經(jīng)優(yōu)化的hil-17ra-hsa融合基因編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和長(zhǎng)效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及密碼 子優(yōu)化型的H比-17RA-服A融合基因及其編碼蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 白介素17(1111646址111-17，比-17)及其受體（比-17^6。巧1〇'，比-17^)家 族是一類(lèi)獨(dú)特的免疫分子-受體家族，在機(jī)體自免疫、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及器官移植 反應(yīng)過(guò)程中有重要作用（J.KKolls,A.Linden,Interleukin-ITfamilymembersand inflammation.Immunity21 (4) (2004) 467 ；T.A.Moseley,etal.Interleukin-ITfamily andlX-17receptors.切tokineGrowthFactorRevl4(2)(2003) 15f5)。]X-17A可W刺激多 種組織細(xì)胞釋放趨化因子，W吸引中性粒細(xì)胞到炎癥反應(yīng)區(qū)域（M.Laan,etal.Neutrophil recruitmentbyhumanIL-ITviaC-X-Cchemokinereleaseintheairways. J.Immunol. 162(4)(1999) 2347 ；J.Witowski,etal.IL-ITstimulatesintraperitoneal neutrophilinfiltrationthroughthereleaseofGROalphachemokinefrom mesothelialcells.J.Immunol. 165(10) (2000)5814.)為此，利用IL-17A的特異性受體 (比-17RAA)來(lái)阻斷比-17A的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的是研制治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的 熱點(diǎn)。
[0003]由于很多細(xì)胞因子類(lèi)藥物的分子量較小，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)易被腎小球?yàn)V過(guò)而排出體 夕K藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的不佳嚴(yán)重的阻礙了送些細(xì)胞因子作為藥物的開(kāi)發(fā)前景。蛋白融 合技術(shù)是指將另一個(gè)蛋白或一個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)域融合到基因工程藥物上，使得該藥物的在 體內(nèi)作用的半壽期延長(zhǎng)。
[0004] 人血清白蛋白化umanseruma化uminHSA)是血漿中的主要蛋白成分在血 漿中的濃度為 40mg/ml〇%illipP.Min曲ettisetal.，T肥JOURNALOFBIOLOGICAL CHEMISTRY, 1986261:6747-6757)，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結(jié)合內(nèi)源性和 /或外源性配體，包括激素、有毒代謝產(chǎn)物、藥物等。通過(guò)結(jié)合送些配體，HSA可W調(diào)節(jié)激素 活性、內(nèi)源性和1或外源性物質(zhì)的毒性和藥物的利用度Qi-SookHaetal.，Biochimica etBio地ysicaActa, 2003640:119-128)。細(xì)胞中剛翻譯出來(lái)的人血清白蛋白具有典型的 pre-pro-protein結(jié)構(gòu)，包括18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)膚和6個(gè)氨基酸殘基前膚的原膚。信 號(hào)膚和前膚在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的過(guò)程中被切除，成熟的HSA由585個(gè)氨基酸殘基組成，含有17 對(duì)二硫鍵，分子量約為66. 5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白。HSA的分子量相對(duì)較 大，在正常情況下，不易被腎小球?yàn)V過(guò)，其血漿半衰期在20天左右。因此WHSA為載體的融 合蛋白技術(shù)一白蛋白融合技術(shù)（A化umin化Siontechnology)倍受關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的IL-17RA與人血清白蛋白的融合蛋白 的制備方法及產(chǎn)品。本發(fā)明的融合蛋白在保持了H比-17RA的生理特性的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)其在 體內(nèi)的半衰期，作為基因工程抗體藥物治療與IL-17信號(hào)途經(jīng)有關(guān)的疾病，在藥學(xué)領(lǐng)域有 良好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的；一種優(yōu)化的H比-17RA-服A基因，其核巧 酸序列如SEQIDNO: 1所示。具體為密碼子優(yōu)化型人白介素-17受體化IL-17RA)與人血 清白蛋白化SA)通過(guò)連接短膚（linker)連接而成，linker的作用是連接兩個(gè)蛋白，使其空 間構(gòu)象不發(fā)生改變。
