專利名稱：一種檢測 VEGFR2 mRNA 基因表達(dá)量的試劑盒及方法
—種檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒及方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒及方法。
技術(shù)背景
血管生成是實(shí)體瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成已成為近年來尋找新型抗腫瘤藥物的重要研究方向。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)是抗血管生成靶向治療的主要靶標(biāo)?？寡苌伤幬镒饔脵C(jī)理主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成來達(dá)到阻止腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的此類藥物包括舒尼替尼、索拉非尼和貝伐單抗等。貝伐單抗(Bevacizumab, Avastin)是一種重組的人類單克隆IgGl抗體，通過抑制人類血管內(nèi)皮生長因子VEGF的生物學(xué)活性，而阻斷腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。2004年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)后，用于結(jié)直腸癌、 非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的治療。
VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor,血管內(nèi)皮生長因子受體)，迄今已發(fā)現(xiàn)的VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體包括fms樣酪氨酸激酶VEGFR-1， 即 Flt-1 (Fms-like tyrosine),胎兒肝激酶插入?yún)^(qū)受體 VEGFR-2,即 KDR/Flk-1 (Kinase insert domain-containing receptor)和 VEGFR-3 (Flt_4),三者均具有酪氨酸活性，此外還有一些相關(guān)受體，如神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白(Neuropilin-1, 2，NRP-1, 2)等非激酶受體。大量研究證明，VEGFR在正常人體組織中呈低水平表達(dá)，而在絕大多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且 VEGF受體不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，故認(rèn)為除旁分泌外，還存在自分泌途徑。它不僅促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，且誘導(dǎo)腫瘤血管增生，并促使其腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移(Harada Y, etal.1nt J Clin Oncol. 2001 Oct; 6 (5) :221-8)。
臨床研究表明，VEGFR2 (或稱KDR) mRNA表達(dá)水平檢測對結(jié)直腸癌患者接受靶向治療具有明顯的指導(dǎo)意義，VEGFR2低表達(dá)的患者中位無進(jìn)展生存期較短(AB El-Khoueiry AP et al. J Clin Oncol. 2009; 27:15s.)。因此，對 VEGFR2 表達(dá)量實(shí)時、準(zhǔn)確、定量地檢測，有利于臨床醫(yī)生及時、準(zhǔn)確、合理的制定個體化治療方案。
熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為本發(fā)明提供了一種操作簡單快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、檢測費(fèi)用低，準(zhǔn)確可靠、定量檢測mRNA的方法。通過該方法可以快速檢測腫瘤細(xì)胞(來源于腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、穿刺標(biāo)本、胸腹水等)中VEGFR2 mRNA的表達(dá)量，用于臨床醫(yī)生對血管生成抑制劑靶向藥物(舒尼替尼、索拉非尼、貝伐單抗等)的合理化使用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測VEGFR2基因mRNA表達(dá)量的熒光定量PCR檢測試劑盒，能簡單快速、準(zhǔn)確可靠的檢測VEGFR2基因。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下組成部分(I )VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體，所述VEGFR2基因編碼序列如SEQ ID NO.1所示；(2)內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品含有B2M基因編碼序列的重組載體，所述B2M基因編碼序列如SEQ ID NO. 2所示；(3)檢測VEGFR2基因的上、下游引物VEGFR2-上游引物:5，- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3，(SEQ ID NO. 3)；VEGFR2-下游引物:5，- ATCTGGGGTGGGACATACAC -3，(SEQ ID NO. 4)；(4)檢測B2M基因的上、下游引物B2M-上游引物5’ - CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’ (SEQ ID NO. 5)；B2M-下游引物5’ - TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3，(SEQ ID NO. 6)。
進(jìn)一步，所述含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體和含有B2M基因編碼序列的重組載體的空載體均采用PUC57載體；進(jìn)一步，該試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶中。
所述逆轉(zhuǎn)錄緩沖液為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，如5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(有濃度為 50mmol/L、pH 為 8. O 的 Tris-HCl、濃度為 SOmmoI /I,的 KCl、濃度為 4 mmol /I,的 MgC12 和濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT組成)等；所述逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液為dATP (脫氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR 緩沖液為常規(guī)定量PCR緩沖液，如5 X定量PCR緩沖液(由濃度為lOmmol/L，pH為8. O 的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KCl和濃度為2 mmol/L的MgC12組成)等。
本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的方法，包括以下步驟 (O從待測標(biāo)本中提取總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物 Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)分別將已知拷貝數(shù)的VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至108、107、106、 105、104、103、102、10 個拷貝數(shù) / μ I ;(3)分別以步驟(I)所制備的待測cDNA及步驟(2)倍比稀釋的VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入內(nèi)對照Β2Μ基因標(biāo)準(zhǔn)品，檢測VEGFR2基因的上、下游引物，檢測內(nèi)對照Β2Μ基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR ；(4)由于模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，因此，根據(jù)倍比稀釋的VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值對其含有的VEGFR2基因和內(nèi)對照B2M 基因的初始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的VEGFR2基因和內(nèi)對照B2M基因的初始拷貝數(shù)。
