本發(fā)明涉及一種多肽，特別涉及一種維生素D結(jié)合肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

維生素D是一種由長的碳?xì)滏溁虺憝h(huán)組成的脂溶性維生素，是類固醇衍生物。它促進正常骨骼的形成，增強小腸和腎臟對鈣、磷、鐵和鋅離子的吸收，并且能夠調(diào)節(jié)包括骨骼和心臟在內(nèi)的所有肌肉的健康、免疫反應(yīng)、血糖和體內(nèi)胰島素的水平。對于人類來說，與身體健康狀況密切相關(guān)的最重要的兩種維生素D的形式是維生素D2和維生素D3，又分別稱作麥角鈣化醇和膽鈣化醇^[1]。麥角鈣化醇和膽鈣化醇能夠從飲食和補充劑攝取^[1][2][3]，但很少的食物含有天然的鈣化醇和膽鈣化醇。事實上，無論成年人有多充足的營養(yǎng)，他們都不可能從飲食本身獲得足夠的維生素D。因此，維生素是在紫外線的照射下，通過皮膚的光化學(xué)作用合成的。維生素D3是在皮膚的基底層，7-脫氫膽固醇吸收紫外線的B光子，生成維生素D3的前體，隨后經(jīng)歷一個與溫度變化有關(guān)的三烯結(jié)構(gòu)的重排形成維生素D3、光甾醇和速固醇（Fig.1.1）^[4][5][6]。在2004年邁克爾指出，維生素D3的合成受季節(jié)、生活所在地的緯度、種族、年齡、皮膚色素的沉著和其他的因素。

維生素D對人的身體健康非常重要。維生素D激素性的作用包括監(jiān)管骨骼和肌肉的健康，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)胰島素和血糖，,調(diào)節(jié)鈣、磷分解代謝。所以，維生素D缺乏是威脅人類健康的一個重大問題。測量血清25羥基維生素D (25(OH)D) 的濃度是確定維生素D狀態(tài)最好的測試方法。體內(nèi)25(OH)D的水平分段如下^[14]：

維生素D不足：21-29 ng/mL (52.5-72.5 mmol/L)

維生素D缺乏：< 20 ng/mL (< 50 mmol/L)

雖然對維生素D不足的診斷并不總是必需的，但其在一定程度上反映人體的健康狀況。血清甲狀旁腺激素水平的測定可能有助于確立維生素D不足的診斷，如維生素D不足的患者往往有甲狀旁腺激素水平的升高，提示繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進。

維生素D缺乏已被證明幾乎在每一個重大疾病中發(fā)揮一定作用。這包括:骨質(zhì)疏松癥和骨量減少,17個類型的癌癥(包括乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌)、心臟病、高血壓、肥胖、代謝綜合征、糖尿病、自身免疫性疾病、多發(fā)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、黏液囊炎、痛風(fēng)、不孕和經(jīng)前綜合癥,帕金森氏癥、抑郁癥和季節(jié)性情緒失調(diào),阿爾茨海默氏癥、慢性疲勞綜合癥、纖維肌痛、慢性疼痛、牙周疾病,牛皮癬等。接下來詳細(xì)介紹維生素D缺乏與這些疾病發(fā)生的密切關(guān)系。

在骨骼系統(tǒng)中，骨骼、腸道和腎臟中存在很多維生素D的特異性受體，能夠發(fā)揮其骨骼生物效應(yīng)，促進鈣的吸收利用。1, 25 （OH）₂VD3調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素（PTH）和成纖維細(xì)胞生長因子23（FGF23）的分泌，對維持體內(nèi)正常骨礦平衡和骨的形成起重要的作用。如果成年人體內(nèi)VD缺乏，就會引起骨軟化癥，老年人維生素D缺乏就會發(fā)生骨質(zhì)疏松，而其發(fā)生在嬰幼兒體內(nèi)時，就會出現(xiàn)佝僂病。而且維生素D缺乏還會引起肌肉無力，增加骨折和跌倒的風(fēng)險等嚴(yán)重后果。

