檢測aml1-eto融合基因相對表達(dá)量的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測AML1-ETO融合基因相對表達(dá)量的引物，包括（1）檢測目的基因用上下游引物AML1-ETO-F，AML1-ETO-R，探針AML1-ETO-Probe，和（2）檢測內(nèi)參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe。本發(fā)明還公開檢測AML1-ETO融合基因相對表達(dá)量的方法，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。
【專利說明】檢測AML1-ET0融合基因相對表達(dá)量的引物和方法
[0001]本申請是申請?zhí)枮?01210174382.0、申請日2012年5月30日的中國專利申請的
分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)θ祟惣毙运柘蛋籽?acute myeloid leukemia, AML)患者體內(nèi)AMLl-ETO融合基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，可有效的節(jié)約檢測時間，提高檢測精度。
【背景技術(shù)】
[0003]在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中染色體易位很常見，其中某些易位與AML的亞型有特異性的聯(lián)系。在AML中t(8 ；21) (q22 ；q22)是最常見的染色體異常之一，可見于近40%的AML-M2亞型患者和8%~20%的原發(fā)AML患者。該易位導(dǎo)致21號染色體的AMLl基因(acutemyeloblastic leukemia one gene)和8號染色體的ETO基因(eight twenty-one gene，也稱為 MTG8 基因)融合，形成 AML1-ET0 和 ET0-AML1 融合基因。由于后者不能通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測到，一般認(rèn)為其表達(dá)量極低或者由于降解導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定。故現(xiàn)階段的研究多集中AML1-ET0融合基因。AML1-ET0融合蛋白全長含有 752 個氨基酸,其 N 端為 RUNXl (runt-related transcription factor I),也稱為AMLl、CBFct2或者PEBP2ctB區(qū)，含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域；C端為8號染色體編碼的RUNXlTl[runt-related transcription factor I ;tran_located to,I(cyclin D-related)],也稱為ETO(eight-twenty-one)。文獻(xiàn)報道12% -20%的急性髓系白血病(AML)存在t (8 ；21) (q22 ；q22)染色體易位，尤其在AML-M2，其發(fā)生率可高達(dá)40% -80 %。研究證實(shí)，全長的AML1-ET0融合蛋白在小鼠動物實(shí)驗(yàn)中并無致白血病作用，而C末端截短倒位的融合蛋白(AMLl-ETOtr)卻高度致白血病。Lancet等鑒定出一種具有選擇性的剪接變構(gòu)體AML1-ET0，它含有ETO外顯子9a，產(chǎn)生的AMLl-ET09a融合蛋白幾乎與AMLl-ETOtr完全相同，也有較強(qiáng)的致白血病作用。盡管目前為止尚未發(fā)現(xiàn)新的與AML1-ET0相同的結(jié)合位點(diǎn)，但與AMLl相t匕，AMLl ETO能夠優(yōu)先與包含重復(fù)的AMLl相同位點(diǎn)的DNA序列相結(jié)合，說明AML1-ET0融合蛋白具有優(yōu)先選擇具有多聚化AMLl相同位點(diǎn)的AMLl靶基因，可能是其阻斷正常血細(xì)胞生成、促進(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制之一。
[0004]有研究報道，融合蛋白AML1-ET0并非通過單一通路導(dǎo)致白血病的發(fā)生，它的作用可能是通過多方面、多因素、多步驟的影響，或者類似于信號通路級聯(lián)放大作用，從而觸動急性白血病的猝發(fā)。但染色體易位產(chǎn)生融合基因AML1-ET0是白血病發(fā)生的一個重要始動因素，沒有它也就沒有下游基因或染色體改變事件，因而也不會有白血病的發(fā)生。因而，對AML1-ET0融合基因進(jìn)行定量監(jiān)測，是判斷和追蹤該基因陽性的白血病患者療效的良好指標(biāo)，可以較好地反映患者微小殘留病的動態(tài)變化。 [0005]目前臨床上已經(jīng)將AML1-ET0融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預(yù)后的手段之一。常用的檢測技術(shù)有熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法盡管結(jié)果較為直觀，但是試驗(yàn)過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費(fèi)時費(fèi)力，且結(jié)果需經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人士來判讀，結(jié)果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點(diǎn)定量，無法對起始模板量進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。此外，由于砷劑及全反式維甲酸的應(yīng)用，APL治療效果得到很大的提高，微小殘留病是其復(fù)發(fā)的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對AMLl-ETO融合基因mRNA殘留進(jìn)行檢測。
[0006]RQ-PCR米用Taqman探針突光定量技術(shù),綜合生物學(xué)、酶學(xué)和突光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結(jié)果用拷貝數(shù)表示，實(shí)現(xiàn)了對PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，與定性PCR技術(shù)相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關(guān)系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優(yōu)點(diǎn)。能夠滿足AMLl-ETO融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認(rèn)為是目前首選檢測方法，用于評價治療效果、預(yù)測預(yù)后。實(shí)時熒光定量PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術(shù)等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本發(fā)明采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應(yīng)用于AMLl-ETO的基因檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測AMLl-ETO融合基因的不足，本發(fā)明設(shè)計了檢測內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術(shù)檢測白血病AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量。通過調(diào)整兩個基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，開發(fā)了一種用于檢測白血病AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量的試劑盒。
[0008]用于檢測AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、TRIzol,氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于:`
檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物AML1-ETO-F, AML1-ETO-R，探針 AML1-ETO-Probe，檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物 abl_F，abl_R，探針 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0009]進(jìn)一步地，檢測用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為:AML1-ET0-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩爾比為 2: 2:1。
[0010]參照用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為:于abl-F: abl-R: abl-Probe的摩爾比為2:2:1。
[0011]所述陽性對照品為含有AMLl-ETO基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl-ETO基因的溶液。[0012]其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為TOYOBO公司生產(chǎn)的qPCR用cDNA試劑盒產(chǎn)
