專利名稱：一種聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的聚乙二醇修飾技術(shù)，具體地涉及一種聚乙二醇單修飾重
組人粒細(xì)胞集落剌激因子及其制備方法和其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)是一種造血生長(zhǎng)因子，作用于骨髓中性粒細(xì)胞系促 進(jìn)其增殖分化，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟與釋放，增強(qiáng)成熟中性粒細(xì)胞的功能，其早期臨床 適應(yīng)癥為癌癥化療及骨髓移植后的中性粒細(xì)胞減少，以后逐步擴(kuò)大到各種病因引起的中性 粒細(xì)胞減少癥。但G-CSF在人體內(nèi)循環(huán)半衰期只有1. 3-4. 2小時(shí)，需每日給藥，而持續(xù)給藥 會(huì)引發(fā)藥疹、發(fā)熱、肌痛、骨痛等副作用，導(dǎo)致實(shí)際用量遠(yuǎn)低于理論需用量，直接影響臨床治 療效果。 針對(duì)延長(zhǎng)蛋白類藥物半衰期，降低其免疫原性的研究已展開(kāi)多年，其中的一種方 法是將蛋白藥物與水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合形成偶聯(lián)物，使用比較普遍的水溶性聚合物就 是聚乙二醇，因?yàn)榫垡叶季哂休^優(yōu)秀的臨床適用性_良好的熱穩(wěn)定性、抗酶解、增加水溶 性、延長(zhǎng)半衰期、降低清除率、減少免疫原性和毒性。 在PEG-G-CSF的現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中，各種PEG-G-CSF的區(qū)別在于聚乙二醇與G-CSF 連接方法和位點(diǎn)的不同，因而偶聯(lián)物的連接位點(diǎn)、穩(wěn)定性及生物活性不同，已報(bào)道的連接方 法有PEG活性丙酸酯修飾G-CSF， PEG-丙醛修飾N末端添加了甲硫氨酸的G-CSF突變體 (全長(zhǎng)175aa， PEG_Met-G_CSF)。 一些歐洲專利還報(bào)道了關(guān)于G-CSF的其他修飾方法，如通 過(guò)去除未經(jīng)修飾蛋白分子中一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位而達(dá)到減低免疫原性的目的等。
本發(fā)明的偶聯(lián)物是聚乙二醇單修飾N端起始的脯氨酸，其結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的均不 同，其活性較PEG-丙醛修飾N末端(PEG-Met-G-CSF)的更高，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)均一。該發(fā)明構(gòu)思 的理論基礎(chǔ)是人類體內(nèi)天然的G-CSF的N端可以含有蘇氨酸或者不帶蘇氨酸，后者豐度約 為30%。體內(nèi)天然存在的分子形式是作為治療性藥物的最佳選擇。而目前文獻(xiàn)報(bào)道的研究 中，還沒(méi)有將天然分子形式進(jìn)行聚乙二醇修飾的研究。在天然分子N末端的脯氨酸上進(jìn)行 修飾存在一定的技術(shù)難度，目前還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。已經(jīng)在美國(guó)上市的藥物Neulasta是 在天然分子N末端添加一個(gè)甲硫氨酸作為修飾點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效化的，這種分子突變可以誘發(fā) 人體產(chǎn)生抗藥抗體，影響治療效果。 為了實(shí)現(xiàn)在天然分子的第一個(gè)脯氨酸上進(jìn)行修飾，我們進(jìn)行一些嘗試，并得到了 令人滿意的修飾效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的聚乙二醇單修飾G-CSF偶聯(lián)物，其活性更高且 結(jié)構(gòu)更均一。本發(fā)明的另一 目的是提供一種聚乙二醇單修飾G-CSF偶聯(lián)物的制備方法。
本發(fā)明所述一種聚乙二醇修飾G-CSF偶聯(lián)物中的G-CSF是人體內(nèi)天然存在的 G-CSF活性的肽段(173aa)。修飾反應(yīng)所用聚乙二醇其聚合鏈長(zhǎng)度范圍是5KDa至100KDa，優(yōu)選10KDa至50KDa，更優(yōu)選20KDa，所用活化的聚乙二醇為甲氧基聚乙二醇醛。采用20KDa 聚乙二醇丙醛單修飾以脯氨酸起始的G-CSF的N端，與修飾N端甲硫氨酸的產(chǎn)物比較其比 活更高，產(chǎn)物均一性更好。 本發(fā)明所述偶聯(lián)物是由G-CSF與聚乙二醇通過(guò)共價(jià)結(jié)合而成，通用的反應(yīng)條件 為pH5-10，溫度4-25°C，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘-24小時(shí)，反應(yīng)物摩爾比例(PEG : G-CSF =
