本發(fā)明涉及一種鈣螯合肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，屬于生物技術領域。
背景技術：
微藻生物被聯(lián)合國糧農組織確定為21世紀綠色健康食品，微藻不僅營養(yǎng)成分豐富，而且有優(yōu)良的醫(yī)療保健作用。裂殖壺菌屬于微藻源生物，其含有豐富的蛋白質，在這些蛋白質中富含能提供配位鍵的谷氨酸和天冬氨酸，可以有效的作為鈣離子配體與鈣元素形成螯合物，在補充微量元素的同時，又能充分利用高營養(yǎng)價值的裂殖壺菌蛋白。
目前，鈣缺失是全球性的營養(yǎng)問題。近幾年來，隨著補鈣試劑迅猛發(fā)展，銷量逐年上升，但是人們的缺鈣狀況并沒有從根本上得到改善，其主要原因是在于鈣的生物利用度較低。我國的膳食組成只要是植物性食物，而植物中的草酸、磷酸和植酸等成分容易在腸道中鈣離子結合形成難溶性的草酸鹽、磷酸鹽和植酸鹽，從而降低機體內鈣的生物利用度。此外，有些無機鈣需依賴胃酸分解，這對于某些胃酸分泌異常的人群來說鈣的生物利用度則就更低了。因此，除了開發(fā)補鈣產品外，提高鈣的生物利用度也是解決鈣缺失的關鍵方法之一。隨著科學研究的深入，有報道表明，多肽-鈣螯合物具有獨特的螯合體制與轉運機制，比起氨基酸螯合鈣更易于被人體吸收轉運。肽鈣螯合物結構穩(wěn)定，進入胃腸道后可以避免受食物中的植酸和草酸對鈣離子的沉淀和吸附；同時機體對肽鈣螯合物的吸收是通過肽的吸收通道而不是鈣離子吸收通道，因此可以避免與其他被吸收的鈣離子的拮抗競爭，從而提高鈣離子的吸收率，提高其生物利用度。由此可見，多肽-鈣螯合物的吸收率高，穩(wěn)定性好，是理想的保健品添加物。
因此，如何獲得具有鈣螯合活性的肽，就成為制備新型微量鈣元素補充劑亟需的研究方向。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，使鈣螯合活性得以高效地實現。
為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
一種鈣螯合肽，所述肽的氨基酸序列為：YL。
一種鈣螯合肽的制備方法，以裂殖壺菌粕蛋白為原料，采用堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶對其進行分步酶解，分離純化、冷凍干燥得到鈣螯合肽。
所述的第一步酶解條件為：最適酶為堿性蛋白酶，時間為8 h，pH為9，酶底比為10wt.%，底物濃度為1wt.%。所述的第二步酶解條件為：最適酶為復合風味蛋白酶，酶底比為10 wt.%，溫度為40℃，pH為6，時間為3 h 50 min。
所述分離純化的具體步驟為：酶解產物首先利用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測定；收集具有最高鈣螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，反相HPLC的分離條件是用體積分數為0-40%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為2 mL/min，收集洗脫峰，冷凍干燥得到所述的鈣螯合肽。
本發(fā)明立足于多肽具備與鈣離子螯合的作用位點，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-鈣螯合物具有獨特的螯合體制和轉運機制，易被吸收、可同時補充氨基酸和鈣的理論基礎，以來自于海洋源的裂殖壺菌粕蛋白為原材料，通過堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶分步酶解的切割條件控制，切割制備具有高鈣螯合活性的肽，而使鈣螯合活性得以高效地實現。本發(fā)明為裂殖壺菌粕蛋白的應用提供了一條嶄新的思路。
附圖說明
圖1 純化裂殖壺菌粕蛋白源鈣螯合肽的RP-HPLC-C18色譜圖；其中SPH-1A為該特異性鈣螯合肽的色譜峰。
具體實施方式
實施例1
采用的儀器、檢測手段如下：
本技術所采用的裂殖壺菌粕，由福建省水產研究所提供，酶購自諾維信生物技術有限公司（中國·天津）。首先進行裂殖壺菌粕蛋白的提取，使用中藥粉碎機處理裂殖壺菌粕，過60目篩，獲得實驗用原料。采用堿提酸沉的方法提取裂殖壺菌粕中的蛋白質。配制濃度為0.39mol/L的NaOH溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。將所獲得的樣液在4℃下以10000r/min的轉速離心20min，取上清棄沉淀。再用6mol/L HCl調節(jié)上清液中的pH值，調節(jié)pH值至3.0，對蛋白質進行酸沉。靜置30min后，在4℃下以10000r/min的轉速離心20min。最終取沉淀棄上清，冷凍干燥，然后再進一步對其酶解。
