御素基因pf_βd的orf核苷酸序列如seqidno.1所示。
本發(fā)明還提供了一種具有抑菌活性的β防御素抗菌肽，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
進一步地，所述β防御素抗菌肽的功能區(qū)含有6個相對保守的半胱氨酸殘基。
本發(fā)明還提供了一種重組表達載體pet-32a-pf_βd，含有權利要求1所述pf_βd的orf片段成熟區(qū)的大腸桿菌表達載體。其中，所述大腸桿菌表達載體為pet-32a。
含有上述重組表達載體pet-32a-pf_βd的重組大腸桿菌bl21(de3)-pet-32a-pf_βd。
上述重組大腸桿菌bl21(de3)-pet-32a-pf_βd的制備方法，包括以下步驟：
1)根據原核表達質粒pet-32a上的酶切位點的特征，以黃顙魚β防御素基因pf_βd的orf片段成熟區(qū)核苷酸序列為模板，設計含有bamhi和ecori酶切位點的特異性引物pf_βd-f2/r2：
pf_βd-f2：cgcggatccgctaaaggaaatgcaatggc
pf_βd-r2：ccggaattctcagagaataacgtgagacacac
2)以前期獲得的黃顙魚pf_βd的orf片段cdna為模板進行pcr，得到pcr產物；
3)用bamhi和ecori將pcr產物進行酶切，純化回收；同時，用bamhi和ecori將大腸桿菌表達載體pet-32a進行雙酶切，酶切產物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收大腸桿菌表達載體pet-32a大片段；
4)將回收的大腸桿菌表達載體pet-32a大片段和回收的pcr產物用t4連接酶4℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21(de3)，將篩選得到的陽性克隆用bamhi和ecori進行酶切驗證，獲得得到重組大腸桿菌bl21(de3)-pet-32a-pf_βd。
作為優(yōu)選方案，所述步驟2)中，pcr反應體系：
pcr反應體系
pcr反應條件：95℃預變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；16℃，5min。
利用上述重組大腸桿菌bl21(de3)-pet-32a-pf_βd提取具有抑菌活性的β防御素抗菌肽的方法，包括以下步驟：
1)將重組大腸桿菌bl21(de3)-pet-32a-pf_βd加入到490ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)基中，然后加入iptg進行誘導培養(yǎng)，離心收集沉淀、震蕩超聲破碎離心得到上清液；
2)將所得上清經濾膜進行過濾，向濾液中加入終濃度為0.1mm的pmsf以備過柱，收集所有的穿透液和洗脫液，即為含有β防御素抗菌肽的溶液。
作為優(yōu)選方案，所述步驟2)中，濾液過柱的具體方法如下：
①取準備好的ni+-瓊脂糖凝膠柱固定于鐵架臺上，首先打開上蓋和下方開關，使其中的酒精保存液流出；
②用15倍柱體積的平衡液(50mmnah2po4,300mmnacl,10mmimidazole,ph8.0)平衡柱子，控制流速1ml/min；
③將過濾后的上清液加入柱中，控制流速1ml/min；
④用10倍柱體積的平衡液過柱，控制流速1ml/min，收集穿透液；
⑤用4倍柱體積的洗脫液1(50mmnah2po4,300mmnacl,20mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液1；
⑥用4倍柱體積的洗脫液2(50mmnah2po4,300mmnacl,50mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液2；
⑦用4倍柱體積的洗脫液3(50mmnah2po4,300mmnacl,80mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液3；
⑧用4倍柱體積的洗脫液4(50mmnah2po4,300mmnacl,100mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液4；
⑨用4倍柱體積的洗脫液5(50mmnah2po4,300mmnacl,200mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液5；
⑩用4倍柱體積的洗脫液6(50mmnah2po4,300mmnacl,250mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液6；
上述β防御素抗菌肽用于抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌、柱狀黃桿菌的生長的藥品中應用。