[0007] 本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化型的HIkl7RA-服A融合基因，該融合基因中使用 的密碼子為大腸桿菌基因中使用頻率最高或次高的密碼子。該融合基因能夠高表達(dá)于大 腸桿菌細(xì)胞。本研究對(duì)HIkl7RA-HSA基因進(jìn)行優(yōu)化的時(shí)候兼顧W下幾個(gè)方面；盡量使用 偏好密碼子，W提高mRNA的翻譯效率；降低GC含量，調(diào)整基因AT含量，防止提前終止；去 除HIkl7RA-HSA基因中影響mRNA有效翻譯和穩(wěn)定性的二級(jí)結(jié)構(gòu)；除去使mRNA不穩(wěn)定和 降解的序列和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化后的基因在大腸桿菌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均高 于其原始基因序列。優(yōu)化后的H比-17RA-服A基因片段核巧酸序列與原序列比對(duì)相似性為 77. 3%，933個(gè)氨基酸中有562個(gè)氨基酸的密碼子得到優(yōu)化，優(yōu)化率達(dá)到60%。
[000引一種H比-17RA-服A的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是由優(yōu)化的H比-17RA-服A基因插入 到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。所述出發(fā)載體優(yōu)選原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體 祀T30a。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)化的H比-17RA-服A基因在制備阻斷比-17炎癥性通路藥物W及融合 蛋白的藥物組合物中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1顯示了優(yōu)化后H比-17RA-服A基因與優(yōu)化前的CAI值。
[0011] 圖2顯示了優(yōu)化后H比-17RA-服A基因與優(yōu)化前的GC含量。
[0012] 圖3顯示了本發(fā)明實(shí)施例2所述的T載體質(zhì)粒圖譜。
[0013] 圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施例2所述的表達(dá)載體質(zhì)粒酶切圖譜，1道為祀T30a/ H比-17RA-服A質(zhì)粒，2道為祀T30a/HIkl7RA-服A質(zhì)粒經(jīng)甜al/HimdIII雙酶切的產(chǎn)物，M道 為邸ladder。
[0014] 圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例3所述的SDS-PAGE電泳圖，考馬斯亮藍(lán)染色。其中，M道 為蛋白marker;NC道為未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液；1道為15°C下誘導(dǎo)16小時(shí)細(xì)胞裂解液；2道為 37C下誘導(dǎo)4小時(shí)細(xì)胞裂解液；
[0015] NCi道為未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液上清；NCz道為未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液沉淀；3道為15C下 誘導(dǎo)16小時(shí)細(xì)胞裂解液上清；4道為15C下誘導(dǎo)16小時(shí)細(xì)胞裂解液沉淀；5道為37C下誘 導(dǎo)4小時(shí)細(xì)胞裂解液上清；6道為37C下誘導(dǎo)4小時(shí)細(xì)胞裂解液沉淀。
[0016] 圖6顯示了本發(fā)明實(shí)施例3所述的融合蛋白檢測(cè)Westernblot分析，抗His標(biāo)簽 抗體。M道為EasyWesternmarker;1道為15°C下誘導(dǎo)16小時(shí)細(xì)胞裂解液；2道為37°C下 誘導(dǎo)4小時(shí)細(xì)胞裂解液；4道為15C下誘導(dǎo)16小時(shí)細(xì)胞裂解液沉淀；5道為37C下誘導(dǎo)4 小時(shí)細(xì)胞裂解液上清；6道為37C下誘導(dǎo)4小時(shí)細(xì)胞裂解液沉淀。
[0017] 圖7顯示了本發(fā)明實(shí)施例4HIkl7RA-服A表達(dá)的目標(biāo)蛋白，Ni柱純化。組分由 SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色。M道為蛋白marker;1道為50mMTris-HCl,SMUrea,P冊(cè).0 溶解離必后上清；2道為流出液；3-4道為50mMTris-肥1，8MUrea, 20mM咪哇，P冊(cè).O洗脫； 5-7 道為 50mMTris-肥 1，8M化ea，50mM咪哇，抑8.O洗脫；8-11 道為 50mMTris-肥 1，8M Urea, 250mM咪哇，P冊(cè).O洗脫。
[0018] 圖8顯示了本發(fā)明實(shí)施例4HIkl7RA-服A表達(dá)的目標(biāo)蛋白二次Ni柱純化圖。組 分由SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色。M道為蛋白marker;1道為流出液；2-3道為50mM Tris-肥 1，8MUreaJOmM咪哇，P冊(cè).0 洗脫；4-6 道為 50mMTris-肥 1，8MUreaJOmM咪哇， P冊(cè).0 洗脫；7-11 道為 50mMTris-肥 1，8MUrea，50mM咪哇，P冊(cè).0 洗脫。
[0019] 圖9示了本發(fā)明實(shí)施例5濃度定量分析一BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于利用計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)分析了HIkl7RA-HSA氨基酸序列。分析 結(jié)果顯示HIkl7RA-服A的序列中包含大量大腸桿菌稀有密碼子W及稀有密碼子串聯(lián)序 列。基于送一發(fā)現(xiàn)，我們?cè)趦?yōu)化的HIkl7RA-服A序列中選擇了大腸桿菌偏愛(ài)密碼子W及打 破串聯(lián)結(jié)構(gòu)。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)新的融合蛋白有效地提高了H比-17RA-服A基因的表達(dá)產(chǎn)量。 [00川材料
[0022] 全基因合成2799bp基因片段H比-17RA-服A W甜al/Himdlll酶切位點(diǎn)融入祀T30a 表達(dá)載體，其中第1-24位核巧酸為化Stag,第25-981位為H比-17RA，第982-1027位為氨 基酸Iinker(GlyzSer)S,第1028-2799位為HSA，全基因優(yōu)化及合成由南京金斯瑞