進(jìn)一步，所述步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性3分鐘，然后95°C變性30 秒、57°C退火40秒，共38個循環(huán)。
本發(fā)明的定量PCR檢測試劑盒由于選擇了合適的引物，制備了合適的VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品，能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地同時檢測VEGFR2基因，適用于臨床上對血管生成抑制劑靶向藥物(舒尼替尼、索拉非尼、貝伐單抗等)療效反應(yīng)的評價，利于臨床醫(yī)生對治療方案做出合理的選擇。


圖1為本發(fā)明中基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明中i 」 #基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為本發(fā)明中基因和沈 #基因的溶解曲線；圖4為本發(fā)明中基因的擴(kuò)增曲線；圖5為本發(fā)明中i 」 #基因的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
一、VEGFR2基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的配置本實(shí)施例的VEGFR2基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括以下組成部分1)VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品含有VEGFR2基因編碼序列(GeneBank編號為NM_002253. 2) 的重組PUC57載體；2)內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品含有B2M基因編碼序列(GeneBank編號為NM_004048.2) 的重組PUC57載體；3)檢測VEGFR2基因的上、下游引物VEGFR2-上游引物5’ - ACTGTCATCCTTACCAATCCCA-3’ (SEQ ID NO. 3)VEGFR2-下游引物:5，- ATCTGGGGTGGGACATACAC-3’ (SEQ ID NO. 4)；·4)檢測內(nèi)對照B2M基因的上、下游引物B2M -上游引物5’ - CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA-3’ (SEQ ID NO. 5)B2M -下游引物5’ - TTCATCCAATCCAAATGCGGC-3’ (SEQ ID NO. 6)；5)5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，濃度為lOpmol/μ I的逆轉(zhuǎn)錄引物Olig0-(dT) 16，濃度為 20pmol/ μ I的dNTPs溶液，濃度為IOU/ μ I的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，5 X定量PCR緩沖液，濃度為2U/ μ I的TaqDNA聚合酶。
其中，VEGFR2和內(nèi)對照Β2Μ基因標(biāo)準(zhǔn)品由以下方法制得a)直接合成獲得含有VEGFR2和B2M基因編碼序列的片段DNA；b)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后，克隆至pGET載體進(jìn)行連接；c)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆；d)提取重組質(zhì)粒，即得分別含有VEGFR2和B2M基因編碼序列的重組pGET載體。
除了 pGET載體外，其它載體如pBU18等也可用于構(gòu)建含有VEGFR2和B2M基因編碼序列的重組載體，都可以達(dá)到本發(fā)明目的。
此外，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量 PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶均為RT-PCR的常規(guī)試劑，故本發(fā)明的檢測試劑盒也可以不包括上述常規(guī)試劑。
二、VEGFR2基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測本實(shí)施例的VEGFR2基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟(1)從待測外周血、腫瘤組織、穿刺標(biāo)本或其它標(biāo)本中提取總RNA，測RNA的濃度；(2)將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，轉(zhuǎn)錄體系如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下組成部分Cl) VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體，所述VEGFR2基因編碼序列如SEQ ID NO.1所示；(2)內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品含有B2M基因編碼序列的重組載體，所述B2M基因編碼序列如SEQ ID NO. 2所示；(3)檢測VEGFR2基因的上、下游引物VEGFR2-上游引物5’ - ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3’ ；VEGFR2-下游引物5’ - ATCTGGGGTGGGACATACAC -3’ ；(4)檢測B2M基因的上、下游引物B2M-上游引物5’ - CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’ ；B2M-下游引物5’ - TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體和含有B2M基因編碼序列的重組載體中的空載體均為pUC57載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、 逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。
4.一種基于權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述試劑盒檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的方法， 包括如下步驟(O從待測標(biāo)本中提取總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物 Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)分別將已知拷貝數(shù)的VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至108、107、106、 105、104、103、102、10 個拷貝數(shù) / μ 1 ;(3)分別以步驟(1)所制備的待測cDNA及步驟(2)倍比稀釋的VEGFR2基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入內(nèi)對照Β2Μ基因標(biāo)準(zhǔn)品，檢測VEGFR2基因的上、下游引物，檢測內(nèi)對照Β2Μ基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR ；(4)根據(jù)倍比稀釋的VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制VEGFR2和內(nèi)對照B2M基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的VEGFR2基因和內(nèi)對照B2M基因的初始拷貝數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件為95°C 預(yù)變性3分鐘，然后95°C變性30秒、57°C退火40秒，共38個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測VEGFR2 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒及方法。該試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系。通過該方法能準(zhǔn)確、快速、定量地確定VEGFR2基因表達(dá)量。本發(fā)明所述方法和試劑盒應(yīng)用在臨床中，有利于醫(yī)生合理化選擇血管生成抑制劑靶向藥物(舒尼替尼、索拉非尼、貝伐單抗等)進(jìn)行治療。
文檔編號C12Q1/68GK102994640SQ20121053450
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者郭成賢, 張偉, 陳小平, 劉昭前, 周宏灝 申請人:周宏灝