本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個單克隆抗體，具體涉及產(chǎn)生特異性抗樹鼩cd4分子抗體的雜交瘤細胞株和抗樹鼩cd4分子抗體，以及所述抗體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

樹鼩（treeshrew,tupaiabelangeri）是一種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動物，形態(tài)酷似松鼠，是靈長類動物的近親。由于樹鼩具有體型小，經(jīng)濟易得，易馴養(yǎng)，繁殖能力強，飼養(yǎng)管理成本低、對人類病毒易感等優(yōu)點，常常用于替代或減少一些非人靈長類動物的使用，所以很早就被用作靈長類目（包括人類）的疾病動物模型。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、腫瘤等疾病的研究中得到廣泛的應(yīng)用。

cd4分子作為t細胞受體識別抗原復(fù)合物，在機體免疫系統(tǒng)的抗感染免疫中起著重要作用。cd4分子主要表達于輔助性t淋巴細胞(thelpercells,th)的細胞膜上，其胞外區(qū)識別、結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體ii類分子，增強t細胞抗原受體(tcellreceptor，tcr)與mhc分子結(jié)合的穩(wěn)定性；胞內(nèi)區(qū)增強白細胞cd3轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化信號，從而參與并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的活化。cd4陽性淋巴細胞群的數(shù)量指標(biāo)是衡量機體細胞免疫情況的重要指標(biāo)。

但目前對樹鼩cd4分子方面的研究鮮有報道，且無可用的抗體來檢測樹鼩的cd4分子水平，對樹鼩動物模型通過淋巴細胞表面分子檢測分析其細胞免疫情況的評價尚屬空白，嚴(yán)重阻礙了對樹鼩這一動物模型的研究和應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗樹鼩cd4分子單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞株與應(yīng)用，本發(fā)明的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有效價高、特異性好、與天然抗原親和力強的優(yōu)勢，可用于檢測天然樹鼩淋巴細胞表面cd4分子。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種分泌抗樹鼩cd4分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心建株，保藏名稱為雜交瘤細胞株ts-cd4-38，保藏號為cctccno:c2016221，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)。

本發(fā)明還提供一種由上述雜交瘤細胞分泌的抗樹鼩cd4分子單克隆抗體。

本發(fā)明同時提供上述抗樹鼩cd4分子單克隆抗體在制備天然樹鼩淋巴細胞表面cd4分子檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

進一步，本發(fā)明提供一種天然樹鼩淋巴細胞表面cd4分子的流式細胞分析（flowcytometry）檢測試劑盒，所述的試劑盒包括用多甲藻黃素葉綠素蛋白熒光染料（percp）標(biāo)記的抗樹鼩cd4分子單克隆抗體。

進一步，本發(fā)明提供一種天然樹鼩淋巴細胞表面cd4分子的蛋白免疫印跡法（western-blot）檢測試劑，所述的試劑包括辣根過氧化物酶hrp標(biāo)記的抗樹鼩cd4分子單克隆抗體。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

本發(fā)明的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有效價高、特異性好、與天然抗原親和力強的優(yōu)勢，可用于檢測天然樹鼩淋巴細胞表面cd4分子。

基于此建立的檢測抗體，在流式細胞分析實驗中能有效識別樹鼩淋巴細胞表面的天然構(gòu)象的cd4分子，具有較好的靈敏度和特異性。數(shù)量為10⁶個的外周血淋巴細胞，使用percp標(biāo)記的上述cd4單克隆抗體可以檢測到樹鼩淋巴細胞表面cd4⁺的細胞百分比約為33.8%。

基于此建立的樹鼩cd4蛋白的western-blot檢測試劑，可用于分析樹鼩外周血淋巴細胞表面cd4分子的表達情況，應(yīng)用hrp標(biāo)記的上述cd4單克隆抗體，最低可以檢測到0.5ug的樹鼩淋巴細胞裂解蛋白樣品可見清晰的cd4分子免疫印跡條帶。

附圖說明

圖1為his標(biāo)簽和樹鼩cd4融合蛋白his-tscd4的表達純化sds-page電泳圖，其中1為蛋白分子量marker，2為重組蛋白his-tscd4超濾濃縮后的樣品；3位重組蛋白his-tscd4洗脫后的樣品；

圖2為gst標(biāo)簽和樹鼩cd4融合蛋白gst-tscd4的表達純化sds-page電泳圖，其中1為蛋白分子量marker，2為表達重組蛋白gst-tscd4大腸桿菌菌液的超聲后的上清；3為經(jīng)親和純化后的重組蛋白gst-tscd4；

