本發(fā)明涉及豬分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬免疫性狀相關(guān)基因esr1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記可用于豬免疫相關(guān)性狀的檢測(cè)，所述的免疫性狀包括免疫性狀紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白濃度、血小板、血小板壓積、cd4-cd8-cd3-和cd4-cd8+cd3-。
背景技術(shù)：
畜牧業(yè)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中占據(jù)著非常重要的地位，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所占有的比值通常用來(lái)衡量一個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)展程度的重要指標(biāo)。豬肉作為我國(guó)最主要的肉類(lèi)來(lái)源，在中國(guó)肉食消費(fèi)中占據(jù)主導(dǎo)地位，可以說(shuō)，我們的生活與豬肉息息相關(guān)。因此，生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國(guó)畜牧業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。
隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬病的種類(lèi)越來(lái)越多，復(fù)雜程度不斷加劇，控制也越來(lái)越困難。豬病對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害日趨嚴(yán)重，已成為制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的重要因素。豬病防治是養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的大事。近幾年，雖然不少養(yǎng)豬場(chǎng)(戶(hù))為防治豬病投入了大量的人、財(cái)、物力，但很多都因豬病使養(yǎng)豬的利潤(rùn)受到影響，甚至虧損倒閉?！八幵接迷蕉?，病越治越多”的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，豬病成了養(yǎng)豬生產(chǎn)的“瓶頸”(張秀芳，2013)。目前，我國(guó)主要從預(yù)防與治療這兩個(gè)方面來(lái)解決豬病。預(yù)防是指給動(dòng)物接種注射能預(yù)防相應(yīng)疫病的疫苗，從而增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力，它是我們?cè)趧?dòng)物疫病的預(yù)防控制過(guò)程中最重要的手段之一(williamhollis等，2003)。但是在實(shí)際工作中往往會(huì)岀現(xiàn)免疫后動(dòng)物還會(huì)發(fā)生相應(yīng)的疫病而死亡，或者已免疫接種的動(dòng)物不產(chǎn)生免疫抗體或抗體水平很低的現(xiàn)象。即使工作人員按照豬場(chǎng)的正規(guī)免疫程序?qū)】禒顩r良好的豬進(jìn)行免疫接種，最后也往往會(huì)出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象(王強(qiáng)等，2009)。在保證疫苗質(zhì)量良好，免疫操作規(guī)范，豬場(chǎng)管理合理的情況下，個(gè)體機(jī)體狀況與應(yīng)激反應(yīng)就成了影響免疫接種效果的重大因素。個(gè)體機(jī)體狀況主要與遺傳因素有關(guān)，動(dòng)物機(jī)體對(duì)接種抗原有無(wú)免疫應(yīng)答，在一定程度上是受遺傳控制的，動(dòng)物品種繁多，免疫應(yīng)答各有差異，即使同一品種不同的個(gè)體，對(duì)同一疫苗的免疫反應(yīng)強(qiáng)弱也不一致。有的動(dòng)物甚至有先天性免疫缺陷，從而導(dǎo)致免疫失敗。由于豬免疫應(yīng)答差異，造成仔豬母源抗體水平參差不齊，即使是同一豬群中的不同個(gè)體之間母源抗體程度也不一致。各種應(yīng)激反應(yīng)都會(huì)干擾免疫應(yīng)答，如驚嚇、注射、保定，光線過(guò)強(qiáng)、舍溫過(guò)高、濕度過(guò)大，過(guò)敏反應(yīng)等應(yīng)激，都會(huì)影響免疫的效果。當(dāng) 給豬群注射疫苗時(shí)，豬體會(huì)對(duì)疫苗產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，在一定程度上，這種反應(yīng)是有益的，但如果反應(yīng)過(guò)度，會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，如果嚴(yán)重，會(huì)對(duì)豬群產(chǎn)生致命影響。在生產(chǎn)過(guò)程中，即使做好預(yù)防免疫工作，豬群里的一些個(gè)體依然會(huì)受到感染產(chǎn)生疾病，針對(duì)這種情況，我國(guó)主要是采取藥物治療。但是，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，藥物對(duì)豬病的防治效果越來(lái)越差，且病越來(lái)越多，一方面是藥物方面的一些原因，另一方面則是豬病方面的一些原因(張秀芳等，2013)。近些年，在使用抗菌藥物時(shí)遇到的首要問(wèn)題是細(xì)菌的耐藥性，它已成為藥物療效降低的一個(gè)重要原因(聶奎等，2009)。由于長(zhǎng)期濫用抗生素，各地不斷產(chǎn)生具有“多重耐藥性”的菌株，它們分布相當(dāng)廣泛，這使得人們?cè)谶x擇藥物時(shí)十分茫然，使用效果也不明顯(陳偉華等，2010)。且近些年的豬傳染病，大多是以豬免疫系統(tǒng)受損而導(dǎo)致多種細(xì)菌并發(fā)、繼發(fā)或混合感染，同時(shí)還有許多新病原體的出現(xiàn)或老病原體發(fā)生變異，改變了病原體與豬體之間原有的相互關(guān)系，還造成一些豬傳染病以非典型或綜合征的形式出現(xiàn)，這給豬病的防治造成極大的難度。在現(xiàn)實(shí)中，很多缺乏藥物或獸醫(yī)知識(shí)的養(yǎng)豬者，經(jīng)常頻繁和大量同時(shí)用多種藥物防治豬病，不但治不了病，還會(huì)造成嚴(yán)重后果。