在免疫系統(tǒng)方面，1, 25 （OH）₂VD3可抑制淋巴細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的產(chǎn)生，延緩B淋巴細(xì)胞活化成漿細(xì)胞的過程，對自身免疫性疾病具有益處，還能誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá),殺傷病原微生物^[15]。VD水平降低時能增加自身免疫疾病的風(fēng)險，如1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥和克隆氏病^[16]。維生素D缺乏還能增加病毒性感染的風(fēng)險，包括艾滋病病毒（HIV）和流行性感冒^[17][18][19]，也是患結(jié)核病的一個危險因素^[20]。補充1, 25 （OH）₂VD3對這些疾病及炎癥性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和肺結(jié)核等具有預(yù)防或治療作用，還可以減少發(fā)生系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險。

在腫瘤方面，有生物活性的1, 25 （OH）₂VD3對大多數(shù)細(xì)胞具有抗增殖和促進分化作用，具有潛在的抗腫瘤活性。特別是1, 25 （OH）₂VD3刺激細(xì)胞周期抑制子p21和p27及細(xì)胞粘附分子E-鈣粘蛋白的表達(dá)，同時抑制β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。維生素D也可以抵抗細(xì)菌和病毒感染。體內(nèi)充足的維生素D營養(yǎng)狀況可以預(yù)防一系列的癌癥，如膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、淋巴瘤、胃癌等^[21]。但研究發(fā)現(xiàn)，服用維生素D補充劑對患癌癥的風(fēng)險沒有顯著影響^[22]。而一些研究已經(jīng)表明,維生素D3降低癌癥的死亡率,但關(guān)于這方面的數(shù)據(jù)的性質(zhì)被關(guān)注^[23]。

活性維生素D調(diào)節(jié)激素分泌，胰腺的β細(xì)胞內(nèi)存在VDR和調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣濃度的鈣結(jié)合蛋白-D28K，1,25(OH)₂VD與維生素D受體（VDR）結(jié)合可調(diào)節(jié)胰島素分泌。維生素D缺乏，能夠增加發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險。血清25（OH） VD可以作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腎移植，血清25（OH） D在腎移植中具有保護移植腎的功能^[24]。

在心血管疾病方面，維生素D缺乏人群冠心病、心力衰竭和周圍血管疾病的患病率顯著增加^[25] 。維生素D缺乏易引起呼吸道的感染，并且與哮喘的發(fā)生存在著相關(guān)性。在精神疾病方面，維生素D的缺乏可能增加抑郁癥、精神分裂癥，認(rèn)知障礙和孤獨癥譜系障礙等心理疾病的風(fēng)險；.也是慢性腎臟病發(fā)生的危險因素。妊娠期間VD缺乏與子癇前期、胰島素抵抗和妊娠期糖尿病相關(guān)。

維生素D在體內(nèi)的營養(yǎng)狀態(tài)，與臨床上多個系統(tǒng)、多種疾病的發(fā)生發(fā)展都有密切的關(guān)系，被稱為“疾病預(yù)防的明日之星”^[26]。但長期或大劑量的使用維生素D，能使血清25（OH） VD的濃度升高和高鈣血癥，臨床上表現(xiàn)出中毒癥狀。有研究者認(rèn)為，血清25（OH） VD>100ng/ml稱維生素D中毒。因此，維生素D在人體內(nèi)扮演著重要的角色，檢測體內(nèi)維生素D的水平也成為一種趨勢。