圖3為純化的單克隆抗體mab-tscd4-38的sds-page電泳圖，其中1為蛋白分子量marker，2為proteina純化洗脫的mab-tscd4-38；

圖4為單克隆抗體mab-tscd4-38識別樹鼩淋巴細胞內(nèi)的cd4蛋白的western-blot圖，其中1為0.5μg樹鼩淋巴細胞裂解蛋白，2為1μg樹鼩淋巴細胞裂解蛋白；3為2μg樹鼩淋巴細胞裂解蛋白；4為4μg樹鼩淋巴細胞裂解蛋白；以β-actin為實驗內(nèi)參。

圖5為percp標(biāo)記的單克隆抗體mab-tscd4-38識別樹鼩淋巴細胞表面cd4分子的流式細胞分析圖，其中，a為未加刺激劑培養(yǎng)16小時的淋巴細胞，b為加cona刺激培養(yǎng)16小時的淋巴細胞；

本發(fā)明雜交瘤細胞株ts-cd4-38，已于2016年12月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心建株，保藏號為cctccno:c2016221，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

一、雜交瘤細胞株的建立：

(1.1)原核表達載體pgex-5x-tscd4和pet3.0-tscd4的構(gòu)建

為了在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達樹鼩的cd4分子蛋白，從樹鼩尾靜脈采外周血后用淋巴細胞分離液（購買自axis-shield）分離得到的淋巴細胞，經(jīng)trizol(天更)提取rna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄pcr（購買自寶生物）得到樹鼩cd4分子的編碼基因片段，用t4連接酶（購買自寶生物）連接到表達載體pgex-5x-1后，得到gst標(biāo)簽重組蛋白表達質(zhì)粒pgex-5x-tscd4，將樹鼩cd4分子基因連接到表達載體pet3.0后得到his標(biāo)簽的重組蛋白表達質(zhì)粒pet3.0-tscd4。其中，樹鼩cd4分子的dna序列如seqidno.1所示。

(1.2)重組蛋白gst-tscd4和his-tscd4的表達

將質(zhì)粒pgex-5x-tscd4和pet3.0-tscd4轉(zhuǎn)化入原核表達宿主菌bl21中，37℃誘導(dǎo)表達3小時后，8000轉(zhuǎn)，離心10分鐘收集菌體，用親和純化的結(jié)合緩沖液懸起后經(jīng)超聲破碎菌體，再次離心，離心條件同上，取上清液做親和純化，得到免疫動物用重組蛋白gst-tscd4（圖2）和篩選檢測用重組蛋白his-tscd4（圖1）。

（1.3）動物免疫：選擇8周齡左右的balb/c健康小鼠（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動物中心提供），原核表達的帶his標(biāo)簽的融合蛋白his-tscd4與等體積弗氏完全佐劑（第1次免疫）或弗氏不完全佐劑（第2、3次免疫）完全乳化后（所用佐劑均購買自sigma），經(jīng)背部皮下多點免疫，每只小鼠免疫蛋白量為100μg。免疫程序為分別于第1天，28天、56天進行免疫，第59天取小鼠脾臟研磨至只剩白色組織后經(jīng)70目的細胞篩網(wǎng)過濾得到小鼠脾細胞。

（1.4）飼養(yǎng)細胞的制備：選擇12周齡左右的balb/c健康小鼠（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動物中心提供）斷頸處死以后浸泡于體積濃度為75%乙醇消毒5分鐘，用無菌的剪刀剪開腹部皮膚后，緩慢剝離，暴露腹膜，用無菌注射器注射10ml預(yù)冷的質(zhì)量濃度為16%的蔗糖溶液進小鼠腹腔，輕柔按摩小鼠腹部5分鐘后再用注射器將腹腔內(nèi)液體抽取出來，此液體中含有大量的小鼠巨噬細胞，離心1000轉(zhuǎn)10分鐘后棄上清用培養(yǎng)液懸起然后計數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)液體積，使細胞濃度在10⁵個/ml左右，然后100μl每孔加入96孔板中，置于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)1-2天。

（1.5）小鼠脾細胞和sp2/0細胞的融合：取處于對數(shù)生長期的sp2/0細胞(購自atcc)與步驟（1.3）得到的小鼠脾細胞按照1∶10的細胞數(shù)量比例混和，通過聚乙二醇(peg)（購買自sigma）法以獲得雜交瘤細胞。之后將雜交瘤細胞加入步驟（1.4）得到的含有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，使用含有1×hat（購買自sigma）、20%（v/v）胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。