品O
[0013]THUNDERBIRD qPCR MIX為TOYOBO公司生產(chǎn)的定量PCR試劑，產(chǎn)品規(guī)格為QPS-101。
[0014]使用本發(fā)明的試劑盒，將實(shí)時熒光PCR技術(shù)結(jié)合采用Tapman探針，可以對AML1-ET0)融合基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過構(gòu)建AMLl-ETO和內(nèi)參基因abl的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，精確定量樣本的內(nèi)參基因拷貝數(shù)和AMLl-ETO拷貝數(shù)，相比于以往的免疫組化方法和現(xiàn)今的ΔΔ CT法，該試劑盒具有精度高，結(jié)果便于判讀等優(yōu)點(diǎn)。加之該試劑盒將反應(yīng)體系所需的引物、探針進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使擴(kuò)增效率和速率等實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。該試劑盒經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助于臨床上急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者體內(nèi)AMLl-ETO融合基因的微量殘留檢測，對于及時干預(yù)治療避免血液學(xué)復(fù)發(fā)、調(diào)整治療方案、評價治療效果、預(yù)測預(yù)后、預(yù)防臨床復(fù)發(fā)都具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:AML1-ET0型陽性結(jié)果示意圖。
[0016]圖2:AML1-ET0型陰性結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
本發(fā)明的用于檢測AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量的試劑盒，包括:
紅細(xì)胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
無水乙醇；
ReverTra Ace qPCR RT Kit (Τ0Υ0Β0 公司)；
檢測體系PCR反應(yīng)液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、檢測目的基因用上下游引物 AML1-ETO-F,AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AMLl-ET0_Probe (探針)0.4 uM ;檢測內(nèi)參基因 Abl用上下游引物 abl-F, abl-R 各 0.8uM、abl-probe (探針)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0018]陽性對照品:含有AML1-ET0基因的溶液；
陰性對照品:不含AML1-ET0基因的溶液。
[0019]實(shí)施 例2
本發(fā)明試劑盒的使用方法:(I)抽提血液中的組織RNA:在潔凈的1.5ml的離心管中加入Iml紅細(xì)胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細(xì)胞；再次加入0.5ml紅細(xì)胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細(xì)胞；向細(xì)胞中加入ImlTRIzol，反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0.2ml氯仿，震蕩均勻；HOOOrpm40C離心lOmin，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。
[0020](2)參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)為 cDNA。
[0021](3)試劑配置:按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各X ul，每人份23ul分裝: X=23ul反應(yīng)液X (8份內(nèi)參(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+8份目的基因(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+η份標(biāo)本+1份陽
性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
(4)加樣:加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0022](5)檢測:檢測在實(shí)時熒光PCR儀上進(jìn)行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環(huán)，突光信號于58°C 35 sec時米集。
[0023](6)結(jié)果判斷:將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴(kuò)增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值自動計算出拷貝數(shù)。
`[0024]I)內(nèi)參陽性時，檢測結(jié)果才認(rèn)為有效；
2)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):，Ct〈36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗(yàn)證；Ct >38，為陰性。
[0025]實(shí)施例3
采用本發(fā)明核酸檢測試劑盒檢測臨床標(biāo)本
取送檢的急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者抗凝血標(biāo)本共80例，按實(shí)施例2所述方法提取基因組RNA、配制試劑并檢測。
[0026]每份標(biāo)本加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內(nèi)參基因/目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重復(fù)，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。
[0027]實(shí)驗(yàn)結(jié)果與特檢實(shí)驗(yàn)室的報告結(jié)果相比較，確定樣品檢測的準(zhǔn)確率。部分陽性結(jié)果如下表:
【權(quán)利要求】
1.檢測AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量的引物，其特征在于:所述引物包括(I)檢測目的基因用上下游引物AML1-ET0-F，AML1-ET0-R,探針AML1-ETO-Probe，和(2)檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物 abl-F，abl_R，探針 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于AMLl-ETO-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩爾比為 2: 2:1。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于abl-F: abl-R: abl-Probe的摩爾比為2:2: 10
4.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于所述陽性對照品為含有AMLl-ETO基因的溶液；所述陰性對照品為無 AMLl-ETO基因的溶液。
5.檢測AMLl-ETO融合基因相對表達(dá)量的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)抽提血液中的組織RNA； (2)將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA； (3)試劑配置:檢測體系PCR反應(yīng)液:THUNDERBIRDProbe qPCR Mix (2X)、檢測目的基因用上下游引物 AML1-ET0-F，AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AML1-ΕΤΟ-Probe (探針)0.4 uM ;檢測內(nèi)參基因Abl用上下游引物abl-F，abl-R各0.8uM、abl-probe (探針)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ； 陽性對照品:含有AML1-ET0基因的溶液； 陰性對照品:不含AML1-ET0基因的溶液； (4)加樣:加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ulcDNA;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)； (5)檢測:檢測在實(shí)時熒光PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性Imin；95°C 15s，58°C35sec 40個循環(huán)，熒光信號于58°C 35 sec時采集； (6)結(jié)果判斷。
【文檔編號】C12N15/11GK103805698SQ201410031099
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月30日
【發(fā)明者】周曉犢, 王淑一, 徐建成 申請人:北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司