i : i至ioo : i)。 一般情況下低溫、低pH值、短反應(yīng)時(shí)間更利于生成單修飾產(chǎn)物，本發(fā)
明所述一種聚乙二醇修飾G-CSF偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于控制反應(yīng)體系pH值、反應(yīng) 溫度、聚乙二醇與G-CSF投料比及催化劑氰硼氫化鈉的濃度。優(yōu)選條件為G-CSF原液濃度 為2-5mg/ml， pH為4. 0-5. 0，加入氰硼氫化鈉的終濃度為20mM，加入活化聚乙二醇的量為 G-CSF的3-5倍，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選1-2小時(shí)，加入相當(dāng)于兩倍活化聚乙二醇量的甘氨酸終止反應(yīng)。 為保證修飾效率，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中的聚乙二醇與蛋白分子的投料比高達(dá)i : 50， 但io以上的投料比會(huì)使產(chǎn)物組分更復(fù)雜-單、雙、多修飾偶聯(lián)物并存。 一般來(lái)說(shuō)，如果反應(yīng)
液PH低于pK，修飾劑比例應(yīng)大大超過(guò)蛋白分子，如果pH高于pK，則修飾劑與蛋白分子的比 例不必相差太大，反應(yīng)體系pH的不同會(huì)導(dǎo)致修飾劑與蛋白分子的結(jié)合位點(diǎn)的差異，反應(yīng)程 度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并與反應(yīng)溫度有關(guān)。我們通過(guò)控制反應(yīng)體系的pH、修飾劑與G-CSF 的投料比及反應(yīng)溫度等因素，控制活化聚乙二醇與N端起始脯氨酸的氨基共價(jià)結(jié)合，在保 證一定修飾效率的前提下，所用活化聚乙二醇的量大大減少。 PEG修飾后的混合物，其分子量差異較明顯，適宜選用凝膠層析介質(zhì)進(jìn)行分離。早 期的凝膠排阻填料如交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺生物凝膠等，化學(xué)惰性較好且有不同大小孔 徑的填料，以適應(yīng)不同分子量的蛋白質(zhì)的分級(jí)分離，但這些凝膠的機(jī)械強(qiáng)度差，很難用于大 規(guī)模條件下的分離。近十幾年來(lái)，幾種機(jī)械強(qiáng)度較好的凝膠已商品化，包括S印harcryl、 Superdex等。初步分離實(shí)驗(yàn)在5. 6cmX 100cm的S印hacryl S-200層析柱上進(jìn)行，平衡緩沖 液選用rhG-CSF偏愛(ài)的弱酸性溶液即NaNC-HAC(pH4. 0)，由于S印hacryl S-200層析柱呈 弱堿性，偏堿性時(shí)易吸附蛋白，加入O. 1M NaCl以增加離子強(qiáng)度，減少蛋白的非特異性吸附。 經(jīng)此步操作可除去反應(yīng)混合物中分子量大于目的蛋白的大部分分子及未反應(yīng)的rhG-CSF， 使PEG-rhG-CSF得以初步純化，純度可達(dá)90%左右。 此步驟的另一個(gè)作用，就是對(duì)反應(yīng)混合物中的未參與反應(yīng)的PEG和還原劑進(jìn)行有 效分離。所用PEG分子量為20KD的中性分子，還原劑為無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)，它們都不與填料產(chǎn) 生吸附作用；而目的蛋白質(zhì)修飾物的分子量為39KD，其在S-200柱層析的洗脫行為與PEG、 還原劑差別較大，可一步達(dá)到PEG和還原劑的有效去除。 PEG的多修飾物與單修飾物在表面電荷效應(yīng)上存在一定差異，利用這一點(diǎn)可以 將S-200樣品中不能被完全分離的PEG多修飾物成分有效去除，達(dá)到對(duì)樣品的精制。根 據(jù)rhG-CSF在弱酸條件下較穩(wěn)定的特點(diǎn)，純化PEG-rhG-CSF分子時(shí)，我們選擇適用于弱 酸條件的CM-S印harose Fast Flow作為結(jié)合目的蛋白的固相介質(zhì)；DEAE柱的作用是結(jié) 合樣品中的內(nèi)毒素，將蛋白溶液上柱后，目的蛋白穿過(guò)DEAE柱后掛在CM柱上，用pH4.0、 20mMNaCN-HAC平衡后，以0. 03MNaCl洗脫雜蛋白，0. 3M NaCl洗脫目的蛋白，經(jīng)此步驟 樣品純度可達(dá)95%以上。如果經(jīng)S-200步驟仍存在少量殘留PEG及還原劑組分，經(jīng) DEAE-CMS印harose FF層析進(jìn)行進(jìn)一步去除，可使其組分降到最低。
