一種重組恒河猴尿酸酶蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組恒河猴尿酸酶蛋白及其應(yīng)用，該尿酸酶蛋白源自于恒河猴，將其基因編碼序列克隆至表達(dá)質(zhì)粒載體中進(jìn)行體外重組表達(dá)，該酶蛋白可作為制備治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥藥物的應(yīng)用。本發(fā)明利用尿酸酶在痛風(fēng)及高尿酸血癥領(lǐng)域的治療效果，針對(duì)已上市尿酸酶產(chǎn)品，其蛋白序列與人體同源性較恒河猴低、免疫原性較強(qiáng)等問(wèn)題，采用與人體同源性最高、具有活性尿酸酶的哺乳動(dòng)物--恒河猴，作為重組尿酸酶蛋白的基因來(lái)源。該重組尿酸酶蛋白具有免疫原性低，患者易于耐受，可長(zhǎng)期治療等優(yōu)點(diǎn)。含有該尿酸酶基因的真核表達(dá)質(zhì)粒還可以用體內(nèi)轉(zhuǎn)染的手段轉(zhuǎn)染到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)活性尿酸酶蛋白，用于痛風(fēng)和高尿酸血癥的基因治療。
【專利說(shuō)明】一種重組恒河猴尿酸酶蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是指一種重組恒河猴尿酸酶蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]痛風(fēng)和高尿酸血癥是目前危害人類健康的常見(jiàn)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)高尿酸血癥的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了人群的10%。痛風(fēng)是由于血尿酸水平過(guò)高而造成尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)中沉積而導(dǎo)致的一種急性關(guān)節(jié)炎。目前控制痛風(fēng)的藥物主要是別嘌呤醇和丙磺舒類藥物。由于這兩類藥物均需要長(zhǎng)期服用，加之該類藥物都有明顯的肝腎毒性以及過(guò)敏反應(yīng)，尤其是別嘌呤醇，可以引起嚴(yán)重的剝脫性皮炎，甚至可危機(jī)患者的生命。導(dǎo)致目前這類疾病的控制不理想，而造成患者痛風(fēng)石的形成和腎功能的障礙。目前，高尿酸血癥已被列為心血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，尋找有效的治療手段勢(shì)在必行。
[0003]在動(dòng)物體內(nèi)，其尿酸的水平僅為人類的1/10。因此痛風(fēng)和高尿酸血癥也被認(rèn)為是人類獨(dú)有的疾病。動(dòng)物體內(nèi)尿酸水平低的原因是由于其體內(nèi)存在有能夠把尿酸進(jìn)一步分解為極易溶解的尿囊素。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，人類的基因組中也存在尿酸酶基因，但是在人類在進(jìn)化的過(guò)程中，由于該基因的突變，造成其不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。從而成為一個(gè)假基因。由此可見(jiàn)尿酸酶是治療痛風(fēng)與高尿酸血癥的理想藥物。20多年前，黃曲霉尿酸酶(Uricozyme)在法國(guó)和意大利批準(zhǔn)。本世紀(jì)初,基因重組的酵母菌尿酸酶(Rasburicase)在美國(guó)和歐盟或批準(zhǔn)。由于這兩種尿酸酶均來(lái)自于細(xì)菌，有很強(qiáng)的免疫原性，Uricozyme和Rasburicase出現(xiàn)嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的比例達(dá)5%以上，并且還有近半數(shù)的患者出現(xiàn)發(fā)熱，惡心嘔吐等不良反應(yīng)。目前在美國(guó)用于臨床的尿酸酶蛋白(Pegloticase)是經(jīng)過(guò)PEG化修飾的豬和狒狒的重組尿酸酶嵌合蛋白，商品名為KRYSTEXXA。雖然該尿酸酶來(lái)源于哺乳動(dòng)物(豬和狒狒)，但由于與人類的差異造成的排異反應(yīng)，加之PEG化的影響，其免疫原性仍然較強(qiáng)。每?jī)芍芤淮戊o脈注射KRYSTEXXA的患者中92%產(chǎn)生了抗pegloticase的抗體。42%的患者產(chǎn)生了抗PEG抗體。輸 液反應(yīng)的發(fā)生率達(dá)到26%。盡管如此，美國(guó)FDA于2010年批準(zhǔn)了該藥上市。由此可見(jiàn)對(duì)該類藥物有著巨大的市場(chǎng)需求。為進(jìn)一步改善從組尿酸酶的免疫原性，我們選擇與人類更為接近，且體內(nèi)存在高活性尿酸酶蛋白的恒河猴作為尿酸酶基因的來(lái)源。通過(guò)對(duì)恒河猴尿酸酶(RhUOX)與推測(cè)出的人源尿酸酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性約為93.4%;而其他哺乳動(dòng)物狒狒、犬、豬、小鼠與推測(cè)出的人源尿酸酶的氨基酸序列一致性分別為:91.1%,88.49%,86.8%,85.2%。