專利名稱：用于檢測aml-evi1融合基因相對表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實(shí)時(shí)突光定量PCR技術(shù),能夠?qū)θ祟惵运杓?xì)胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者體內(nèi)AMLl- EVIl融合基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，可有效的節(jié)約檢測時(shí)間，提高檢測精度。
背景技術(shù)：
白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時(shí)使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類。急性白血病病情進(jìn)展迅速，自然病程僅有數(shù)周至數(shù)月。一般可根據(jù)白血病細(xì)胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)兩大類。而慢性白血病常見的有慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。由于白血病類型不同，治療方案及預(yù)后亦不盡相同。慢性髓細(xì)胞性白血病，簡稱慢粒(chronic myelognous leukemia , CML),是臨床上一種起病及發(fā)展相對緩慢的白血病。病程從數(shù)月到數(shù)年不等，臨床上該病可分為3期慢性期、加速期和急變期(CML-BC)，初診時(shí)大部分患者為慢性期，一般在確診2-5年內(nèi)由慢性期進(jìn)展到加速期，最后發(fā)展到急變期(CML-BC)，急變后化療有效率不超過30%，中位生存期1-13個(gè)月，預(yù)后極差。CML-BC期可涉及所有系的造血細(xì)胞，而不同急變類型的預(yù)后及治療原則不盡相同，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)難以完全確定急變類型，需輔以免疫分型加以鑒別，結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查，有助于急變類型的診斷、治療和預(yù)后的判斷。Nueifora等報(bào)道的t (3 ;21)中，21號染色體上的AMLl在runt區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)之間斷裂并分別與MDSl和EVIl形成了 AMLl / MDSl和AMLl / EVIl融合基因。在AMLl /EVIl轉(zhuǎn)錄本中，AMLl的第5個(gè)外顯子被連接到EVIl的第2個(gè)非翻譯外顯子，導(dǎo)致了一個(gè)長的復(fù)合多肽的產(chǎn)生，它包含了 AMLl的runt區(qū)和幾乎全部EVII。AMLl / EVIl編碼一個(gè)180kD的融合蛋白，含3個(gè)DNA結(jié)合區(qū)。近年來，許多臨床和實(shí)驗(yàn)觀察都顯示，慢粒急變期，除bcr / abl融合基因外，60%-80%還呈現(xiàn)某些新的細(xì)胞或分子遺傳學(xué)改變。其中AMLl /EVIl融合基因也是慢粒急性變的重要機(jī)制之一。EVIl與AMLl基因融合產(chǎn)生的AMLl / EVIl融合蛋白具有雙重的功能，一方面阻斷分化；另一方面則刺激增殖，這分別依賴于AMLl上的結(jié)構(gòu)域和EVIl的第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。眾多報(bào)道顯示，慢粒急變EVIl陰性的患者中，可能部分患者EVIl基因產(chǎn)生了融合，使用EVIl特異性的引物則檢測不出。若使用更敏感的方法同時(shí)檢測AMLI / EVIl融合基因可能會提高慢粒急性變的預(yù)測性。目前臨床上已經(jīng)將AML1-EVI1融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預(yù)后的手段之一。常用的檢測技術(shù)有熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法盡管結(jié)果較為直觀，但是試驗(yàn)過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且結(jié)果需經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人士來判讀，結(jié)果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點(diǎn)定量，無法對起始模板量進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。此外，由于砷劑及全反式維甲酸的應(yīng)用，APL治療效果得到很大的提高，微小殘留病是其復(fù)發(fā)的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對AMLl-EVI I融合基因mRNA殘留進(jìn)行檢測。RQ-PCR米用Taqman探針突光定量技術(shù),綜合生物學(xué)、酶學(xué)和突光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時(shí)也提高了敏感度，其結(jié)果用拷貝數(shù)表示，實(shí)現(xiàn)了對PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，與定性PCR技術(shù)相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關(guān)系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優(yōu)點(diǎn)。能夠滿足AML1-EVI1融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認(rèn)為是目前首選檢測方法，用于評價(jià)治療效果、預(yù)測預(yù)后。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術(shù)等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應(yīng)用于AMLl-EVII的基因檢測
發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測AMLl- EVIl融合基因的不足，本發(fā)明設(shè)計(jì)了檢測內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術(shù)檢測白血病AMLl- EVIl融合基因相對表達(dá)量。通過調(diào)整兩個(gè)基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，開發(fā)了一種用于檢測白血病AMLl- EVIl融合基因相對表達(dá)量的試劑盒。用于檢測AMLl- EVIl融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于
檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探針 AML1-EVII-Probe，檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，
AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。進(jìn)一步地，檢測用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為AML1-EVI1_F AMLl-EVII-R AMLl-EVIl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。參照用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為abl-F abl-R abl-Probe的摩爾比為 2 : 2 : I。所述陽性對照品為含有AML1-EVI1基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl- EVIl基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為Τ0Υ0Β0公司生產(chǎn)的qPCR用cDNA試劑盒產(chǎn)
品OTHUNDERBIRD qPCR MIX為TOYOBO公司生產(chǎn)的定量PCR試劑，產(chǎn)品規(guī)格為QPS-101。