基于PEG-rhG-CSF的給藥方式及注射劑量大等特點(diǎn)，對(duì)PEG_rhG_CSF原液的內(nèi)毒
素要求更為嚴(yán)格。為保證內(nèi)毒素符合標(biāo)準(zhǔn)，配液用水為符合藥典要求的注射用水，部分試劑
及所用玻璃器皿，預(yù)先18(TC干烤2hrs。離子交換層析流速快，載量高，只需增大柱管尺寸，
加大層析介質(zhì)體積，便可過(guò)渡到大生產(chǎn)規(guī)模。 上述原液加入可以接受的藥用輔料，制備成制劑。 實(shí)施例1聚乙二醇修飾粒細(xì)胞集落剌激因子的制備 取粒細(xì)胞集落剌激因子原液100ml (緩沖體系為pH4. 0、50mM醋酸鹽緩沖液，蛋白 濃度為5mg/ml)。稱取O. 126g氰硼氫化鈉，加入粒細(xì)胞集落剌激因子原液中，攪拌使之迅速 溶解。稱取2g活化的聚乙二醇(20KDa)，攪拌使之迅速溶解，室溫下攪拌1. 5小時(shí)。加入 4g甘氨酸終止反應(yīng)。 將反應(yīng)混合物上S-200柱，平衡緩沖液選用NaNC-HAC (pH4. 0)，加入0. lMNaCl以增 加離子強(qiáng)度。上樣量為2-5%柱體積，流速為30ml/min時(shí)，既可獲得較好的分離效果，又節(jié) 省了操作時(shí)間。為確定在獲得滿意分離效果前提下的最大進(jìn)樣量，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 上樣量為4-5%柱體積時(shí)同樣能達(dá)到較好分離效果。 離子交換。上述分子篩目的峰上DEAE，目的蛋白穿過(guò)DEAE柱后直接上CM柱，用 pH4. 0、20mMNaCN-HAC平衡后，以0. 03MNaCl洗脫雜蛋白，O. 3M NaCl洗脫目的蛋白，經(jīng)此步 驟樣品純度可達(dá)95%以上。 實(shí)施例2聚乙二醇修飾粒細(xì)胞集落剌激因子的活性測(cè)定 PEG-G-CSF生物學(xué)活性測(cè)定采用MTT比色法。實(shí)施例1樣品測(cè)得的比活性為 8X107IU/mg。具體方法如下
試劑 RPMI1640培養(yǎng)液每升添加2. 0g碳酸氫鈉、2. 383gHEPES，0. 2923L-谷氨酰胺，經(jīng) 0. 22 ii m濾膜過(guò)濾除菌。fC保存。 基礎(chǔ)培養(yǎng)液取100ml胎牛血清(FBS)，加入900ml RPMI1640培養(yǎng)液中。4。C保存。
完全培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)液加重組人粒細(xì)胞集落剌激因子至終濃度為20ng/ml或 3000IU/ml。 磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8g氯化鈉、0. 2g氯化鉀、1. 44g磷酸氫二鈉、0. 24g磷酸 二氫鉀，加水使溶解成1000ml，經(jīng)121°C、15分鐘高壓滅菌。 噻唑藍(lán)(MTT)溶液取MTT粉末0. 25g，加入50ml PBS中，配制成5. Omg/ml的溶 液，經(jīng)0. 22 ii m濾膜過(guò)濾除菌。4t:避光保存。 裂解液吸取鹽酸14ml， Triton X-lOO溶液50ml，加異丙醇配制成500ml的溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制取1支重組人粒細(xì)胞集落剌激因子效價(jià)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū) 溶解后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至50 100IU/ml。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)以2倍稀釋度做 稀釋度稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)孔。以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
供試品溶液的配制將供試品按標(biāo)示量溶解后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成約50 100IU/ml。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)以2倍稀釋度做稀釋度稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀 釋度做兩個(gè)孔。以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
