本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其制備方法，以及在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品學(xué)和化妝品技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自從青霉素等抗生素被發(fā)現(xiàn)以來，對病原菌感染性疾病的防治產(chǎn)生了革命性飛躍。與此同時，人們也意識到病原微生物將最終會對青霉素等抗生素產(chǎn)生抗性，但是令人驚訝的是抗性產(chǎn)生的速度之快和抗性的廣泛性。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和濫用，在不到50年的時間內(nèi)，原來容易被殺死的細(xì)菌開始有了耐藥菌株及多重耐藥菌株。

為了應(yīng)對耐藥菌感染，人們在不斷研究和開發(fā)新型抗菌藥物。近年來出現(xiàn)的抗菌肽就是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬锾娲鷮ο?。昆蟲抗菌肽是昆蟲細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，大多數(shù)對細(xì)菌有較廣譜的抗性，有的對真菌、病毒、原蟲等也有抑制作用，尤其對耐藥菌株有明顯的殺傷作用，且不破壞真核生物體的細(xì)胞，無免疫原性。

桔小實(shí)蠅是蔬菜和水果上的重要害蟲。每年該種昆蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失和防治費(fèi)用都是相當(dāng)驚人的，也是目前導(dǎo)致部分省份尤其是廣東省的柑橘、枇杷等果樹掛果時為害特別嚴(yán)重的害蟲之一。桔小實(shí)蠅的成蟲、幼蟲及蛹生長在含有細(xì)菌的惡劣環(huán)境中，但其自身卻不受這些病原菌影響，顯示它具有較強(qiáng)的免疫能力。關(guān)于桔小實(shí)蠅抗菌活性物質(zhì)的相關(guān)技術(shù)研究具有重大的意義，目前尚未見發(fā)表的相關(guān)技術(shù)報道。

本發(fā)明利用細(xì)菌針刺的方法，免疫誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹分泌抗菌活性物質(zhì)，從桔小實(shí)蠅蛹分泌的抗菌活性物質(zhì)中分離純化得到桔小實(shí)蠅抗菌肽bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相似的多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的桔小實(shí)蠅抗菌肽(bactrocerin)；本發(fā)明的另一個目的是提供所述桔小實(shí)蠅抗菌肽的制備方法；本發(fā)明還有一個目的是提供所述桔小實(shí)蠅抗菌肽的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，是從桔小實(shí)蠅蛹分離純化得到的一種多肽，分子量為2.3道爾頓，等電點(diǎn)為11.43；所述抗菌肽的全序列為nh2-vgktwikvirgigkskikwq-cooh，氨基酸序列如seqidno：1所示，即頡氨酸-甘氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-色氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-頡氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-絲氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-色氨酸-谷氨酰胺。

本發(fā)明同時提供了所述桔小實(shí)蠅抗菌肽的制備方法：

方法一，本發(fā)明利用細(xì)菌針刺的方法，免疫誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹分泌抗菌活性物質(zhì)，從桔小實(shí)蠅蛹分泌的抗菌活性物質(zhì)中分離純化得到桔小實(shí)蠅抗菌肽bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相似的多肽。

方法一包括以下步驟：

(1)用混合菌液免疫誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹；

(2)桔小實(shí)蠅蛹組織勻漿，得到粗提物；

(3)粗提物經(jīng)純化后得到所述抗菌肽。

步驟(1)所述用混合菌液免疫誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹的方法為采用1號昆蟲針蘸取生理鹽水重懸的混合菌液針刺桔小實(shí)蠅蛹的中部；所述生理鹽水為含150mmnacl和5mmkcl；所述混合菌液是od600為0.3的金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大腸桿菌dh5α(escherichiacolidh5α)混合液。步驟(2)所述粗提方法是稱取一定量的經(jīng)混合菌液誘導(dǎo)后的桔小實(shí)蠅蛹，按重量體積比為1∶4～1∶6的比例加入相應(yīng)體積的提取緩沖液，冰浴上充分研磨，離心去除血細(xì)胞和其它組織沉淀，取上清。

