檢測人riok2基因表達(dá)量和相對表達(dá)量的引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中檢測人RI0K2基因表達(dá)量和相對表達(dá)量的引物對。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。原位癌高發(fā)年齡為30~35歲，浸潤癌為45~55 歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。臨床上的診斷方法一般為細(xì)胞刮片檢測、陰道鏡檢測、 組織活檢等。但是，子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位、宮頸息肉、潰瘍等原因會對診斷結(jié)果的確定性 造成嚴(yán)重干擾。因此，尋找新的宮頸癌診斷標(biāo)志物至關(guān)重要。
[0003] RI0K2(RI0 kinase 2)基因是一種磷酸激酶。有研究表明該基因與AKT信號通路有 關(guān)，可以調(diào)控細(xì)胞迀移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等行為。在宮頸癌當(dāng)中，與癌旁組織相比，RI0K2 的表達(dá)明顯升高。因此，RI0K2有希望成為潛在的宮頸癌診斷標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或 相對表達(dá)量的引物對。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量的引物對，為 名稱為RI0K2-P的由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測人類RI0K2基因表達(dá)量或 相對表達(dá)量的成套試劑。
[0008]本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測人類RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量的成套試 劑，由所述RI0K2-P與名稱為GAPDH-P的與人的GAPDH基因特異結(jié)合的引物對組成。
[0009] 上述成套試劑中，所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單 鏈DNA組成。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相 對表達(dá)量的試劑或試劑盒。
[0011]本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量的試劑或試劑 盒，由所述RI0K2-P或所述成套試劑與XI組成，所述XI為進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增所需試劑。
[0012] 上述試劑或試劑盒中，所述進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增所需試劑可為qPCRMIX^PCRMIX可 為北京全式金生物技術(shù)(TransGenBiotech)有限公司產(chǎn)品。
[0013]上述試劑或試劑盒中，所述定量PCR擴(kuò)增可為實時熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0014]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相 對表達(dá)量的系統(tǒng)。
[0015] 本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量的系統(tǒng)，由所 述RI0K2-P、所述成套試劑或所述試劑或試劑盒與Y1組成，所述Y1為進(jìn)行RNA提取所需的試 劑、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所需的試劑和/或進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增所需儀器。
[0016]上述系統(tǒng)中，所述進(jìn)行RNA提取所需的試劑可為TRIzol、氯仿、異丙醇和/或乙醇。TRIzol可為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品。
[0017] 所述進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所需的試劑可為ReverTranscriptqPCRRTKit中的試劑。 ReverTranscriptqPCRRTKit為Takara公司產(chǎn)品。
[0018] 所述進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增所需儀器可為實時熒光定量per儀（如ABI7300或ABI7500 (美國AppliedBiosystems公司））。
[0019]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞的系 統(tǒng)。
[0020]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞的系統(tǒng)，包括所述RI0K2-P、 所述成套試劑、所述試劑或試劑盒或所述檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá) 量的系統(tǒng)與基因定量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);所述基因定量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)用于計算將來自待鑒定組 織和/或細(xì)胞的RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量，根據(jù)所述待鑒定組織和/或細(xì)胞的RI0K2 基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量確定待鑒定組織和/或細(xì)胞是否為腫瘤組織和/或細(xì)胞。
[0021]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量的 方法。
[0022] 本發(fā)明所提供的檢測RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量的方法，包括以離體的待 鑒定組織和/或細(xì)胞的cDNA或RNA為模板，用所述RI0K2-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增中的退 火條件可為58°C35sec。反應(yīng)條件具體可為：95°C預(yù)變性lmin; 95°C15s，58°C35sec，40個循 環(huán)。
[0023] 所述PCR擴(kuò)增時的反應(yīng)體系可為25yL反應(yīng)體系，具體如下：2yLcDNA溶液，12.5yL qPCR1^義（2\)，1?101(24(1?101(24在該反應(yīng)體系中的濃度為0.2以]\〇，1?101(2-1?(1?101(2-1?在該 反應(yīng)體系中的濃度為0.2μΜ)，用無菌蒸餾水補(bǔ)至25yL。
[0024]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞的方 法。
[0025]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞的方法，包括:檢測來自待鑒 定組織和/或細(xì)胞的RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量；如果所述待鑒定組織和/或細(xì)胞的 RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá)量越高，所述待鑒定組織和/或細(xì)胞為或候選為腫瘤組織 和/或細(xì)胞的風(fēng)險越大，如果所述待鑒定組織和/或細(xì)胞的RI0K2基因的表達(dá)量或相對表達(dá) 量越低，所述待鑒定組織和/或細(xì)胞為或候選為腫瘤組織和/或細(xì)胞的風(fēng)險越小。
[0026] 上述方法中，所述待鑒定組織和/或細(xì)胞可為宮頸組織和/或?qū)m頸細(xì)胞。
[0027]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述RI0K2-P、所述成套試劑、所述試劑或 試劑盒或所述系統(tǒng)在下述1 )_5)中任一種中的應(yīng)用：
[0028] 1)檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量；
[0029] 2)制備檢測或輔助檢測人RI0K2基因表達(dá)量或相對表達(dá)量產(chǎn)品；
[0030] 3)鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞；
[0031] 4)制備鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細(xì)胞產(chǎn)品。
[0032]上述應(yīng)用中，所述腫瘤組織和/或細(xì)胞可為宮頸癌組織和/或細(xì)胞。
[0033]實驗證明，本發(fā)明的引物對能夠檢測RI0K2在宮頸癌組織中的表達(dá)含量，操作相對 簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。
[0034]本發(fā)明鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測宮頸癌樣品標(biāo)志物的不足，本發(fā)明設(shè)計了檢測內(nèi)參/ 目的基因用引物，用熒光定量PCR技術(shù)檢測人融合基因相對表達(dá)量。通過調(diào)整兩個基因的引 物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，開發(fā)了一種用于檢測RI0K2基因相對 表達(dá)量的試劑盒。
[0035]使用本發(fā)明的試劑盒，將實時熒光PCR技術(shù)對RI0K2基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢 測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過構(gòu)建 RI0K2和內(nèi)參基因GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，精確定量樣本的內(nèi)參基因拷貝數(shù)和RI0K2拷貝數(shù)， 相比于以往的免疫組化方法，該試劑盒具有精度高，結(jié)果便于判讀等優(yōu)點(diǎn)。加之該試劑盒將 反應(yīng)體系所需的引物、探針進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使實驗條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的 條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實驗效率。該試劑盒經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助 于臨床樣品的輔助性檢測。
【附圖說明】
[0036] 圖1為RI0K2熔解曲線。
[0037] 圖2為GAPDH熔解曲線。
[0038] 圖3為RI0K2和GATOH的擴(kuò)增曲線。其中。左側(cè)為GAH)H擴(kuò)增曲線，右側(cè)為RI0K2擴(kuò)增 曲線。
[0039]圖4為6位臨床宮頸癌患者RI0K2的相對表達(dá)量。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]實施例1
[0044]本發(fā)明的用于檢測RI0K2基因相對表達(dá)量的試劑盒