使用本發(fā)明的試劑盒，將實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合采用Tapman探針，可以對AMLl-EVIl融合基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時(shí)間。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過構(gòu)建AMLl- EVIl和內(nèi)參基因abl的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，精確定量樣本的內(nèi)參基因拷貝數(shù)和AMLl- EVIl拷貝數(shù)，相比于以往的免疫組化方法和現(xiàn)今的ΔΔ CT法，該試劑盒具有精度高，結(jié)果便于判讀等優(yōu)點(diǎn)。加之該試劑盒將反應(yīng)體系所需的引物、探針進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使擴(kuò)增效率和速率等實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。該試劑盒經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助于臨床上慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者體內(nèi)AMLl-EVIl融合基因的微量殘留檢測，對于及時(shí)干預(yù)治療避免血液學(xué)復(fù)發(fā)、調(diào)整治療方案、評價(jià)治療效果、預(yù)測預(yù)后、預(yù)防臨床復(fù)發(fā)都具有重要意義。


圖I :AML1-EVI1型陽性結(jié)果示意圖。圖2 :AML1-EVI1型陰性結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本發(fā)明的用于檢測AML1-EVI1融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括
紅細(xì)胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
無水乙醇；
檢測體系 PCR 反應(yīng)液ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO 公司);THNDERBIRD ProbeqPCR Mix (2X )、AML1-EVI1 上、下游引物各 0. 8uM,AMLl-EVII 探針 0. 4 uM ；abl 上、下游引物各 O. 8uM、abl-probe (探針)0. 4uM ；
其中AML1-EVI1-F: GACCATCACTGTCTTCA ；
AMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT ；
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA ；abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
陽性對照品含AML1-EVI1基因組溶液；陰性對照品不含AML1-EVI1基因組溶液。實(shí)施例2
本發(fā)明試劑盒的使用方法
(I)抽提血液中的組織RNA:在潔凈的I. 5ml的離心管中加入Iml紅細(xì)胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細(xì)胞；再次加入0. 5ml紅細(xì)胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細(xì)胞；向細(xì)胞中加入ImlTRIzol，反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0. 2ml氯仿，震蕩均勻；HOOOrpm40C離心lOmin，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。(2)參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各X ul，每人份23ul分裝 X=23ul反應(yīng)液X (8份內(nèi)參(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+8份目的基因(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+η份標(biāo)本+1份陽
性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
(4)加樣加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。(5)檢測檢測在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個(gè)循環(huán)，突光信號于58°C 35 sec時(shí)米集。(6)結(jié)果判斷將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴(kuò)增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值自動計(jì)算出拷貝數(shù)。I)內(nèi)參陽性時(shí)，檢測結(jié)果才認(rèn)為有效；
2)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，Ct〈36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗(yàn)證；Ct >38，為陰性。實(shí)施例3
采用本發(fā)明核酸檢測試劑盒檢測臨床標(biāo)本
取送檢的慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)患者抗凝血標(biāo)本共80例，按實(shí)施例2所述方法提取基因組RNA、配制試劑并檢測。每份標(biāo)本加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ul。同時(shí)做陽性，陰性，空白對照，內(nèi)參基因/目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時(shí)檢測38份樣品，每個(gè)樣本2次重復(fù)，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時(shí)間僅為100分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與特檢實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告結(jié)果相比較，確定樣品檢測的準(zhǔn)確率。部分陽性結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.用于檢測AMLl-EVIl融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于 檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探針 AML1-EVII-Probe，檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVII-R: AGTCTTCGCAGCGATATAMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于AMLl-EVII-F AMLl-EVI I-R AMLl-EVIl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于abl-F: abl-R : abl-Probe的摩爾比為2: 2 : I0
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為含有AMLl-EVIl基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl- EVIl基因的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測AML1-EVI1融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、檢測目的基因用上下游引物AML1-EVI1-F，AML1-EVI1-R，探針AML1-EVI1-Probe，檢測內(nèi)參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe。本發(fā)明試劑盒能夠?qū)β运杓?xì)胞性白血病(chronicmyelognousleukemia，CML)患者體內(nèi)AML1-EVI1融合基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，可有效的節(jié)約檢測時(shí)間，提高檢測精度。
文檔編號C12Q1/68GK102776282SQ20121023367
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者周曉犢, 徐建成, 王淑一 申請人:武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司