本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種牛粒細胞集落刺激因子工程菌的高密度發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，許多有重要應(yīng)用價值卻又難以直接合成的蛋白質(zhì)已經(jīng)在多種表達系統(tǒng)中得到表達。在眾多的基因工程表達系統(tǒng)中，由于大腸桿菌(escherichiacoli)結(jié)構(gòu)簡單、遺傳學(xué)背景清晰、容易培養(yǎng)、生長周期短，生長條件清楚，成為最常用的宿主菌，目前已成為最為常用的原核表達系統(tǒng)，許多有價值的重組蛋白都在大腸桿菌中獲得了表達。

利用一般的發(fā)酵工藝生產(chǎn)大腸桿菌或以其構(gòu)建的基因工程菌的表達產(chǎn)物，大腸桿菌的生物量、蛋白表達量、代謝產(chǎn)物在菌體內(nèi)和發(fā)酵液中的濃度都比較低，難以獲得理想的生產(chǎn)效率。近年來，隨著大腸桿菌基因重組技術(shù)與大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)的結(jié)合，使得原來無法獲得的許多天然蛋白能夠大量生產(chǎn)，如集落刺激因子、干擾素、氨基酸等的生產(chǎn)。

高細胞密度發(fā)酵(highcelldensitycultivation，hcdc)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細胞量，由此更多地或更高效地獲得目的產(chǎn)物。即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)。實現(xiàn)高密度發(fā)酵不僅可以減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成本。

重組大腸桿菌進行高密度發(fā)酵可獲得較高的生物量，但對發(fā)酵條件有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多，如細胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)方式、發(fā)酵液的ph值、補料方式及發(fā)酵液流變學(xué)特性等。

因此，對于重組大腸桿菌的發(fā)酵方法存在進一步的改進和優(yōu)化需求，這也是該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點和重點之一，更是本發(fā)明得以完成的動力和出發(fā)點所在。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，提供了一種高表達量、高菌體密度的重組大腸桿菌發(fā)酵方法，并且提供了一種適用于該發(fā)酵方法的發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種重組牛粒細胞集落刺激因子工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下組分組成：

葡萄糖8～15g/l、胰化蛋白胨15～25g/l、酵母提取物10～15g/l、kh2po42～4g/l、k2hpo45～8g/l、na2hpo4·12h2o6～8g/l、(nh4)2so42～4g/l、nh4cl0.1～0.3g/l、mgso4·7h2o1.0～1.5g/l、微量元素5～10ml/l及消泡劑0.5～1ml/l，所述微量元素成分為：mnso4·5h2o0.3～0.5g/l、zncl20.5～1g/l、cocl2·6h2o1～2g/l、na2mo4·2h2o0.5～1g/l、cuso4·5h2o1～1.85g/l、feso4·7h2o5～10g/l、h3bo30.3～0.5g/l、cacl2·2h2o5～10g/l。

而且，所述的組分中，葡萄糖優(yōu)選為10～13g/l、胰化蛋白胨優(yōu)選為17～20g/l、酵母提取物優(yōu)選為12～14g/l、kh2po4優(yōu)選為2.5～3.5g/l、k2hpo4優(yōu)選為6～7g/l、na2hpo4·12h2o優(yōu)選為6.5～7.5g/l、(nh4)2so4優(yōu)選為2.5～3g/l、nh4cl優(yōu)選為0.2～0.25g/l、mgso4·7h2o優(yōu)選為1.2～1.4g/l、微量元素7～9ml/l及消泡劑0.7～0.9ml/l。

而且，所述的微量元素成分中，mnso4·5h2o優(yōu)選為0.35～0.45g/l、zncl2優(yōu)選為0.6～0.8g/l、cocl2·6h2o優(yōu)選為1。5～1.7g/l、na2mo4·2h2o優(yōu)選為0.7～0.9g/l、cuso4·5h2o優(yōu)選為1.5～1.7g/l、feso4·7h2o優(yōu)選為7～9g/l、h3bo3優(yōu)選為0.35～0.45g/l、cacl2·2h2o優(yōu)選為7～9g/l。