上述β防御素抗菌肽作為廣譜抗菌藥物在水產養(yǎng)殖中的應用。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明通過基因克隆、原核表達、特有的蛋白純化技術以及操作簡單的體外抑菌活性鑒定方法，展示了黃顙魚β防御素抗菌肽具有良好的體外廣譜抑菌活性作用，這不僅有助于揭示β防御素抗菌肽在魚類固有免疫中的作用途徑和機制，而且對后期的廣譜抗菌藥物開發(fā)和免疫增強劑的篩選奠定了有力的技術基礎。
附圖說明
圖1為黃顙魚β防御素基因開放閱讀框(orf)克隆序列圖，
圖中，劃線處為信號肽區(qū)，陰影部分為成熟肽區(qū)；
圖2為pcr擴增黃顙魚β防御素基因成熟肽(orf去除信號肽部分)片段電泳圖；
圖3為黃顙魚β防御素重組蛋白抑菌效果圖；
圖中，圖3a為大腸桿菌抑菌圖，圖3b為嗜水氣單胞菌抑菌圖，圖3c為金黃色葡萄球菌抑菌圖，圖3d為鮰愛德華氏菌抑菌圖，圖3e為柱狀黃桿菌抑菌圖；
圖4為不同濃度黃顙魚β防御素重組蛋白對5種細菌的抑菌效果折線圖。
具體實施方式
為了更好地解釋本發(fā)明，以下結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于以下實施例。
實施例1黃顙魚β防御素基因開放閱讀框(orf)片段的克隆。
1.黃顙魚β防御素基因開放閱讀框(orf)片段的克隆
根據本實驗室已有的部分黃顙魚轉錄組數據，檢索獲得黃顙魚β防御素基因的預測序列，用primer5.0設計用于擴增β防御素的orf區(qū)域的引物pf_βd-f1/r1：
pf_βd-f1：atgaagtatcaagggatgaccat
pf_βd-r1：tcagagaataacgtgagacacac
pcr反應體系如下表1-1：
表1-1pcr反應體系
pcr反應條件：95℃預變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；16℃，5min。反應結束后，20μlpcr產物加入4μl6×loadingbuffer混合均勻，用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，150v，30min。
2.pcr產物的回收
此過程按照axygen公司的凝膠回收試劑盒進行操作，具體如下：
(1)通過凝膠成像系統(tǒng)，將所獲得的含有目的片段的凝膠切下至2ml離心管中并稱重，默認為100mg＝100μl。
(2)加入3倍凝膠體積的bufferde-a，65℃加熱，每2min搖勻一下，直至無明顯膠狀物出現，整個過程大概10min。
(3)加入0.5倍bufferde-a體積的bufferde-b，混合均勻，當目的片段小于400bp時，需加入一個體積的異丙醇。
(4)將步驟(3)中的混合液轉移至dna制備管中，12000g離心1min，棄濾液。
(5)將制備管置入2ml離心管中，加入500μlbufferw1，12000g離心1min，棄濾液。
(6)將制備管置入2ml離心管中，加入700μlbufferw2，12000g離心1min，棄濾液。
(7)重復上述步驟(6)一次。
(8)將制備管置入2ml離心管中，12000g離心1min。
(9)將制備管置于1.5ml離心管中，加入20μl60℃加熱過的eluentwater，室溫靜置1min，12000g離心1min，所得dna保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
3.連接與轉化
此步驟按照連接試劑盒(takara)公司說明書進行操作，連接反應體系如下表1-2：
表1-2連接反應體系
反應條件：16℃連接2-3h，片段過長需過夜連接。
轉化步驟：
(1)將10μl連接產物加入到100μl大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞液中，冰上放置30min(此時打開水浴鍋42℃，注意水位)。
(2)然后放到42℃水浴鍋中熱激90s，再在冰上放置3min。
(3)加入890μllb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min。
(4)在每個固體培養(yǎng)平板上分別加入40μlx-gal和4μliptg，然后吸取100μl菌液，均勻涂布在含有amp的lb固體培養(yǎng)基平板上。
(5)將平板37℃培養(yǎng)箱正放30min，待表面菌液被吸干后，倒置平板，培養(yǎng)最多16h。
4.目的片段的菌落pcr及測序
菌落pcr及測序的步驟如下：
(1)在平板上挑取10-20個白色菌落，分別加入到1ml含有千分之一amp的lb液體培養(yǎng)基中。
(2)37℃震蕩培養(yǎng)4h。
(3)3000r/min離心3min，吸掉上層400μl上清液。
(4)短暫渦旋將沉淀打散，然后將菌液當成模板進行pcr擴增。
(5)電泳檢測，選擇目的條帶亮度大且無二聚體的菌液送公司測序。
實施例2黃顙魚β防御素基因核心編碼區(qū)(orf去除信號肽部分)的克隆及原核重組表達質粒的構建。
根據原核表達質粒pet-32a上的酶切位點的特征，專門設計一對分別添加了bamhi和ecori酶切位點的特異性引物pf_βd-f2/r2：
pf_βd-f2：cgcggatccgctaaaggaaatgcaatggc