測(cè)定法(a e步驟在無(wú)菌條件下進(jìn)行) aNFS-60細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37°C，5% C02培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為1. 0X105 4. OX 107ml，傳代后24 36小時(shí)用于效價(jià)測(cè)定。
b將試驗(yàn)所用溶液預(yù)溫至37 °C 。 c取足量NFS-60細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集NFS-60細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌3次，然后 重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成2. OX 105/ml的細(xì)胞懸液，置37t:備用。 d在加有標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入50 1細(xì)胞懸 液，37。C，5X 0)2培養(yǎng)40 48小時(shí)。 e每孔加入20ii1 MTT溶液，37°C ， 5% C02培養(yǎng)5小時(shí)。 f每孔加入200 ill裂解液，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測(cè)定波長(zhǎng)540nm，參比波長(zhǎng)
630nm，記錄測(cè)定結(jié)果。 結(jié)果計(jì)算 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序或直線回歸計(jì)算法進(jìn)行處理。并按下式計(jì)算結(jié)果
<formula>formula see original document page 6</formula> 式中Pr為標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)，IU/ml，
Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Es為供試品半效稀釋倍數(shù)；
Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。
權(quán)利要求
一種聚乙二醇修飾的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)偶聯(lián)物。
2. 權(quán)利要求1所述偶聯(lián)物，其中所述G-CSF是N端缺失蘇氨酸的人粒細(xì)胞集落剌激因 子，全長(zhǎng)173個(gè)氨基酸。
3. 權(quán)利要求1所述偶聯(lián)物，其中所述聚乙二醇的分子量為5KDa到100KDa。
4. 權(quán)利要求3中所述聚乙二醇的分子量為10KDa到50KDa。
5. 權(quán)利要求3至4中所述聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇醛。
6. 權(quán)利要求5中所述聚乙二醇是分子量為20KDa的甲氧基聚乙二醇醛。
7. —種制備聚乙二醇-粒細(xì)胞集落剌激因子偶聯(lián)物的制備方法。其特征在于(1) 調(diào)整G-CSF原液濃度和pH值，加入氰硼氫化鈉和活化的聚乙二醇，于4t:反應(yīng)，加 入甘氨酸終止反應(yīng)。(2) 采用離子交換和分子篩層析對(duì)反應(yīng)混合物予以分離純化。
8. 如權(quán)利要求l-7所述聚乙二醇-粒細(xì)胞集落剌激因子偶聯(lián)物在制備用于提升白細(xì)胞 的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種聚乙二醇修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子偶聯(lián)物及其制備方法，具體地涉及一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子N端脯氨酸的偶聯(lián)物，此物質(zhì)是該技術(shù)領(lǐng)域中所沒(méi)有的，與國(guó)外已上市同類產(chǎn)品相比，該物質(zhì)具有更低的免疫原性，更少的活性損失和更高的制備收率。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101711876SQ200810223549
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者劉迎, 吳彥卓, 徐明波, 楊仲凡, 梁果義, 王俊玲, 許可, 連治國(guó) 申請(qǐng)人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司