許多養(yǎng)豬場(chǎng)(戶(hù))，預(yù)防為主的觀念尚未得到落實(shí)，未能將“防重于治”提升到“養(yǎng)重于防”的高度。健康豬本身具有較強(qiáng)的抗病能力或免疫力，尤其是一些免疫抑制性疾病，健康的豬群可明顯減少發(fā)病，只有通過(guò)這種根本性的防病措施，才能大幅度減少使用藥物的概率和數(shù)量，“健康養(yǎng)殖”才是防治豬病唯一正確的觀念。而“健康養(yǎng)殖”的首要前提是選取免疫性能良好的健康豬進(jìn)行養(yǎng)殖。本申請(qǐng)中，我們發(fā)現(xiàn)esr1基因中的一個(gè)snp位點(diǎn)，該位點(diǎn)與免疫性狀血小板、紅細(xì)胞壓積、cd4-cd8-cd3-呈顯著相關(guān)，與血小板壓積，平均紅細(xì)胞體積，平均血紅蛋白濃度呈極顯著相關(guān)，因此其可以用作群體育種的分子標(biāo)記，進(jìn)行早期選擇，從而縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，選種效率和準(zhǔn)確性，在動(dòng)物育種中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
在免疫和自免疫調(diào)節(jié)中，雌激素扮演了重要角色(cunningham和gilkeson,2011)。雌激素通過(guò)雌激素受體(estrogenreceptor,er)發(fā)揮功能，雌激素受體被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于染色體上的雌激素響應(yīng)元件(estrogenresponseelements,eres)上，以轉(zhuǎn)錄因子的形式啟動(dòng)下游基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮雌激素的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞中，說(shuō)明雌激素可調(diào)節(jié)多個(gè)免疫過(guò)程。事實(shí)上，雌激素可通過(guò)多基因、多信號(hào)通路發(fā)揮復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)功能(karpuzoglu-sahin等，2011)，甚至包括細(xì)胞間通訊的作用方式。雌激素可調(diào)節(jié)中樞免疫器官--骨髓中tnf-alpha、tgf-beta、il-1等免疫因子的活性，也可以廣泛作用于b淋巴細(xì)胞、dcs細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞等。在肝癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等眾多惡性疾病esr1起到了重要作用(張鳳春等，2011)。由上可知，esr1基因與免疫之間存在密切關(guān)系。因此可以研究esr1基因與免疫性狀之間的互作關(guān)系，這對(duì)提升豬的免疫性能和分子標(biāo)記輔助育種有重要作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種與豬免疫性狀相關(guān)基因esr1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。利用該分子標(biāo)記可迅速預(yù)測(cè)不同基因型群體豬之間免疫性狀的差別，同時(shí)在豬育種工作中，該分子標(biāo)記可作為免疫性狀的可靠標(biāo)記，便于進(jìn)行早期選擇，從而縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，提高選種效率和準(zhǔn)確性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種免疫性狀相關(guān)基因esr1的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如seqidno：1或如圖5所示，在該分子標(biāo)記的核苷酸序列的第33堿基位有一個(gè)snp位點(diǎn)，即發(fā)生a/g等位基因突變，該突變導(dǎo)致sma1‐rflp多態(tài)性。
具體地，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示：
ccatcgcattccttgcaaatgtattacatcacr(a/g)ggggaggcggagaacttccccaccacaatctgagagctcccccggcagctcccccaaggttccaagaatccctgtcgcacttcacccccacctcgcatcactctagctgacttctgcccctgcacacactctggcatgcatccagcgctggctttctaatatgggtggc
上述序列中的第33堿基位的r是a或g，該突變導(dǎo)致sma1-rflp的多態(tài)性。
申請(qǐng)人提供了一種擴(kuò)增與豬免疫性狀相關(guān)基因分子標(biāo)記的引物對(duì)，該引物對(duì)的序列如下：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’。
本發(fā)明還提供了一種獲得上述分子標(biāo)記的方法，其步驟包括：以具有esr1基因的豬基因組dna為模板，通過(guò)以下引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增后獲得所述的分子標(biāo)記，所述的引物對(duì)的序列如下所示：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
pcr擴(kuò)增得到如seqidno：1所述的分子標(biāo)記。
一種篩選豬免疫性狀分子標(biāo)記的方法，包括如下步驟：
(1)豬esr1基因的引物設(shè)計(jì)與部分dna序列擴(kuò)增
用豬esr1基因序列信息(genbank收錄號(hào)：ensssct00000035147)作為引物設(shè)計(jì)的模板序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件oligo7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
(2)pcr擴(kuò)增反應(yīng)：