維生素D是有生物學(xué)上的惰性，其必須在體內(nèi)經(jīng)過兩次羥基化才能被激活具有生物活性。維生素D進入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)，與血液中的載體蛋白即維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合，然后運輸?shù)桨薪M織和儲存的位點，主要是脂肪和肌肉^[7]。當(dāng)維生素D運送到肝臟，它經(jīng)過C25位點的CYP27A1酶的羥化作用轉(zhuǎn)化成25羥基維生素D，又稱為骨化二醇（25OHD）。這是維生素D 在體內(nèi)的第一次代謝，6個六個細(xì)胞色素P450亞型(CYP27A1,CYP2R1、CYP2C11 CYP3A4,CYP2D25和CYP2J3)全部參與了維生素D3 25羥基化的活動^[8]。25羥基維生素D轉(zhuǎn)運出肝臟與維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運到腎臟在C1α位點的CYP27B1酶再次羥基化的作用下，最后轉(zhuǎn)變成具有生物活性的骨化三醇，即1α,25（OH）₂D。當(dāng)體內(nèi)1α,25（OH）₂D含量充足時，它在CYP24酶的作用下轉(zhuǎn)化成24,25(OH)₂D（Fig.1.2）。骨化三醇是腎臟中的活化形式，并且也能與維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合，被轉(zhuǎn)運到有維生素D受體表達(dá)的靶組織，主要有骨骼，小腸和甲狀旁腺，然后以基因組或者非基因組的形式發(fā)揮其作用。25羥基維生素D的濃度最高，最穩(wěn)定，半衰期最長（大于兩周），是維生素D在體內(nèi)的主要運輸形式。因此，血清25(OH)D水平是評價體內(nèi)的維生素D狀態(tài)的最有效的指標(biāo)^[9]。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種維生素D結(jié)合肽及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種維生素D結(jié)合肽，其基序為IYSLAASSELPHVYMRKQS（SEQ ID NO：1）。

進一步的，基序的一端連接有不多于3個的氨基酸。

進一步的，其序列為IYSLAASSELPHVYMRKQS。

上述維生素D結(jié)合肽在制備維生素D結(jié)合蛋白抗原中的應(yīng)用。

一種維生素D結(jié)合蛋白抗體，由偶聯(lián)有上述維生素D結(jié)合肽的載體誘導(dǎo)動物體得到。

一種維生素D結(jié)合蛋白抗體的制備方法，包括將上述的維生素D結(jié)合肽與增加免疫原性的載體偶聯(lián)，之后刺激動物體，接著制備篩選出單克隆抗體，最終得到維生素D結(jié)合蛋白抗體。

作為上述方法的進一步改進，增加免疫原性的載體為純蛋白衍化物PPD。

一種維生素D定量檢測試劑盒，所述試劑盒為ELISA試劑盒，其使用的維生素D結(jié)合蛋白抗體由偶聯(lián)有上述維生素D結(jié)合肽的載體誘導(dǎo)動物體得到。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的維生素D結(jié)合肽，可以作為抗原很好地誘導(dǎo)出針對維生素D結(jié)合蛋白的抗體，進而對維生素D結(jié)合蛋白進行精確定量，實現(xiàn)體內(nèi)維生素D含量的定量檢測。

附圖說明

圖1是VD2的小鼠免疫強弱的篩選結(jié)果；

圖2是VD2的雜交瘤篩選結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實驗，進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

抗原的制備：

1)取人工合成的多肽序列IYSLAASSELPHVYMRKQS（標(biāo)記為VD2）4℃下溶解于2ml 0.02 M的鹽酸中，然后再加到40ml的乙醚中進行萃取，充分搖勻后靜置、分層后取最底部的分層，即溶解的多肽；

2)PPD的配備：稱量10mg的PPD溶解到1ml的磷酸鹽緩沖液（PBS）中,再加入10mg的malsac（EPSILON-N-MALEIMIDOCAPROIC ACID-(2-NITRO-4-SULFO)-pHENYL ESTER SODIUM SALT，Ε-N-馬來酰亞胺己酸(2-N-4-S)苯酯鈉鹽）混合30分鐘。然后吸取混合液加入到事先用0.1M PBS(5-10ml)洗過兩次的圓柱中，一段時間后，用EP管收集呈灰色的分層，即為溶解后的PPD。溶解后的多肽和PPD再一起加入到0.5M PBS（0.5ml）中，快速地在液氮的冷氣里過一下，然后在室溫?fù)u勻過夜。第二天再用PBS稀釋到5ml，分裝EP管中備用（1ml/管），剩余的可儲存到-80℃；得到由多肽偶聯(lián)到結(jié)核菌素制成的抗原。