酶解工藝采用單因素實驗，第一步酶解實驗分別對五個酶解因素進行考察，分別為最適酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0.0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h），pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，酶底比（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w），底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%，w/v）。在第一步酶解的基礎上，第二步酶解實驗分別對五個酶解因素進行考察，最適酶（復合風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h），酶底比（4%、6%、8%、10%、12%，w/w），pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）。稱取一定質量裂殖壺菌蛋白溶解于蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調節(jié)至最適pH。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶底比加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再10000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對鈣螯合活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到第二步酶解中具有最大鈣螯合活性的酶解液的酶解條件是：酶底比10%、溫度40℃、pH6、時間3h50min。
本發(fā)明的制備鈣螯合肽的鈣螯合活性測定方法，采用鄰-甲酚酞比色法，測定鈣螯合肽對鈣離子的螯合作用。將1 mL 5 mmol/L的CaCl2和2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）加入具塞試管中，再加入1 mL清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37℃ 溫育2h，取出后10000 r/min常溫離心10 min。取1 mL上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻。放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值，將數值代入標準曲線中計算出可溶性鈣結合量。
標準曲線的制作：分別取標準Ca工作液（10 ug/ mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0 mL于10 mL試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻，放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值。以可溶性鈣含量（ug/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，得標準曲線公式為：y = 0.0992x - 0.0887，R2 = 0.9988。
應用Sephadex G-25分子篩、RP-HPLC反相高效液相色譜等分離純化手段，實現顯著活性的裂殖壺菌粕蛋白鈣螯合肽的高效分離純化。
稱取1.0克裂殖壺菌粕蛋白溶解于100ml 蒸餾水中，用2mol/L NaOH調節(jié)pH至9.0，加堿性蛋白酶，立即置于50℃的水浴搖床中反應8h，沸水浴滅酶10min后，立即冷卻，10000r/min離心10min，取上清得粗酶解液，用2mol/L NaOH調節(jié)pH至6.0，加復合風味蛋白酶，立即置于40℃的水浴搖床中反應3h50min，沸水浴滅酶10min，立即冷卻，10000r/min離心10min，取上清備用。
將上清液用Sepadex G-25凝膠過濾色譜（長100 cm，外徑2.0 cm）進行分離，獲得最好的鈣螯合活性的樣品利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步的分離純化。洗脫液自含100%去離子水（v/v）的混合液開始，至40%乙腈和60%水（v/v）的混合液結束，流速為2 ml/min進行梯度洗脫，收集洗脫峰，冷凍干燥得到本發(fā)明的高純度的特異性鈣鈣螯合肽，如圖1所示。SPH-1A峰為該特異性鈣螯合肽的色譜峰。
純化得到的特異性鈣螯合肽具有很高的鈣鈣螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，SPH-1A的鈣螯合力有了很大提高。
表1 純化的特異性鈣螯合肽的鈣螯合力
對純化的特異性鈣螯合肽利用ESI質譜儀((WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters Co., U.S.A)測定特異性鈣螯合肽的氨基酸序列。所述鈣螯合肽的氨基酸序列為：YL。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大學
<120> 一種鈣螯合肽及其制備方法
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
<213> 鈣螯合肽
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Tyr Leu
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