所述提取緩沖液為50mmol/l醋酸銨中加入終濃度為1.5μmol/l的蛋白酶抑制劑aprotinin和終濃度為20μmol/l苯基硫脲；所述離心條件是在溫度為4℃、10,000×g下離心30至35分鐘。

步驟(3)所述純化方法為經(jīng)離子交換柱層析、反相快速蛋白液相色譜和反相高壓液相色譜純化。

所述離子交換柱層析的方法是將桔小實(shí)蠅蛹組織勻漿的粗提物上樣于50mmol/l醋酸銨ph5.0緩沖液平衡的cmsepharosefastflow弱陽離子交換柱，交換柱長260mm，直徑16mm，用50mmol/l～1mol/l線性梯度的醋酸銨ph5.0緩沖液洗脫，收集第iii峰；

所述反相快速蛋白液相色譜是將離子交換柱層析得到的活性組分峰(第iii峰)上樣于2％乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液平衡的resourcerpc3ml反相柱，柱長100mm，直徑6.4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈緩沖液從2％～80％線性梯度洗脫60分鐘，收集29～36分鐘之間的組分，每1.5分鐘1個組分，共收集得到a，b，c和d4個組分；

所述反相高壓液相色譜是將反相快速蛋白液相色譜得到的活性最高組分峰(b峰)上樣于18％乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液平衡的hypersilods反相柱，柱長250mm，直徑4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈緩沖液從18％～22％線性梯度洗脫32分鐘，收集34分鐘處的峰。

方法二為通過基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程表達(dá)后經(jīng)離子交換柱層析、反相快速蛋白液相色譜和反相高壓液相色譜純化獲得。

所述離子交換柱層析、反相快速蛋白液相色譜和反相高壓液相色譜純化方法同方法一。

本發(fā)明提供了所述桔小實(shí)蠅抗菌肽作為原料在抗病原微生物感染的生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)中的應(yīng)用，生物技術(shù)產(chǎn)品包括醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品和食品防腐保鮮劑、動物飼料添加劑、化妝品等。

以及桔小實(shí)蠅抗菌肽作為抗病基因通過轉(zhuǎn)基因和其它常規(guī)生物技術(shù)手段在轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物育種方面的應(yīng)用。

本發(fā)明采用常規(guī)的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法測定桔小實(shí)蠅抗菌肽的分子量，軟件分析計算其等電點(diǎn)，自動edman降解法蛋白測序儀測定該抗菌肽氨基酸序列。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明提供了一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，無溶血活性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，對多種細(xì)菌，例如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌具有抑菌活性，可用于抗病原微生物感染的生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)；以桔小實(shí)蠅抗菌肽bactrocerin氨基酸序列或基因序列為基礎(chǔ)，通過基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程、轉(zhuǎn)基因和其它生物技術(shù)手段，可以大規(guī)模獲得桔小實(shí)蠅抗菌肽bactrocerin蛋白，用于抗病原微生物感染的生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)；

(2)本發(fā)明尋找到研究桔小實(shí)蠅抗菌活性物質(zhì)的有效渠道，并建立了可行的制備方法和純化條件，為深入研究桔小實(shí)蠅抗菌活性物質(zhì)的應(yīng)用打下技術(shù)基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1桔小實(shí)蠅抗菌肽的離子交換柱層析圖；

圖2桔小實(shí)蠅抗菌肽的反相快速蛋白液相色譜圖；

圖3桔小實(shí)蠅抗菌肽的反相高壓液相色譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。

由免疫桔小實(shí)蠅蛹分離制備bactrocerin的方法包括以下實(shí)施例1、2、3所述過程；由基因工程克隆方法表達(dá)bactrocerin不包括實(shí)施例1中免疫桔小實(shí)蠅蛹粗提物制備過程。

實(shí)施例1：桔小實(shí)蠅抗菌肽的制備步驟如下：

(1)用混合菌液免疫誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹；

采用1號昆蟲針蘸取生理鹽水重懸的混合菌液針刺桔小實(shí)蠅蛹的中部；所述生理鹽水為含150mmnacl和5mmkcl；所述混合菌液是od600為0.3的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌dh5α混合液。

(2)桔小實(shí)蠅蛹組織勻漿，得到粗提物；

稱取一定量的誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅蛹，按重量體積比1∶4～1∶6的比例加入相應(yīng)體積的提取緩沖液，提取緩沖液為50mmol/l醋酸銨中加入1.5μmol/l(終濃度)蛋白酶抑制劑aprotinin和20μmol/l(終濃度)苯基硫脲，冰浴上充分研磨，4℃，10,000×g離心30至35分鐘，上清即為桔小實(shí)蠅蛹組織勻漿的粗提物，低溫，優(yōu)選-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)粗提物經(jīng)純化后得到所述抗菌肽。

純化的第一步，進(jìn)行離子交換柱層析。按上述方法制備的粗提物上樣于50mmol/l醋酸銨ph5.0緩沖液平衡的cmsepharosefastflow弱陽離子交換柱，柱長260mm，直徑16mm，用50mmol/l～1mol/l線性梯度的醋酸銨ph5.0緩沖液洗脫，收集第iii峰，見附圖1，常規(guī)方法凍干，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

第二步，進(jìn)行反相快速蛋白液相色譜。離子交換柱層析得到的第iii峰凍干組分重溶于0.05％三氟乙酸水溶液，上樣于2％乙腈0.05％三氟乙酸水溶液(體積比)平衡的resourcerpc3ml反相柱，柱長100mm，直徑6.4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈緩沖液從2％-80％線性梯度洗脫60分鐘，收集29.5-35.5分鐘之間的組分，每1.5分鐘1個組分，共收集得到a，b，c和d4個組分，見附圖2。各個組分凍干后低溫保存?zhèn)溆茫蜏貎?yōu)選-80℃。

第三步，進(jìn)行反相高壓液相色譜。反相快速蛋白液相色譜得到的活性最高組分峰(b峰)凍干組分重溶于0.05％三氟乙酸水溶液，上樣于18％乙腈0.05％三氟乙酸水溶液(體積比)平衡的hypersilods反相柱，柱長250mm，直徑4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈緩沖液從18％～22％線性梯度洗脫32分鐘，收集34分鐘處的峰，見附圖3中箭頭所指的峰，凍干，低溫保存?zhèn)溆?，低溫?yōu)選-80℃。

實(shí)施例2：純化的桔小實(shí)蠅抗菌肽的鑒定

采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法測定桔小實(shí)蠅抗菌肽的分子量，軟件分析計算其等電點(diǎn)，利用自動edman降解法蛋白測序儀測定該抗菌肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

通過實(shí)施例制備的桔小實(shí)蠅抗菌肽是我們首次從桔小實(shí)蠅蛹中分離得到的一種多肽，其分子量為2.3道爾頓，等電點(diǎn)11.43，多肽全序列為：頡氨酸-甘氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-色氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-頡氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-絲氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-色氨酸-谷氨酰胺。

實(shí)施例3：桔小實(shí)蠅抗菌肽對微生物的抑制作用實(shí)驗(yàn)

將純化的桔小實(shí)蠅抗菌肽用滅菌蒸餾水1/2倍梯度稀釋。取對數(shù)生長期的細(xì)菌lb培養(yǎng)基菌液90μl，再加入不同濃度10μl的桔小實(shí)蠅抗菌肽，混勻，在96孔平板上30℃過夜孵育24h，用酶標(biāo)儀在600nm處測定各管的吸光度。吸光度沒有明顯變化的抗菌肽的最低濃度為最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。真菌用80μl的真菌孢子(104孢子/ml)在土豆瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行，各孔中加入不同濃度20μl的桔小實(shí)蠅抗菌肽，混勻，在96孔平板上25℃過夜孵育24h，用酶標(biāo)儀在595nm處測定各管的吸光度。吸光度沒有明顯變化的抗菌肽的最低濃度為mic。結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅抗菌肽對細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌(如芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)具有顯著的抑制細(xì)菌生長作用，對真菌(如鐮刀菌、青霉菌、黑曲霉菌)也有較高的抑菌效果。