利用tianampgenomicdnakit試劑盒(購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)從豬品種二花臉與杜洛克雜交f2代實(shí)驗(yàn)群體(該群體來(lái)源于申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室與廣東溫氏集團(tuán)合作構(gòu)建的廣東免 疫群體)收集耳組織中提取基因組dna，具體操作方法參照tianampgenomicdnakit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
pcr反應(yīng)：pcr反應(yīng)總體積10μl，其中豬基因組dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去離子水至總體積10μl。
pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min后，循環(huán)35次95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分esr1片段，長(zhǎng)度為202bp，其核苷酸序列如seqidno：2所示。
(3)pcr產(chǎn)物的純化、測(cè)序
pcr產(chǎn)物的純化：在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然后用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司)純化pcr產(chǎn)物。將純化后的dna溶液送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行正反向測(cè)序。
用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增豬基因組dna得到了202bp特異性擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖2所示。正反向測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段所在的esr1基因(genbank收錄號(hào)：ensssct00000035147)的第30465堿基位發(fā)現(xiàn)一個(gè)a-g轉(zhuǎn)換(即等位基因突變，如圖3所示)，該突變?cè)斐梢粋€(gè)sma1酶切位點(diǎn)(ccc^ggg)。
本發(fā)明還提供了一種上述分子標(biāo)記在豬免疫性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法如下：
采集樣品的白細(xì)胞數(shù)、嗜中性細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜堿細(xì)胞數(shù)、平均血紅蛋白濃度、嗜堿細(xì)胞數(shù)百分比等22個(gè)血液指標(biāo)和cd4-cd8-cd3-等8個(gè)t細(xì)胞含量指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用混合線性模型來(lái)統(tǒng)計(jì)分析esr1基因snp位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與上述30項(xiàng)性狀之間的關(guān)系：
y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε
其中μ為平均值；x1、x2、x3、z為相應(yīng)效應(yīng)的設(shè)計(jì)矩陣；β1、β2、β3為固定效應(yīng)，分別表示基因型、性別、窩效應(yīng)；u為隨機(jī)效應(yīng)，即多效遺傳背景，服從于u～n(0，aσa2)；ε為殘差；相互獨(dú)立且服從于ε～n(0，iσε2)。采用免費(fèi)軟件r(3.2.4)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該基因的a/g突變基因型與血小板(p＝0.01031)、紅細(xì)胞壓積(p＝0.04986)、cd4-cd8-cd3-(p＝0.04287)呈顯著相關(guān)，與血小板壓積(p＝0.004874)，平均紅細(xì)胞體積(p＝0.0002244)，平均血紅蛋白濃度(p＝5.3961×10-6)呈極顯著相關(guān)。本發(fā)明還提供了一種上述分子標(biāo)記的引物對(duì)在豬免疫性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種鑒定含有esr1基因的豬的方法，所述的方法包括以下步驟：
(1)設(shè)計(jì)引物對(duì)：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’。
(2)pcr擴(kuò)增條件
pcr反應(yīng)總體積10μl，其中待測(cè)豬基因組dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去離子水至總體積10μl。
(3)pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，循環(huán)35次95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(4)rflp檢測(cè)
pcr產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積為10μl，其中pcr產(chǎn)物2μl，去離子水6.6μl，10×buffer1μl，限制性?xún)?nèi)切酶sma1為0.4μl，將樣品混勻后離心，37℃培養(yǎng)箱放置12h，用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在seqidno：2所示序列的33堿基位存在一個(gè)酶切位點(diǎn)，經(jīng)sma1酶切產(chǎn)生三種基因型，即：aa基因型只有202bp條帶，含有雜合子ag基因型有202bp、170bp、32bp三條帶，gg基因型有170bp和32bp三條帶。
本發(fā)明原理在于：