因此，從氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果可以看出，恒河猴尿酸酶與人類具有更高的同源性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組恒河猴尿酸酶蛋白及其應(yīng)用。該酶源自恒河猴，在體外重組制備，能夠應(yīng)用于痛風(fēng)或者高尿酸血癥的治療。該重組尿酸酶蛋白可以在體外用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，且可以對(duì)表達(dá)出的尿酸酶蛋白進(jìn)行PEG化修飾?；蛘邞?yīng)用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，也可以在表達(dá)載體中將恒河猴尿酸酶基因連接免疫球蛋白的FC段，從而表達(dá)出帶有FC片段的恒河猴尿酸酶，進(jìn)一步增強(qiáng)酶的活性和半衰期?；蛘咧苯訉⒑愫雍锬蛩崦傅娜L(zhǎng)基因插入到表達(dá)載體，將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入患者的體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)完整的恒河猴尿酸酶蛋白，從而達(dá)到更為持續(xù)有效的治療效果。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種重組恒河猴尿酸酶蛋白，該尿酸酶蛋白源自于恒河猴。
[0006]進(jìn)一步地，所述重組恒河猴尿酸酶蛋白由304個(gè)氨基酸組成。
[0007]進(jìn)一步地，所述304個(gè)氨基酸中，包含恒河猴來(lái)源尿酸酶蛋白第2-69位，第156-192位及第202-240位氨基酸序列，見(jiàn)序列表1。
[0008]一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，將恒河猴尿酸酶基因編碼序列插入表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。
[0009]進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。
[0010]進(jìn)一步地，所述原核表達(dá)載體為pET_28c載體或pET-DsBA載體?；蚱渌杀磉_(dá)恒河猴尿酸酶的原核表達(dá)的載體系統(tǒng)。
[0011]進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
[0012]進(jìn)一步地，所述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1載體?；蚩捎糜诤愫雍锬蛩崦副磉_(dá)的真核表達(dá)載體。
[0013]本發(fā)明所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白作為制備治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物的應(yīng)用。
[0014]進(jìn)一步地，所述治`療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物為PEG化的原核表達(dá)出的活性恒河猴尿酸酶蛋白。
[0015]進(jìn)一步地，所述的治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物為表達(dá)出帶FC片段的恒河猴尿酸酶或表達(dá)完整的恒河猴尿酸酶蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
[0016]恒河猴尿酸酶的制備方法，具體步驟為:
(O獲取恒河猴尿酸酶Rhuox基因編碼序列；
(2)構(gòu)建恒河猴尿酸酶RhUOX的T載體，以獲取所需恒河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序
列；
(3)將恒河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列插入表達(dá)載體；
(4)將表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，并使之表達(dá)，獲得恒河猴尿酸酶RhUOX；
(5)對(duì)恒河猴尿酸酶RhUOX進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后進(jìn)行酶活性測(cè)定。
[0017]采用Trizol法常規(guī)提取恒河猴肝臟的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)合成cDNA,具體操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
[0018]根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的RhUOX cDNA序列，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增獲得恒河猴RhUOX⑶S序列。
[0019]上游引物:5’-GGATCCGAATGGCCGACTACCATAAC-3’ ；
下游引物:5’ -GAATTCGGTCACAGTCTTGAAGACAAC-3’。
[0020]構(gòu)建恒河猴尿酸酶RhUOX的T載體的步驟為:
I)在PCR管中配制下列DNA溶液，全量為5 μ I ;

pMD19-TVechtor I μ I

目的 DNA'?μ I