將配置好的PPD與弗氏佐劑（Freund adjuvant）混合均勻，得到VD2免疫劑。

免疫小鼠：第一步先卡介苗尾部皮下注射免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進一步產(chǎn)生抗體作為下一步多肽免疫的載體蛋白。一個月后，開始第一次多肽的免疫，第一組小鼠肌肉注射0.1ml配備好的VD2免疫劑；對照組小鼠只肌肉注射等量的生理鹽水，首次注射的免疫劑量中要至少包含20ug的純多肽。一個月之后，所有小鼠再重復(fù)注射一次加強免疫。經(jīng)過20天免疫后，剪小鼠尾部取血，測定小鼠對注射的免疫劑的免疫程度。尾部取2-3滴血稀釋到0.5ml的PBS中，然后離心取其上清液儲存。以儲存的上清液為樣本，用ELISA技術(shù)進行檢測，看小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答情況。然后對免疫反應(yīng)強的小鼠再進行一次加強免疫。28天之后對前一次免疫應(yīng)答強的小鼠只注射合成肽最后一次加強免疫。對實驗組加強免疫時，對照組都注射同劑量的生理鹽水。再3天之后，殺死免疫反應(yīng)強的小鼠取其脾臟，然后用不含血清的DMEM沖洗幾次，加入凍存液（90%FBS+10%DMSO），液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠尾部血的篩選

取小鼠的尾部血為樣本，用包被液（0.2M碳酸氫鹽溶液，pH9.6）作為稀釋液，把這多肽配備到所需要的體積，多肽的濃度稀釋到10ug/ml,每個孔里加入100ul的含有多肽的稀釋液，用密封膜密封，在潮濕的環(huán)境并室溫下，放置2天。孵育2天之后，先用洗滌液洗滌2遍，洗滌液的配方是：0.05M Tris-HCl pH7.5,0.15M NaCl,0.05%Tween-20。洗去多余的包被液，加入100 ul的封閉液（5%BSA,PBS,0.2% Tween-20）封閉一個小時。一個小時之后，洗滌2遍，加入100 ul從小鼠尾部取的血漿，室溫下孵育2個小時。然后再洗去未結(jié)合血清中的抗體，加入用Tris共軛緩沖液（1%BSA, 25Mm Tris-HCl, 0.15M NaCl）按1：1000比例稀釋的酶標(biāo)二抗（anti-mouse IgG），室溫下孵育1小時之后，洗去未特異性結(jié)合的抗體和酶標(biāo)抗體，每孔加入50ul的四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物，在足夠的我們需要的顏色出現(xiàn)后，每孔加入100ul的終止液（1M sulfuric acid）。在加入終止液30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀讀每個孔在450nm下的吸光度。