esr1基因序列中包含一個(gè)snp位點(diǎn)，位于genbank收錄號(hào)：ensssct00000035147esr1基因序列的第30465bp處，該突變位點(diǎn)為等位基因突變，即a/g的堿基突變，該突變導(dǎo)致sma1-rflp多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于所述的esr1基因的第3外顯子中，為同義突變。故本發(fā)明在esr1基因序列的snp位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，得到如seqidno：1所述序列的分子標(biāo)記(簡(jiǎn)潔序列)，該分子標(biāo)記可用于鑒定豬的免疫性狀的檢測(cè)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明利用pcr-rflp技術(shù)，在esr1基因第30465bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)a-g突變，且發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點(diǎn)與血小板、紅細(xì)胞壓積、cd4-cd8-cd3-具體性狀呈顯著相關(guān)，與血小板壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白濃度具體性狀呈極顯著相關(guān)。對(duì)豬免疫性狀的輔助選擇具有積極的意義。
附圖說(shuō)明
圖1：本發(fā)明技術(shù)流程圖。
圖2：豬esr1基因基因組擴(kuò)增電泳結(jié)果示意圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明：泳道m(xù)：dl2000分子量標(biāo)記。圖3為：本發(fā)明中豬esr1基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)的a>g突變snp。
圖4：豬esr1基因外顯子的sma1-rflp的三種基因型(aaaggg)電泳結(jié)果示意圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明：泳道m(xù)：2000bpdna分子量標(biāo)記。
圖5：是本發(fā)明制備的與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的直觀的核苷酸序列，在該序列的第33堿基位存在一個(gè)a/g等位基因突變。英文字母“r”為突變位點(diǎn)snp。
具體實(shí)施方式
為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1
豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備：
(1)豬esr1基因的引物設(shè)計(jì)與部分dna序列擴(kuò)增
用豬esr1基因序列信息(genbank收錄號(hào)：ensssct00000035147)作為引物設(shè)計(jì)的模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件oligo7.0設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的核苷酸序列如下所述：
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’，
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
(2)pcr擴(kuò)增反應(yīng)：
利用tianampgenomicdnakit試劑盒(購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)從二花臉與杜洛克資源群體(該群體來(lái)源于申請(qǐng)人所在的實(shí)驗(yàn)室與廣東溫氏集團(tuán)合作構(gòu)建的廣東免疫群體f2代，共計(jì)296頭，仔豬生長(zhǎng)到35日齡時(shí)，收集血液并測(cè)定血小板、血小板壓積等22個(gè)血液指標(biāo)和8個(gè)t細(xì)胞含量共計(jì)30個(gè)性狀指標(biāo))耳組織中提取基因組dna，參照tianampgenomicdnakit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組dna。
pcr反應(yīng)：pcr反應(yīng)總體積10μl，其中豬基因組dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去離子水至總體積10μl。
pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，循環(huán)35次95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分esr1片段，長(zhǎng)度為202bp，其序列為seqidno.2所示。
(3)pcr產(chǎn)物的純化、測(cè)序
pcr產(chǎn)物的純化：在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然后用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司)純化pcr產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟是按照100mg膠塊加入400μlgsbuffer的比例加入gsbuffer，置50℃溫育10min，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每?jī)煞昼婎嵉够靹蛞淮?；將溶化的膠液轉(zhuǎn)入到離心吸附柱，并將離心吸附柱置于廢液收集管中，10000rpm離心30s，棄去廢液；將離心吸附柱置回廢液收集管中，加入500μlwashbuffer于離心吸附柱中，10000rpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用500μlwashbuffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置會(huì)廢液收集管中，最高速度離心1min；小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)無(wú)菌的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30μl雙蒸水，室溫靜置2-10min后，最高速度離心1min；取出離心吸附柱，將1.5ml離心管(dna溶液)置于-20℃保存?zhèn)溆?。將純化后的dna溶液送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限 公司進(jìn)行正反向測(cè)序。
用引物擴(kuò)增豬基因組dna得到了202bp特異性擴(kuò)增片段，得到如圖2所示的結(jié)果，正反向測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段所在的esr1基因(genbank收錄號(hào)：ensssct00000035147)全序列的的第30465位發(fā)現(xiàn)一個(gè)a-g轉(zhuǎn)換(即等位基因突變，如圖3所示)，造成一個(gè)sma1酶切位點(diǎn)(ccc^ggg)。