dH2Q|3μ I2)加入5 μ I (等量)的 Solution I ；
3)16°C反應(yīng)30分鐘；
4)全量(10μ?)加入至100 μ I JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；
5)42°C加熱45秒鐘后，再在冰中放置I分鐘；
6)加入890μ I SOC培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘；
7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落；
8)挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大??；
9)將構(gòu)建好的尿酸酶重組菌RhU0X/pMD19T測(cè)序，菌種置于_70°C冰箱甘油管保存。測(cè)序報(bào)告顯不，RhUOX基因已插入pMD19T載體中。
[0021 ] 將網(wǎng)站預(yù)測(cè)的RhUOX的cDNA序列(序列表2 )與網(wǎng)站預(yù)測(cè)的RhUOX的蛋白質(zhì)序列(序列表3)分別與測(cè)序成功的RhUOX cDNA序列(序列表4)，以及測(cè)序成功的RhUOX蛋白質(zhì)序列(序列表5)比對(duì)，所獲取的恒河猴尿酸酶RhUOX的氨基酸序列第157位為I而非網(wǎng)站公布的T。
[0022]表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，具體為pET_28c載體或pET_DsBA載體。首先，構(gòu)建RhU0X/pMD19T載體(方法同上)，質(zhì)粒測(cè)序正確后，BamHl/EcoRl雙酶切插入片段(929bp)插入pET-28c載體或pET-DsBA載體中。
[0023]表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)載體為真核表達(dá)載體，具體為pcDNA3.1載體。
[0024]pcDNA3.1 載體構(gòu)建:
Trizol法常規(guī)提取恒河猴肝臟組織總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增RhUOX表達(dá)基因片段。
[0025]上游引物:5’ -GGATCCGCCACCATGGCCGACTACCATAAC-3 ’
下游引物:5’ -AGAATTCAACAGTCTTGAAGACAACTTCCTC-3’
擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，插入PMD19T載體中，質(zhì)粒測(cè)序正確后，BamHl/EcoRl酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0026]所述pET_28c載體或pET_DsBA載體中，RhUOX基因的原核誘導(dǎo)表達(dá)方法:
1)使用大腸桿菌BL21(DE21)作為感受態(tài)細(xì)胞；
2)使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，使原核表達(dá)載體編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；
3)進(jìn)行重組質(zhì)粒抽提；
4)使重組菌誘導(dǎo)表達(dá)。
[0027]RhUOX的原核誘導(dǎo)表達(dá):
轉(zhuǎn)化:取感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α ,100 μ I)置于冰浴上融化。加入I μ I質(zhì)粒DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘。從冰浴中取出離心管，立即置于42°C水浴中熱擊90秒。取出離心管快速放置到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3分鐘。每管加800 μ I無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基，置于37°C搖床振搖培養(yǎng)溫育30-45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇，以便表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。離心，吸棄800 μ I上清，將這些已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布至含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平板，于37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)，觀察菌體生長(zhǎng)情況。