（1.6）雜交瘤細胞株的篩選：將步驟（1.5）獲得的雜交瘤細胞經(jīng)含1×hat、20%（v/v）胎牛血清（購買自biologicalindustries，bi）的1640培養(yǎng)基(購買自corning)培養(yǎng)10天，換含1×ht（購買自sigma）、20%（v/v）胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后，換成含20%（v/v）胎牛血清的1640普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。取雜交瘤細胞上清用包被了原核表達重組蛋白gst-tscd4蛋白的elisa板檢測抗體效價。以未融合sp2/0細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，選取檢測od值高于陰性6倍的細胞孔進行下一步的亞克隆。

（1.7）選取步驟（1.6）中96孔板上生長狀態(tài)良好且檢測od值高于陰性6倍的細胞孔，將每孔的細胞吸取至加樣槽，用含20%（v/v）胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋至20ml后，均勻加至一個96孔板，每孔200μl，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)5天后再次檢測，再次選取od值高于陰性6倍且細胞生長狀態(tài)良好的細胞孔，分克隆至另一個96孔板，如此重復(fù)三至四輪，直至整個96孔板的od都為高于陰性孔6倍。選取細胞生長狀態(tài)好的一個孔的細胞逐步擴大培養(yǎng)，并液氮凍存。

二、單克隆抗體腹水的大量制備：

將步驟（1.7）擴大培養(yǎng)得到的陽性（od值高于陰性6倍）克隆細胞腹腔注射入預(yù)先用石蠟油致敏過的10周齡balb/c健康小鼠，每只小鼠注射細胞量為10⁶-10⁷個，10-14天后收取腹水，檢測效價>1:3200的腹水樣品分裝凍存。

三、抗體的純化：

將上述步驟二所得的小鼠腹水經(jīng)proteina柱（購買自全式金）純化，得到小鼠抗樹鼩cd4的單克隆抗體mab-tscd4-38（圖3），所得單克隆抗體用超濾離心管濃縮至1mg/ml，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

四、單克隆抗體的標(biāo)記：

將上述步驟四得到的純化濃縮后的小鼠抗樹鼩cd4的單克隆抗體mab-tscd4-38用標(biāo)記試劑盒l(wèi)ightning-linkpercp（購買自innovabiosciences）按照說明書操作，標(biāo)記上熒光染料percp，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的甘油，混勻后分裝-20℃保存。

將上述步驟四得到的純化濃縮后的小鼠抗樹鼩cd4的單克隆抗體mab-tscd4-38按照hrp標(biāo)記抗體試劑盒（proteintech）說明書操作，標(biāo)記上辣根過氧化物酶hrp，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積的甘油，混勻后分裝-20℃保存。

五、本發(fā)明產(chǎn)品組分及其特征：

以原核表達系統(tǒng)表達的帶his標(biāo)簽的樹鼩cd4蛋白（his-tscd4）免疫小鼠后，獲取分泌特異性cd4單克隆抗體mab-tscd4-38陽性的細胞株ts-cd4-38，能特異性識別天然的樹鼩淋巴細胞表面cd4分子。

所述抗體應(yīng)用包括熒光染料percp標(biāo)記的單克隆抗體mab-tscd4-38，主要應(yīng)用于流式細胞分析。

所述抗體應(yīng)用還包括辣根過氧化物酶hrp標(biāo)記的的單克隆抗體mab-tscd4-38，主要應(yīng)用于免疫組化和western-blot的檢測。

其中，應(yīng)用方法如下：

①流式細胞檢測方法：

．每份取100μl從外周血分離得到的單細胞懸液，約1×10⁶個細胞；

．樣品：取一份細胞加入4μl濃度為0.5μg/μl的用熒光染料percp標(biāo)記好的抗樹鼩cd4分子單克隆抗體；

空白：取一份細胞不加用熒光染料percp標(biāo)記的抗樹鼩cd4分子單克隆抗體；

．室溫下避光反應(yīng)1-2小時；

4．每份加入1mlpbs，輕柔洗滌細胞一次，2000rpm/min離心10min，棄上清；

．每份加入300μlpbs重懸細胞，即可用流式細胞儀檢測分析。

6.結(jié)果見圖5，數(shù)量為10⁶個的外周血淋巴細胞，使用percp標(biāo)記的上述cd4單克隆抗體可以檢測到樹鼩淋巴細胞表面cd4⁺的細胞百分比約為33.8%。