一種牛粒細胞集落刺激因子工程菌的高密度發(fā)酵方法：按照下列步驟進行：

步驟一、將重組牛粒細胞集落刺激因子工程菌經(jīng)過兩次活化，經(jīng)檢驗獲得二級種子液。

步驟二、發(fā)酵：將二級種子液接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流速，使溶氧百分數(shù)保持不低于20％(v/v)，初始培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速200～300r/min，通氣量0.5～1.0vvm，罐壓0.03～0.07mpa，當(dāng)溶氧低于20％后，逐步提高轉(zhuǎn)速至400r/min，提高通氣量至1.5～2.0vvm，ph通過流加氨水控制在7.0～7.2，通過添加補料培養(yǎng)基進行補料培養(yǎng)；

采用指數(shù)-恒ph混合流加：即在發(fā)酵開始階段，采用指數(shù)流加培養(yǎng)，但是在整個發(fā)酵過程中，保持恒定的ph值方法培養(yǎng)，即用流加葡萄糖代替酸，控制發(fā)酵過程中的ph值，維持在7.1左右，直到發(fā)酵結(jié)束，隨著發(fā)酵的進行，工程菌利用葡萄糖進行生長，并產(chǎn)酸，發(fā)酵罐自動補入氨水中和；隨著葡萄糖的利用，罐內(nèi)葡萄糖濃度趨于0，此時工程菌只能利用氮源進行生長，并且產(chǎn)堿，罐內(nèi)ph值會緩慢上升，發(fā)酵罐自動開啟酸泵，補入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生長，并產(chǎn)酸，降低罐內(nèi)的ph值；如此重復(fù)循環(huán)，工程菌在罐內(nèi)不斷生長，實現(xiàn)高密度，同時避免罐內(nèi)存在過量葡萄糖發(fā)生“葡萄糖效應(yīng)”而積累大量有機酸影響重組菌的生長和外源蛋白的有效表達。

步驟三、誘導(dǎo)：

在對數(shù)生長中后期對細胞進行誘導(dǎo)，每兩小時取樣一次，用于對發(fā)酵液的成分進行檢測，持續(xù)誘導(dǎo)4～6小時，收獲發(fā)酵液；

而且，所述的對數(shù)生長中后期為發(fā)酵罐內(nèi)od600值達到50～60時。

步驟四、蛋白純化：

對得到的發(fā)酵液進行蛋白純化，得到目的蛋白。

優(yōu)選地本發(fā)明所述的方法中，在步驟二中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖8～15g/l、胰化蛋白胨15～25g/l、酵母提取物10～15g/l、kh2po42～4g/l、k2hpo45～8g/l、na2hpo4·12h2o6～8g/l、(nh4)2so42～4g/l、nh4cl0.1～0.3g/l、mgso4·7h2o1.0～1.5g/l、微量元素5～10ml/l及消泡劑0.5～1ml/l，所述微量元素成分為：mnso4·5h2o0.3～0.5g/l、zncl20.5～1g/l、cocl2·6h2o1～2g/l、na2mo4·2h2o0.5～1g/l、cuso4·5h2o1～1.85g/l、feso4·7h2o5～10g/l、h3bo30.3～0.5g/l、cacl2·2h2o5～10g/l。

優(yōu)選地本發(fā)明所述的方法中，在步驟二中，所述的補料培養(yǎng)基為葡萄糖120～200g/l、胰化蛋白胨100～180g/l、酵母提取物60～100g/l、mgso4·7h2o10～15g/l、nacl5～8g/l。

優(yōu)選地本發(fā)明所述的方法中，在步驟二中，補料的流加速度控制方法為：補料開始后的第一個小時控制流加速度為100～200ml/h，之后每2～4小時流加速度增加50～100ml/h。

優(yōu)選地本發(fā)明所述的方法中，在步驟三中，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-d硫代半乳糖苷，濃度為0.5～1.0mm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用的菌種保存方法，大大提高了長期菌種保藏過程中的菌體穩(wěn)定性，大大降低了發(fā)酵過程中由于菌種退化導(dǎo)致生產(chǎn)異常現(xiàn)象的出現(xiàn)，并且優(yōu)化了發(fā)酵、補料培養(yǎng)基及補料方法，保證了菌體快速生長代謝所需營養(yǎng)條件及外部環(huán)境，大大提高了放罐時菌體含量及產(chǎn)物產(chǎn)量。