細(xì)胞融合

復(fù)蘇一凍存管的小鼠的骨髓瘤細(xì)胞（SP2），用DMED的完全培養(yǎng)液（500mlDMEM，50ml胎牛血清，10ml青霉素/鏈霉素）進行培養(yǎng)，因為SP2細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，所以每一小培養(yǎng)瓶加入10ml的培養(yǎng)液，給予細(xì)胞足夠的生存空間。SP2細(xì)胞至少在融合之前1周開始培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，大概一周的時間之后，取一點細(xì)胞液進行細(xì)胞計數(shù)，保證有足夠的活著的SP2細(xì)胞用于融合，至少要有2x10⁷個細(xì)胞。計數(shù)之后用50ml的無菌離心管收集SP2細(xì)胞，室溫下，1000rpm的離心力離心10分鐘，吸取舊的培養(yǎng)液，盡可能的吸盡。然后加入20ml預(yù)熱的不含血清的DMEM，上下吹打幾次，在193xg離心力下離心15分鐘，重復(fù)3次此步驟以充分洗去粘附在細(xì)胞上的血清，吸盡上清液。在處理SP2的同時，一起處理小鼠的脾臟細(xì)胞，在不含血清 DMEM培養(yǎng)液中把要用于融合的脾臟切成小塊并分解成單個脾臟細(xì)胞，收集脾臟細(xì)胞，以和SP2同樣的方法處理脾臟細(xì)胞。用不含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸脾臟細(xì)胞，然后把脾臟細(xì)胞轉(zhuǎn)移到收集SP2細(xì)胞的離心管里，充分混合后離心（193×g）15分鐘，重復(fù)2次，完全地吸除上清液避免稀釋下一步PEG的濃度，影響兩種細(xì)胞的融合。在細(xì)胞融合之前，必須把不含血清的DMED培養(yǎng)液、HAT選擇培養(yǎng)液和配備好的無菌的PEG放在37^OC的水浴鍋里預(yù)熱。PEG的配方是10mg的PEG溶解到10ml的無血清的DMEM培養(yǎng)液中，因為PEG的粘性較大，在低溫下很難溶解，所以應(yīng)放在水浴鍋里溶解，完全溶解后用過濾器進行過濾保持無菌性。在1分鐘內(nèi)緩慢的滴加1.5ml預(yù)熱過的PEG到清洗過的脾臟細(xì)胞和SP2細(xì)胞離心管內(nèi)，輕輕地晃動2分鐘，要保證細(xì)胞的充分融合，此步驟要在37^OC的溫水中進行。2分鐘之后，加入1ml的無血清DMEM培養(yǎng)液，一分鐘內(nèi)滴加完畢，然后依次加入2ml、5ml、6ml、6ml無血清的DMEM培養(yǎng)液，逐步稀釋PEG的濃度，也都分別在一分鐘內(nèi)完成，室溫下靜置2分鐘，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱里靜置5分鐘，100xg的離心力離心10分鐘，移除上清液并確保完全除去細(xì)胞內(nèi)的PEG，避免PEG對細(xì)胞的毒性傷害。然后加20ml預(yù)熱的HAT選擇性培養(yǎng)基到融合的新細(xì)胞內(nèi)，輕輕地吹打之后轉(zhuǎn)移到一個大的培養(yǎng)瓶（75cm²）中，重復(fù)一次。把培養(yǎng)瓶放置到培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2個小時，2小時之后，把融合的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板里，每個孔加200ul的HAT培養(yǎng)液，然后放到培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)（37℃, 5% CO₂）。

技術(shù)篩選雜交瘤細(xì)胞

HAT培養(yǎng)液是一種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基，它包含了次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)。氨基喋呤是一種有效地抑制RNA和DNA的起始合成途徑，從而會阻礙骨髓瘤細(xì)胞(SP2細(xì)胞)的增殖。未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。而未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長期存活而死亡。只有融合成功的雜交瘤細(xì)胞有從脾臟細(xì)胞內(nèi)獲得的HPRT酶，在HPRT酶的催化作用下，將能夠用選擇培養(yǎng)基里添加的次黃嘌呤和胸腺嘧啶作為原料通過中間合成途徑合成RNA和DNA，使融合的細(xì)胞能夠生存和無限增殖。

經(jīng)過HAT培養(yǎng)液的篩選，只有雜交瘤細(xì)胞才能存活，大約14天之后，檢測以確定哪些克隆體有興趣的產(chǎn)生抗體。并不是所有的形成雜交瘤細(xì)胞的脾細(xì)胞是B細(xì)胞,因此，會混有一下雜交瘤細(xì)胞不能產(chǎn)生抗體；也有一些雜交瘤細(xì)胞是B細(xì)胞融合而成，有產(chǎn)出抗體的特性，但有產(chǎn)生抗體的惰性。因此，很重要的一步是篩選出能夠產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞的克隆體。大量的克隆可能需要快速篩選并對篩選出的符合要求的克隆進一步培養(yǎng)。