[0028]重組質(zhì)粒抽提，挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C劇烈振搖培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液收集至離心管中，室溫12000 rpm離心I min,收集菌體沉淀,采用試劑盒抽提重組質(zhì)粒，具體方法步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。抽提完的重組質(zhì)粒溶解后，置于-20 1:冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0029]重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)，將抽提的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21 (DE21)表達(dá)菌的感受態(tài)中(轉(zhuǎn)化方法同前述)，37 溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16 ho挑取單菌落接種于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C劇烈振搖培養(yǎng)過(guò)夜。重組菌菌液按1%接種量轉(zhuǎn)接至3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基后，37 °C劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)至0D600~0.6時(shí)加入終濃度為0.4 mM的IPTG，21°C振搖(120rpm)培養(yǎng)誘導(dǎo)過(guò)夜。收集菌液，4000 rpm離心5 min收集菌體沉淀，將菌體沉淀重懸于150 μ I硼酸-硼砂鹽緩沖液中(pH8.4)。冰浴中超聲破碎。4 V 12000 rpm離心lOmin，收集上清液即為粗酶液。
[0030]SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá):提取的粗酶液采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色液G250染色后，脫色液脫色，最后于凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。
[0031]RhUOX酶活測(cè)定:由于尿酸在293 nm處有光吸收，可以通過(guò)檢測(cè)尿酸吸光度的降低來(lái)測(cè)定尿酸酶的活性。酶活力單位(U)定義:在pH 8.4和25 °C時(shí)，I min催化I μ mo I尿酸生成尿囊素所需的酶量為一個(gè)酶活單位。
[0032]尿酸酶活力測(cè)定具體如下:
取900 μ I 120 μmol/L尿酸，加入30 μ I粗酶液，混勻。
[0033]25 °C水浴反應(yīng)5 min后，加入70 μ I 20% KOH終止反應(yīng)。
[0034]取100 μ I反應(yīng)液于微型石英比色皿中，置于紫外分光光度計(jì)中，293 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。根據(jù)尿酸在293 nm波長(zhǎng)下的微摩爾消光系數(shù)(ε =12.6 μ M—1.cm—1)，計(jì)算RhUOX酶活力。
[0035]pET-28載體酶活性檢測(cè):IPTG誘導(dǎo)的B21 (DE3) pET_28c空載體對(duì)照(Control)菌裂解液和RhU0X/pET-28c重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，RhUOX裂解菌液可顯著降低溶液中的尿酸濃度，相較于Control組,其下降幅度為82.39% (P〈0.0001)。
[0036]pET-DsBA載體酶活性檢測(cè):IPTG誘導(dǎo)的B21 (DE3) pET-DsBA空載體對(duì)照(Control)菌裂解液和RhU0X/pET_DsBA重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，RhUOX裂解菌液可顯著降低溶液中的尿酸濃度,相較于Control組,其下降幅度為66.53%(Ρ〈0.0001)。
[0037]進(jìn)一步的，所述pcDNA3.1載體中RhUOX基因或RhUOX-Fc基因的真核表達(dá)方法: O使用人胚腎細(xì)胞(ΗΕΚ293Τ)作為宿主細(xì)胞；
2)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，ΗΕΚ293Τ細(xì)胞采用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，使得第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合率達(dá)到80%~90%。；
3)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，采用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后72 h，獲得基因表達(dá)成果。
[0038]轉(zhuǎn)染后72 h，將細(xì)胞收集到1.5 ml EP管中。
[0039]將收集的細(xì)胞每管分別加入120 μ I硼酸-硼砂鹽緩沖液(ρΗ8.4)，冰浴超聲破碎。將細(xì)胞裂解液于4 V 12000 rpm離心10 min，收集上清液。
[0040]細(xì)胞裂解上清液30 μ I與970 μ I尿酸溶液于25 °C水浴孵育7 h后，檢測(cè)尿酸濃度。[0041 ] 構(gòu)建pCDNA3.1表達(dá)載體=Trizol法常規(guī)提取恒河猴肝臟組織總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增RhUOX表達(dá)基因片段。
[0042]上游引物:5’ -GGATCCGCCACCATGGCCGACTACCATAAC-3 ’
下游引物:5’ -AGAATTCAACAGTCTTGAAGACAACTTCCTC-3’
擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，插入PMD19T載體中，質(zhì)粒測(cè)序正確后，BamHl/EcoRl酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0043]Human IgG Fe片段同樣通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增于人淋巴細(xì)胞RNA。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，插入PMD19T載體中。質(zhì)粒測(cè)序正確后，EcoRl/Xbal酶切插入pcDNA3.1載體中。
[0044]RhU0X-Fc/pcDNA3.1質(zhì)粒序列，其中重組RhUOX的基因序列見(jiàn)序列表6，F(xiàn)C片段的基因序列見(jiàn)序列表7。結(jié)果:與空載體組相比，轉(zhuǎn)染RhU0X/pcDNA3.1質(zhì)粒組中尿酸濃度顯著低于轉(zhuǎn)染空載體組，其下降幅度為42.62% (P〈0.0001)。轉(zhuǎn)染RhU0X_Fc/pcDNA3.1質(zhì)粒組中尿酸濃度也顯著低于轉(zhuǎn)染空載體組，其下降幅度為78.94% ;另外，轉(zhuǎn)染RhUOX-Fc/pcDNA3.1質(zhì)粒組中尿酸濃度又顯著低于轉(zhuǎn)染RhU0X/pcDNA3.1質(zhì)粒組，其下降幅度達(dá)63.30% (Ρ〈0.001)。
[0045]本發(fā)明還涉及所述的恒河猴尿酸酶RhUOX作為制備治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物的應(yīng)用。發(fā)明針對(duì)目前尿酸酶制劑存在的免疫原性高，副作用大等缺點(diǎn)。從基因選擇上，我們選擇與人類更為接近，且體內(nèi)存在高活性尿酸酶蛋白的恒河猴作為尿酸酶基因的來(lái)源。`
[0046]為延長(zhǎng)恒河猴尿酸酶蛋白的半衰期，我們將在恒河猴尿酸酶上連接人免疫球蛋白的FC段。從而表達(dá)出帶有FC片段的恒河猴尿酸酶?；蛘咧苯訉⒑愫雍锬蛩崦傅娜L(zhǎng)基因插入到表達(dá)載體，將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)完整的恒河猴尿酸酶蛋白。
[0047]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
(I)本發(fā)明針對(duì)目前尿酸酶制劑存在的免疫原性高，副作用大等缺點(diǎn)，從基因選擇上，我們選擇與人類最為接近，且體內(nèi)存在高活性尿酸酶蛋白的恒河猴作為尿酸酶基因的來(lái)源。體外表達(dá)重組恒河猴尿酸酶用于痛風(fēng)和高尿酸血癥的治療，該重組蛋白在保證療效的同時(shí)具有更低的免疫原性和更好的耐受性。
[0048](2)為延長(zhǎng)恒河猴尿酸酶蛋白的半衰期，我們將在恒河猴尿酸酶上連接人免疫球蛋白的FC段，從而表達(dá)出帶有FC片段的恒河猴尿酸酶，使其在人體內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期，減少針劑的注射周期。該發(fā)明一方面可以減少藥物的毒副作用，同時(shí)應(yīng)用簡(jiǎn)便。
[0049](3)本發(fā)明利用尿酸酶在痛風(fēng)及高尿酸血癥領(lǐng)域的治療效果，采用與人體更為接近的恒河猴尿酸酶，結(jié)合體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該發(fā)明中含有完整恒河猴尿酸酶基因或帶FC片段的恒河猴尿酸酶基因的真核表達(dá)質(zhì)?？梢园邢蜣D(zhuǎn)入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)有活性的尿酸酶蛋白，達(dá)到治療目的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1為采用引物擴(kuò)增獲得恒河猴RhUOX⑶S序列后構(gòu)建的T載體(TakaraPMD19T)；
圖2為RhU0X/pET-28c重組質(zhì)粒圖譜；
圖3為RhU0X/pcDNA3.1重組質(zhì)粒圖譜；圖4為RhU0X-Fc/pcDNA3.1重組質(zhì)粒圖譜；
圖5為pET-28c載體IPTG誘導(dǎo)RhUOX表達(dá)電泳圖譜；
圖6為RhU0X/pET-28c重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測(cè)，其中Control組為pET-28c空載體，實(shí)驗(yàn)組為RhU0X/pET-28c載體組。與空載體組相比，0001 ；
圖7為pET-DsBA載體IPTG誘導(dǎo)RhUOX表達(dá)電泳圖譜；
圖8為RhUOX/pET-DsBA重組菌裂解液上清RhUOX酶活性檢測(cè)。其中Control組為pET-DsBA空載體，實(shí)驗(yàn)組為RhUOX/pET-DsBA載體組。與空載體組相比，0001 ；