pf_βd-r2：ccggaattctcagagaataacgtgagacacac
引物序列的劃線處分別為bamhi和ecori酶切位點，酶切位點5’端的粗體部分(cgc和ccg)為保護性堿基。使用pcr擴增技術，以實驗一中克隆得到的orf片段為cdna模板，反應程序為(首先，95℃預變性5分鐘；接著，95℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；最后，72℃延伸10分鐘)；將克隆得到的目的條帶切膠回收后與pmd-18t載體連接2.5小時；后將連接產物轉化至大腸桿菌dh5α；涂平板篩選單克隆進行測序，將測序結果正確的菌液隔夜培養(yǎng)，次日根據質粒提取試劑盒提取質粒；將所提取質粒用bamhi和ecori限制性內切酶做雙酶切，將雙酶切回收后的目的片段再與經bamhi和ecori雙酶切的pet-32a大片段進行連接，從而完成黃顙魚β防御素基因原核重組表達載體pet-32a-pf_βd的構建(pcr產物的回收，連接與轉化，目的片段的菌落pcr等具體步驟參考上述實施例1)。
實施例3：原核重組表達載體在大腸桿菌中誘導與表達。
將構建好的重組表達載體pet-32a-pf_βd導入到大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，涂平板挑陽性克隆接種于10ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，加等體積30％甘油-35℃保存?zhèn)溆谩?/p>
最佳誘導表達條件的摸索：
(1)不同時間誘導表達：取1ml備用菌加入到9mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到od600為0.6～0.8，然后取1ml菌液分裝到2ml制備管中，共7管，同時取相同條件下的pet-32a空質粒菌液1ml做對照，8管菌液都加入終濃度為1mm的iptg，37℃，200rpm培養(yǎng)?？召|粒菌液誘導4小時，重組表達質粒的菌液每隔1h取一管1ml進行sds-page上樣前樣品預處理，分別為1～7h誘導表達。(樣品處理方法：4℃，6000rpm離心，保留菌體沉淀，加入100μlpbs緩沖液渦旋震蕩，后取20μl加入等體積的2×sds蛋白上樣緩沖液，100℃水浴加熱15min，空載質粒菌液處理同上，后進行sds-page上樣檢測表達結果。)
(2)不同iptg濃度誘導表達：取0.2ml備用菌加入到9.8mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到od600為0.6～0.8，然后取1ml菌液分裝到2ml制備管中，共8管，然后依次加入終濃度分別為0mm，0.1mm，0.2mm，0.5mm，0.8mm，1.0mm，1.2mm，1.5mm的iptg，37℃，200rpm培養(yǎng)4h。然后進行上樣前的樣品預處理，方法同(1)，最后進行sds-page上樣檢測表達結果。
(3)重組蛋白的可溶性檢測：取2ml備用菌加入到98mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到od600為0.6～0.8，加入終濃度為0.2mm的iptg進行誘導培養(yǎng)6h，后4℃，6000rpm離心10min收集沉淀，加入10mlpbs緩沖液渦旋震蕩，加入終濃度為0.1mm的pmsf后進行超聲波細菌破碎30min，將破碎后的液體4℃，12000rpm離心15min，后分別取上清50μl，沉淀少許加入50μlpbs緩沖液，后各加入等體積2×sds上樣緩沖液，100℃水浴加熱15分鐘，最后進行sds-page上樣檢測表達結果。
最終確定最佳誘導時間為6h，最佳誘導的iptg濃度為0.2mm，重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。
實施例4：重組蛋白的分離與純化。
(1)重組蛋白的分離：取10ml備用菌加入到490ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，加終濃度為0.2mm的iptg繼續(xù)培養(yǎng)6h，后4℃，6000rpm離心10min收集沉淀，加入30mlpbs緩沖液渦旋震蕩，加入終濃度為0.1mm的pmsf后進行超聲波細菌破碎30min，將破碎后的液體4℃，12000rpm離心15min，保留上清去除沉淀，以備純化。
(2)重組蛋白的純化：本實驗蛋白純化方法是根據上海生工生物有限公司的ni+-瓊脂糖凝膠柱對帶有his標簽的蛋白進行純化，具體方法如下：將所得上清經0.22μm的濾膜進行過濾，向濾液中加入終濃度為0.1mm的pmsf以備過柱。純化采取不同濃度的咪唑洗脫液分階段洗脫的方式以便達到最佳純化效果。步驟如下：
①取準備好的ni+-瓊脂糖凝膠柱固定于鐵架臺上，首先打開上蓋和下方開關，使其中的酒精保存液流出；
②用15倍柱體積的平衡液(50mmnah2po4,300mmnacl,10mmimidazole,ph8.0)平衡柱子，控制流速1ml/min；