實(shí)施例2
一種基于與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，該方法的具體步驟如下所述：
1、pcr-rflp診斷方法建立
(1)引物序列設(shè)計(jì)
正向引物：5’-ccatcgcattccttgcaaatgtattacatccc-3’；
反向引物：5’-gccacccatattagaaagccag-3’；
該引物擴(kuò)增所得的片段長(zhǎng)度為202bp，其序列為seqidno：2所示。在該片段的33堿基位發(fā)生一個(gè)等位基因突變(a/g)。
(2)pcr擴(kuò)增條件
pcr反應(yīng)總體積10μl，其中待測(cè)豬基因組dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去離子水至總體積10μl。
pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，循環(huán)35次95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸5min；pcr產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(3)rflp檢測(cè)
pcr產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積為10μl，其中pcr產(chǎn)物2μl，去離子水6.6μl，10×buffer1μl，限制性?xún)?nèi)切酶sma1為0.4μl，將樣品混勻后離心，37℃培養(yǎng)箱放置12h，用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在seqidno：2所述序列的33堿基位存在一個(gè)酶切位點(diǎn)，經(jīng)sma1酶切產(chǎn)生三種基因型：aa基因型只有202bp條帶，雜合子ag基因型有202bp、170bp、32bp三條帶，gg基因型有170bp和32bp三條帶。
實(shí)施例3
一種與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記在不同豬群體多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用，具體步驟如下所述：
利用pcr-smai-rflp檢測(cè)了二花臉與杜洛克雜交f2代實(shí)驗(yàn)群體(該群體來(lái)源于申請(qǐng)人所在的實(shí)驗(yàn)室與廣東溫氏集團(tuán)合作構(gòu)建的廣東免疫群體)。該突變位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)群體中的基因型和基因頻率如表1所示，檢測(cè)結(jié)果顯示，esr1基因在實(shí)驗(yàn)群體中存在三種基因型，其中aa基因型頻率為0.29，ag基因型頻率為0.59，gg基因型頻率為0.12，酶切分型的檢測(cè)結(jié)果與 測(cè)序結(jié)果相符，本發(fā)明的檢測(cè)方法可靠。該結(jié)果表明esr1基因在資源群體中等位基因a占優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例4
一種免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記與免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析
本實(shí)施例的豬群來(lái)自申請(qǐng)人所在的實(shí)驗(yàn)室與廣東溫氏集團(tuán)合作構(gòu)建的二花臉與杜洛克資源豬群。
采集樣品的白細(xì)胞數(shù)、嗜中性細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜堿細(xì)胞數(shù)、平均血紅蛋白濃度、嗜堿細(xì)胞數(shù)百分比等22個(gè)血液指標(biāo)和cd4-cd8-cd3-等8個(gè)t細(xì)胞含量指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用混合線性模型來(lái)統(tǒng)計(jì)分析esr1基因snp位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與上述30項(xiàng)性狀之間的關(guān)系：計(jì)算公式如下：
y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε
其中μ為平均值；x1、x2、x3、z為相應(yīng)效應(yīng)的設(shè)計(jì)矩陣；β1、β2、β3為固定效應(yīng)，分別表示基因型、性別、窩效應(yīng)；u為隨機(jī)效應(yīng)，即多效遺傳背景，服從于u～n(0，aσa2)；ε為殘差；相互獨(dú)立且服從于ε～n(0，iσε2)。采用免費(fèi)軟件r(3.2.4)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
對(duì)豬esr1基因sma1-rflp多態(tài)性位點(diǎn)與免疫性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，由表1可知：aa基因型頻率為0.29，ag基因型頻率為0.59，gg基因型頻率為0.12。
進(jìn)一步，本實(shí)施例采用r(3.2.4)語(yǔ)言軟件中的混合線性模型對(duì)豬esr1基因的a>g突變位點(diǎn)的多態(tài)在實(shí)驗(yàn)豬群中對(duì)免疫性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。分析結(jié)果見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該esr1基因的a/g突變基因型與血小板、紅細(xì)胞壓積、cd4-cd8-cd3-呈顯著相關(guān)，與血小板壓積，平均紅細(xì)胞體積，平均血紅蛋白濃度呈極顯著相關(guān)。
表1esr1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型與部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)結(jié)果
表1的說(shuō)明：mchc為平均血紅蛋白濃度；mcv為平均紅細(xì)胞體積；pct為血小板壓積；plt為血小板；hct為紅細(xì)胞壓積。