圖9為人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染不同pcDNA3.1真核重組質(zhì)粒后后，細(xì)胞裂解上清液30 μ I與970 μ I尿酸溶液于25°C水浴孵育7 h后，溶液中的尿酸濃度變化情況，其中Lipo2000為轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，pcDNA3.1組為空載體對(duì)照組，RhU0X/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組為實(shí)驗(yàn)組，RhU0X-Fc/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組為實(shí)驗(yàn)組。與空載體組相比，#7X0.001 ;與RhU0X/pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染組相比，***7X0.001。
【具體實(shí)施方式】
[0051]實(shí)施例1:
恒河猴尿酸酶的制備方法
(O獲取恒河猴尿酸酶RhUOX蛋白編碼序列，見(jiàn)序列表1 ;
(2)構(gòu)建恒河猴尿酸酶RhUOX的T載體，如圖1所示，以獲取所需恒河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列；
(3)將恒河猴尿酸酶RhUOX基因編碼序列插入表達(dá)載體；
(4)將表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，并使之表達(dá)，獲得恒河猴尿酸酶RhUOX；
(5)對(duì)恒河猴尿酸酶RhUOX進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后進(jìn)行酶活性測(cè)定。
[0052]采用Trizol法常規(guī)提取恒河猴肝臟的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)合成cDNA,具體操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
[0053]根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的RhUOX cDNA序列，見(jiàn)序列表2，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增獲得恒河猴RhUOX CDS 序列。
[0054]上游引物:5’-GGATCCGAATGGCCGACTACCATAAC-3’ ；
下游引物:5’ -GAATTCGGTCACAGTCTTGAAGACAAC-3’。
[0055]實(shí)施例2:
根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟(2)，步驟(2)中構(gòu)建恒河猴尿酸酶RhUOX的T載體的具體實(shí)施方法:
【權(quán)利要求】
1.一種重組恒河猴尿酸酶蛋白，其特征在于:該尿酸酶蛋白源自于恒河猴。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白，其特征在于:所述尿酸酶蛋白由304個(gè)氨基酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白，其特征在于:所述304個(gè)氨基酸中，包含恒河猴來(lái)源尿酸酶蛋白第2-69位，第156-192位及第202-240位氨基酸序列，見(jiàn)序列表1。
4.一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于:將恒河猴尿酸酶基因編碼序列插入表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體進(jìn)彳丁表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于:所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于:所述原核表達(dá)載體為pET-28c載體或pET-DsBA載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于:所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的基因序列的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于:所述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1載體。
9.一種將權(quán)利要求f 8任一項(xiàng)所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白作為制備治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所`述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物為PEG化的原核表達(dá)出的活性恒河猴尿酸酶蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種重組恒河猴尿酸酶蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述的治療痛風(fēng)或者高尿酸血癥的藥物為表達(dá)出帶FC片段的恒河猴尿酸酶或表達(dá)完整的恒河猴尿酸酶蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103773743SQ201410017486
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】杜艷春 申請(qǐng)人:廈門敖依生物科技有限公司