③將過濾后的上清液加入柱中，控制流速1ml/min；
④用10倍柱體積的平衡液過柱，控制流速1ml/min，收集穿透液；
⑤用4倍柱體積的洗脫液1(50mmnah2po4,300mmnacl,20mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液1；
⑥用4倍柱體積的洗脫液2(50mmnah2po4,300mmnacl,50mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液2；
⑦用4倍柱體積的洗脫液3(50mmnah2po4,300mmnacl,80mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液3；
⑧用4倍柱體積的洗脫液4(50mmnah2po4,300mmnacl,100mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液4；
⑨用4倍柱體積的洗脫液5(50mmnah2po4,300mmnacl,200mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液5；
⑩用4倍柱體積的洗脫液6(50mmnah2po4,300mmnacl,250mmimidazole，ph8.0)過柱洗脫，控制流速1ml/min，分管收集洗脫液6；
將所收集的穿透液及所有洗脫液均取20μl，進行上樣前的預處理，以便進行sds-page檢測。
最終成功分離出目的蛋白，過柱后的洗脫液1～7中的目的蛋白濃度最高為4500μg/ml，最低為300μg/ml。
實施例5：重組蛋白體外抑菌活性的鑒定。
(1)實驗菌體的培養(yǎng)與制備
將各種實驗菌過夜培養(yǎng)活化，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌37℃，200rpm培養(yǎng)，嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌、柱狀黃桿菌28℃，200rpm培養(yǎng)，次日按1:50稀釋繼續(xù)培養(yǎng)至od600為0.6。
(2)重組蛋白抑菌活性檢測
將純化得到的蛋白分別稀釋至4000μg/ml、2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml和50μg/ml備用。取直徑150mm的不加氨芐的lb固體培養(yǎng)基，將400μl上述各實驗菌分別涂平板，在平板上均勻加入滅菌的牛津杯，在其中分別加入4000μg/ml、2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml、50μg/ml濃度梯度的重組蛋白100μl，同時設置加等體積的滅菌雙蒸水和0.1m的amp作為對照組，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌37℃培養(yǎng)，嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌、柱狀黃桿菌28℃培養(yǎng)，12h后觀察、測定抑菌圈直徑大小并記錄。
通過觀察、測定抑菌圈直徑大小(表2)，得出結論，本實驗分離出的β防御素重組蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌、柱狀黃桿菌的生長均具有一定的抑制作用，對各個實驗菌的抑制作用根據重組蛋白濃度的變化而表現出不同的差異性。對金黃色葡萄球菌而言，當蛋白濃度達到500μg/ml時，重組蛋白的抑菌效果才開始顯現，當蛋白濃度達到2000μg/ml時，抑菌效果達到最高峰。對大腸桿菌而言，當蛋白濃度達到250μg/ml時，隨著蛋白濃度的升高，抑菌作用也逐漸加強。對嗜水氣單胞菌而言，最小抑菌蛋白濃度為100μg/ml，且抑菌效果在蛋白濃度達到1000μg/ml時達到最高峰。對鮰愛德華氏菌而言，500μg/ml是其最小的抑菌蛋白濃度，1000μg/ml時達到最高峰，隨后，隨著蛋白濃度的升高，抑菌作用有下降的趨勢。對柱狀黃桿菌而言，1000μg/ml的蛋白濃度才對其生長起到抑制作用，蛋白濃度為2000μg/ml時抑制作用最為明顯。
表2不同濃度重組蛋白對各實驗菌的抑菌效果(抑菌圈直徑大小)
注：每種細菌在每個濃度重組蛋白作用下的3個數據表示3次重復實驗。
其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護范圍。
<110>華中農業(yè)大學
<120>黃顙魚β防御素基因及其β防御素抗菌肽及其應用
<211>225bp
<212>dna
<213>黃顙魚β防御素基因
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<211>49aa
<212>prt
<213>β防御素抗菌肽
<400>2
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