同現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的發(fā)酵方法采用變指數(shù)-恒ph值混合流加補料的方法來進行重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵。這種方式更加適合重組大腸桿菌的生長和重組酶的表達。指數(shù)流加策略根據(jù)菌體生長的需要提供充足的營養(yǎng)，同時恒定的比生長率避免了乙酸和其它副產(chǎn)物的形成。當(dāng)供氧能力飽和，誘導(dǎo)開始以后，溶氧開始下降，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化，指數(shù)流加已經(jīng)無法適應(yīng)這種環(huán)境，繼續(xù)使用勢必造成乙酸和葡萄糖的大量積累。恒ph值流加策略的使用很好地解決了這個矛盾，在這種復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境下，恒ph值的反饋控制顯示出優(yōu)越的靈敏性和適應(yīng)能力，因此乙酸的積累和抑制作用都得到有效的緩解，菌體密度和酶活力都有明顯的提高。

附圖說明

圖1為目標蛋白純化過程中各組分的sds-page蛋白電泳圖譜。

圖2為目標蛋白與空載體對照的westernblot免疫印記圖譜。

圖3為akta離子交換層析目標蛋白的洗脫圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖與具體的實施方式對本發(fā)明作進一步詳細描述：

下述實施例中采用的發(fā)酵罐是鎮(zhèn)江科潤海生物工程設(shè)備有限公司生產(chǎn)的5l/50l發(fā)酵罐，補料瓶購自四川蜀牛公司，胰化蛋白胨、酵母提取物購自英國oxoid公司，所用消泡劑購自江蘇斯德瑞克化工有限公司，其他所采用的化學(xué)試劑均購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

實施例：

1.原始菌種庫的建立

本實施例中所使用菌種為牛粒細胞集落刺激因子(rbg-csf)重組大腸桿菌，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號，保藏號為cctccm2017014，保藏日期2017年1月9日，拉丁文分類命名：escherichiacolibl21bg-csf，宿主菌為大腸桿菌bl21，表達載體為pet-30a。

將構(gòu)建好的重組牛粒細胞集落刺激因子工程菌以1％的接種量接種于50ml液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min，培養(yǎng)8h，6000r/min，離心10min，然后與滅菌后的保護劑充分混勻(每100ml培養(yǎng)基離心出的細胞加入5保護劑)，無菌條件下分裝至安瓿管中，采用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，冷凍干燥完畢后，將安瓿管頸部用強火焰拉細，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封，于-80℃冰箱中避光保藏。

2.菌種活化與種子液培養(yǎng)

取出重組牛粒細胞集落刺激因子工程菌原始菌種一支；用浸過75％酒精的脫脂棉擦凈菌種管，放入超凈臺或者生物安全柜中；將菌種管頂端在火焰上加熱，避免直接加熱菌體或加熱過度；將無菌水滴至加熱過的菌種管頂端，使玻璃開裂；用銼刀或鑷子敲下已開裂的菌種管的頂端；用無菌吸管吸取0.3mlph7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液(oxoid)，滴入菌種管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體；取約0.2ml菌懸液，轉(zhuǎn)接于特定的瓊脂培養(yǎng)基斜面或平板上，剩余的菌液注入液體培養(yǎng)基5ml內(nèi)，進行培養(yǎng)。傳至第三代時作為工作用菌種，分裝甘油保存，每批發(fā)酵取用一支；取工作用種子劃lb平板37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于10mllb液體種子培養(yǎng)基/50ml錐形瓶中，37℃，搖床200r/min活化培養(yǎng)6～8h，經(jīng)過鏡檢無雜菌，菌種形態(tài)正常，作為發(fā)酵用工作種子；一級種子液培養(yǎng)：以體積比2％的接種量，接入數(shù)個含100mllb培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)12小時；二級種子液培養(yǎng)：將一級種子液以1％的體積比接種到數(shù)個含300ml種子培養(yǎng)基的1l三角瓶中，37℃，220r/min，搖床培養(yǎng)8小時，進行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌體形態(tài)，以確定菌種，即為發(fā)酵用種子；

