海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用，特別涉及 麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用，屬于基 因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖是一種普遍存在的非還原性雙糖，由葡萄糖通過(guò)a -1，1糖苷鍵連接，其中 a，a -1，1-海藻糖目前已被分離，并被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中。天然的海藻 糖對(duì)生物體或生物大分子具有較好的且非特異性的保護(hù)作用，可以使得具備海藻糖的生物 體能夠度過(guò)饑餓、干燥、低溫、高溫、輻射等惡劣環(huán)境。隨著對(duì)海藻糖認(rèn)知程度的增加，海藻 糖在各方面的應(yīng)用不斷得到拓展，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛推廣。
[0003] 目前海藻糖的生產(chǎn)工藝主要有三種：
[0004] (1)提取法
[0005] 提取法主要通過(guò)培養(yǎng)海藻糖含量較高天然生物來(lái)獲取，目前主要的提取對(duì)象為酵 母（海藻糖含量約占酵母干重的15% )，但由于海藻糖屬于酵母內(nèi)容物，提取時(shí)需要進(jìn)行復(fù) 制的破壁及分離提取工藝，因此目前逐漸被酶法制備海藻糖法取代。
[0006] (2)單酶法
[0007] 單酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化麥芽 糖生產(chǎn)海藻糖的工藝。海藻糖合酶能夠?qū)，a-1，4-糖苷鍵連接的麥芽糖直接轉(zhuǎn)化為 a，a -1，1-糖苷鍵連接的海藻糖，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)不需要磷酸鹽的存在，不需要消耗高能物質(zhì)， 但該方法所采用的酶熱穩(wěn)定性一般較低，且轉(zhuǎn)化率多為60%左右，另外由于該酶同時(shí)具有 輕微的水解活性，因此單酶法轉(zhuǎn)化過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生少量副產(chǎn)物的葡萄糖。
[0008] (3)雙酶法
[0009] 雙酶法在1991年由Lama等人首次報(bào)道，即采用麥芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)兩種酶利用淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖的方 法。該方法中第一種酶用來(lái)催化聚合度（DP)大于3的麥芽糊精，轉(zhuǎn)化其還原端的a-1，4 連接鍵生成a-1，1連接鍵。第二種酶專一性催化水解a-1，4鍵生成的a-1，1鍵海藻糖 和低分子量的麥芽低聚糖。目前雙酶法多數(shù)以還原性淀粉為原料，轉(zhuǎn)化率多為70-80%左 右，因此較單酶法相比更為經(jīng)濟(jì)，除能夠生產(chǎn)海藻糖之外，還可以同時(shí)產(chǎn)生具有較高附加值 的麥芽三糖，因此該工藝路線已被用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0010] 雖然雙酶法具有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但依然存在不足之處：雙酶法轉(zhuǎn)化所用兩種酶需 要分別進(jìn)行發(fā)酵及純化才能獲取，因此酶的生產(chǎn)成本明顯高于單酶法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖 水解酶融合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0013] 麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表達(dá)基因，核苷酸 序列如SEQ ID N0:1所示。
[0014] 麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] -種重組載體，在質(zhì)粒中插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述質(zhì)粒為pPIC3. 5K載體質(zhì)粒或pPIC9K載體質(zhì)粒。
[0017] -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化有上述重組載體。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。
[0019] 上述麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表達(dá)基因、重 組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合 酶中的應(yīng)用。
[0020] 上述麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表達(dá)基因在 制備海藻糖與麥芽三糖中的應(yīng)用。
[0021] 有益效果
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1、本發(fā)明采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種新穎的麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽 寡糖基海藻糖水解酶融合酶，所述融合酶同時(shí)具有麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基 海藻糖水解酶兩種酶的活性，與傳統(tǒng)雙酶法相比有效的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
[0024] 2、本發(fā)明所獲得的融合酶融合后的比酶活分別為147. 4U/mg和160. lU/mg，活性 配比合理，與傳統(tǒng)雙酶法相比無(wú)需再考慮兩種酶的配比即可實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化，因此本發(fā)明所 生產(chǎn)的融合酶在使用時(shí)更為簡(jiǎn)便。
[0025] 3、由于麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的作用底物為麥芽寡糖基海藻糖合成酶 的產(chǎn)物，因此兩種酶的融合使得麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶接觸底物發(fā)揮作用的時(shí)間 大大縮短，在相同條件下使用融合酶反應(yīng)僅20小時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率即可達(dá)到85. 3%，較傳統(tǒng) 雙酶法相比節(jié)約了近4小時(shí)，能夠有效節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間，降低成本，減少染菌概率，因此更適 合工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0026] 4、本發(fā)明采用畢赤酵母作為融合酶的生產(chǎn)菌株，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比能夠有 效避免內(nèi)毒素的污染，具有更高的安全性，因此本發(fā)明所生產(chǎn)的海藻糖更適合應(yīng)用于食品 行業(yè)。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因PCR構(gòu)建結(jié) 果；
[0028]圖中：M、marker，1 和 2、PCR 產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面的實(shí)施例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0030] 實(shí)施例1 :Arthrobacter sp?基因組總DNA的提取。
[0031 ] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量篩選，在山東濟(jì)南市郊區(qū)一被污染的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)一株氧化節(jié) 桿菌（Arthrobacter sp. )QYW623,其發(fā)酵液同時(shí)具有較高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥 芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶活性，并且純化后兩種酶的比酶活性比較接近，最適溫度均 在55°C左右，在5. 0-5. 8之間均具有較高的催化活性（殘余酶活> 85% )，經(jīng)對(duì)該菌中存在 的麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)兩種酶的 基因序列與Arthrobacter sp.L77基因組（NZ_JWSU00000000. 1)中相應(yīng)酶的基因序列較為 接近，序列一致性均大于99%，但尚未有人對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。
[0032] 將_80°C下保存的氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.) QYW623菌株接種至LB液體培 養(yǎng)基（蛋白胨l〇g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中活化培養(yǎng)48小時(shí)，其后按