融合的成功與否是通過間接ELISA技術(shù)對最佳條件下的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體的篩選決定的。

用10ug/ml的多肽包被96孔ELISA板，每孔內(nèi)加入100ul的包被液，室溫下過夜。第二天，在洗去多余的包被液后，加入100ul的封閉液，室溫封閉一個小時。吸除封閉液之后，每孔加入100ul的培養(yǎng)過細(xì)胞的上層培養(yǎng)液，然后密封，室溫下孵育過夜。第二天用洗滌液洗去未結(jié)合的培養(yǎng)液中的抗體，在吸水紙上重?fù)羲Ω?，隨后加入50ul的二抗（與小鼠尾部篩選所用的抗體一樣），孵育1個小時。然后洗去未特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體，甩干96孔板，再加入50ul的TMB底物，避光，時刻注意觀察顏色變化，最先出現(xiàn)顏色變化并且顏色深，說明雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力強。

一旦確認(rèn)所需要的雜交瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞必須克隆幾次，以確保得到一個穩(wěn)定、同類的克隆細(xì)胞，并確保其確實是單克隆抗體。所以，把篩選出的抗體產(chǎn)生能力強的雜交瘤細(xì)胞依次從96孔板轉(zhuǎn)移到24孔、6孔、小的培養(yǎng)瓶中，并且培養(yǎng)液也依次從HAT選擇培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換成HT培養(yǎng)液、完全培養(yǎng)液。

對得到的符合要求的克隆細(xì)胞進行細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞液的上清液，即得到未經(jīng)純化的單克隆抗體。隨后使用親和純化法對單克隆抗體進行純化。

維生素D結(jié)合蛋白合成多肽VD2免疫的小鼠免疫強弱的篩選結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，每個小鼠對合成肽的免疫反應(yīng)的強弱不同，同一組的每個小鼠對同一個多肽的免疫反應(yīng)強弱也不相同。上圖是用96孔板檢測的結(jié)果，下圖是檢測時加入的樣本在96孔板的對照位置，每種顏色代表了每一只小鼠。以96孔板作為固相，C1-C10和D1-D10的20個孔包被VD2；C11作為對照也分別固定上VD2。根據(jù)的原理，這一步實驗是用ELISA的間接法來測小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生的情況，顏色越深說明樣本中的抗體的濃度越高。從上圖的圖片中可以看出，實驗組孔的顏色都比對照孔的顏色深，說明小鼠對注射到體內(nèi)的多肽有免疫反應(yīng)。同實驗組不同小鼠之間對比，VD2組的8號和9號小鼠所對應(yīng)孔的顏色較深，即8號和9號小鼠對VD2的免疫應(yīng)答較強烈。因此，在免疫后期，殺死VD2組的8號和9號小鼠。

多肽雜交瘤細(xì)胞的篩選

圖2是第一次對VD2雜交瘤細(xì)胞篩選的結(jié)果。96孔板是用VD2多肽包被，專門對于融合的VD2雜交瘤細(xì)胞的篩選。圖2是對VD2雜交瘤細(xì)胞篩選加入停止反應(yīng)液所顯示的顏色，下圖是與96孔板所對應(yīng)的孔在450nm波長下的吸光度。H12是對照孔，加入的是未培養(yǎng)過細(xì)胞的新鮮HAT培養(yǎng)液。從圖片上看，只有C6、E6、E7這三個孔顏色較深，所對應(yīng)的吸光度也高，是所需要的雜交瘤。

<110> 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院

<120> 維生素D結(jié)合肽及其應(yīng)用

<130> VD2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工多肽

<400> 1

Ile Tyr Ser Leu Ala Ala Ser Ser Glu Leu Pro His Val Tyr Met Arg

1 5 10 15

Lys Gln Ser