3.重組大腸桿菌的發(fā)酵

采用5l發(fā)酵罐，將ph電極、溶氧電極校正并安裝好；發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖15g/l、胰化蛋白胨25g/l、酵母提取物15g/l、kh2po44g/l、k2hpo48g/l、na2hpo4·12h2o8g/l、(nh4)2so44g/l、nh4cl0.3g/l、mgso4·7h2o1.5g/l、微量元素10ml/l及消泡劑1ml/l，所述微量元素成分為：mnso4·5h2o0.5g/l、zncl21g/l、cocl2·6h2o2g/l、na2mo4·2h2o1g/l、cuso4·5h2o1.85g/l、feso4·7h2o10g/l、h3bo30.5g/l、cacl2·2h2o10g/l。對發(fā)酵罐進行原位滅菌；滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到37℃時，按接種量5％體積比接入二級種子液并進行通氣攪拌培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量1.0vvm，罐壓0.07mpa，當(dāng)溶氧低于20％后，逐步提高轉(zhuǎn)速至800r/min，通氣量至2vvm，控制ph在7.2；酸泵連接補料培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基為葡萄糖150/l、胰化蛋白胨120g/l、酵母提取物80g/l、mgso4.7h2o12g/l、nacl6g/l，流加補料培養(yǎng)基，流加速度為1.25ml/(l·min)，溶氧維持在50％，ph在7.2。堿泵連接氨水；根據(jù)ph調(diào)整補料，補料開始的第一個小時控制流加速度為200ml/h，之后每1小時流加速度增加50ml/h。并且當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)od600值達到60時，開始添加濃度為0.8mm的異丙基-β-d硫代半乳糖苷，每兩小時取樣一次，用于各種參數(shù)的檢測。持續(xù)誘導(dǎo)4小時，發(fā)酵時間共14小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體干重為54.45g(dcw)/l。

4.重組大腸桿菌的中試發(fā)酵

采用50l發(fā)酵罐，將ph電極、溶氧電極校正并安裝好；葡萄糖15g/l、胰化蛋白胨25g/l、酵母提取物15g/l、kh2po44g/l、k2hpo48g/l、na2hpo4·12h2o8g/l、(nh4)2so44g/l、nh4cl0.3g/l、mgso4·7h2o1.5g/l、微量元素10ml/l及消泡劑1ml/l，所述微量元素成分為：mnso4·5h2o0.5g/l、zncl21g/l、cocl2·6h2o2g/l、na2mo4·2h2o1g/l、cuso4·5h2o1.85g/l、feso4·7h2o10g/l、h3bo30.5g/l、cacl2·2h2o10g/l。按照發(fā)酵罐說明書進行原位滅菌；滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到37℃時，按接種量5％體積比接入二級種子液并進行通氣攪拌培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量1.0vvm，罐壓0.07mpa，當(dāng)溶氧低于20％后，逐步提高轉(zhuǎn)速至800r/min，通氣量至2vvm，控制ph在7.2；酸泵連接補料培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基為葡萄糖150/l、胰化蛋白胨120g/l、酵母提取物80g/l、mgso4.7h2o12g/l、nacl6g/l，流加補料培養(yǎng)基，流加速度為1.25ml/(l·min)，溶氧維持在50％，ph在7.2。堿泵連接氨水；根據(jù)ph調(diào)整補料，補料開始的第一個小時控制流加速度為200ml/h，之后每1小時流加速度增加50ml/h。并且當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)od600值達到70時，開始添加濃度為0.8mm的異丙基-β-d硫代半乳糖苷，每兩小時取樣一次，用于各種參數(shù)的檢測。持續(xù)誘導(dǎo)4小時，發(fā)酵時間共16小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體干重為69.3g(dcw)/l。

5.目標蛋白的純化

將4中發(fā)酵完成的菌液中經(jīng)過純化得到目標蛋白，如圖1所示，圖中顯示目標蛋白純化過程中各組分的sds-page蛋白電泳圖譜，其中1為marker，2為包涵體溶解后的蛋白，3為復(fù)性濃縮后的蛋白，4和5為akata純化的蛋白，圖中顯示目標蛋白的大小21kd與蛋白的序列長度相符，圖中證實在純化的過程中，各組分內(nèi)均含有目標蛋白。

如圖2所示，圖中顯示目標蛋白與空載體對照的的westernblot免疫印記圖譜，其中1為目標蛋白bg-csf，2為空載體對照；3為marker，圖中確認了目標蛋白的大小為21.5kd。

如圖3所示，圖3為akta離子交換層析目標蛋白的洗脫圖譜，其中a為目標蛋白的洗脫峰，在10.0ml-15.0ml的區(qū)間目標蛋白完成了洗脫，目標蛋白的洗脫峰達到90.0左右的mau。

以上對本發(fā)明進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。