②樹鼩cd4的蛋白免疫印跡werstern-blot檢測的使用方法如下：

1.樣品處理上樣與電泳

在收集的淋巴細胞蛋白樣品或是重組蛋白樣品按比例中加入5×sds-page蛋白上樣緩沖液[250mmtris-hcl（ph6.8），10％（w/v）sds，0.5％（w/v）bpb，50％（v/v）甘油，5％（w/v）β-巰基乙醇]，95℃加熱5分鐘，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到sds-page膠加樣孔內(nèi)即可。80v25分鐘，150v60分鐘電泳。

2.轉(zhuǎn)膜(transfer)

使用半干轉(zhuǎn)膜裝置(bio-rad)，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為100ma，轉(zhuǎn)膜時間為45分鐘，按照轉(zhuǎn)膜儀的說明書，將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)印至pvdf膜（購買自millipore）上。

3.封閉(blocking)

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把轉(zhuǎn)膜完成的pvdf膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的5%（w/v）脫脂奶粉的tbs[20mmtris-hcl，500mmnacl（ph7.5）]中，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。

4.一抗孵育(primaryantibodyincubation)

將hrp標(biāo)記的mab-tscd4-38（500μg/ml）按照1:1000體積比用tbs稀釋，和封閉完成后的pvdf膜在側(cè)擺搖床上緩慢搖動室溫孵育一小時。

5.洗膜

棄一抗稀釋液，將一抗孵育好的膜置于洗膜盒（購買自millipore）內(nèi),加入10ml洗膜液tbst[20mmtris-hcl，500mmnacl（ph7.5）,0.01%tween-20(v/v）]10ml，在側(cè)擺搖床上搖動，10分鐘后換新的tbst，重復(fù)4次；

6.蛋白檢測(detectionofproteins)

按照說明書加入ecl（購買自millipore）試劑，在暗室壓片，經(jīng)顯影液定影液進行洗片。結(jié)果如圖4，最低可以檢測到0.5ug的樹鼩淋巴細胞裂解蛋白樣品可見清晰的cd4分子免疫印跡條帶。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

seqidno.1

aaggaggtcgtactgagcagagcaggggacactgtggatttgccgtgcacggcttctgag60

aagaagtacgcgttcttcaattggaaatacccgaaccagaccaagatcctggggaaccag120

agccccatctccacgtggactataggtctctcctggctagcaaagaaggttgaatctaaa180

aaaggccagtgggaacacgggtccttccccctggtcatcaaggaggctgaggtgaaagac240

tccgggacttacatctgtgaagtggagggcgcgaagaaagaggtggagttgctggtgttc300

cgactgaccgccagcgcagaccgggtgctgcagggccagagcctgaccctgaccttggag360

agcccggttggcagtaaccctttagtgcagtggaagagtccagggaacagaaaccaaaac420

accggcaaggccttcacggtgacccagatggggacccaggaaagtggcacctggacgtgc480

accgtctcccaggaccagaggaccctggtgttcaagaaaaacatcgtcatgctgggtttc540

cagaaggcctcgatgacactctataagaaagagggagagcgggtggacctctccttccct600

ctcaccttcgaggacgaacacctgcgtggggagctgcggtggcaggcagagcggcccccc660

tcctccgagtcctgggtctccttctccgtacaggccaaggaggtgactgtgcaggggtcc720

ctcccggatctcaagctccagatggccaaaagcctcccactcagcatcaccctgccccag780

gcccacctgcggcacgccggctccgggaagctgaccttgactctcggcaaggggcagctg840

cagcaggacgtgaaccttgtggtgatggcagtgactcagctccagagtaagctgacctgc900

gaggtgctgggccccacgctccccacgctgacgctgagctggaagctgaagaatgagtca960

aaggtctcaaagcaggagaaggcggtgtggctgctggaccccgaggcagggatgtgggag1020

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ctggtcacccagagctggcaaaccacactgatcgtggcggtgggagccgcggcgggcctg1140

ctgtgtatcggtctctgcgctttctgctgcgtcaagtgccggcaccgacggcgccaggca1200

gagcggatgtctcagatcaagaggctcctcagtgagaagaagacctgccagtgctcccac1260

aggtttcagaagacatgtagtctcatgtga1290

sequencelisting

<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

<120>抗樹鼩cd4分子單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞株與應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1290

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaggaggtcgtactgagcagagcaggggacactgtggatttgccgtgcacggcttctgag60

aagaagtacgcgttcttcaattggaaatacccgaaccagaccaagatcctggggaaccag120

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