本發(fā)明涉及分子生物學檢測技術(shù)，具體地說，涉及禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)的特異性PCR擴增引物及檢測體系、含有該引物的試劑盒及其應用。

背景技術(shù)：

玉米是我國最重要的糧食作物之一，隨著食品工業(yè)和飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，玉米作為主要食品和飼料作物的地位也日益上升。穗腐病是玉米生產(chǎn)上的重要病害，由多種病原真菌引起，不僅直接造成玉米產(chǎn)量損失，而且籽粒中的致病菌還能夠產(chǎn)生多種真菌毒素，如單端孢霉烯、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等，導致玉米品質(zhì)下降，給食品與飼料帶來重大的安全隱患，威脅到人畜健康。

鐮孢菌(Fusarium spp.)是玉米生產(chǎn)上常見的病原真菌類群之一，能夠在玉米的根、莖、葉、果上引發(fā)嚴重的病害，造成巨大的經(jīng)濟損失。大量研究表明，鐮孢菌是引起玉米穗腐病最重要的病原菌，此外，還會引起玉米的莖腐病、鞘腐病、頂腐病、根腐病、苗枯病等病害。主要致病鐮孢種包括禾谷鐮孢復合種、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、尖鐮孢復合種、黃色鐮孢、木賊鐮孢等。研究發(fā)現(xiàn)，美國、加拿大、德國、奧地利、尼泊爾、巴西、阿根廷等地的玉米穗腐病致病鐮孢主要為禾谷鐮孢復合種，而加拿大、德國、巴西、阿根廷、法國、意大利、尼羅地亞、尼泊爾、南非、伊朗等地的致病鐮孢主要為擬輪枝鐮孢，層出鐮孢則主要分布在德國、巴西、尼泊爾以及阿根廷西北部。在我國，禾谷鐮孢復合種主要分布于山西、陜西、甘肅、云南、貴州、東北及黃淮地區(qū)，擬輪枝鐮孢主要分布于東北、北京、河北、河南、山東、安徽、四川、湖南、湖北等地，其他致病種也有少量分布。由此可見，禾谷鐮孢分布地區(qū)較廣，是許多地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢致病菌。

由于鐮孢菌在自然界中分布非常廣泛，種類多，形態(tài)變異大，而傳統(tǒng)鐮孢菌分離以形態(tài)學上差異劃分組、種，以不同寄主或不同品種的致病力差異作為?；突蛏硇》N的鑒定手段，給鐮孢菌的識別和鑒定工作帶來了一定的困難。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預警，對于鐮孢種屬的概念在認識上發(fā)生了很大變化，對鐮孢菌分類更接近于自然親緣關(guān)系，因此，開發(fā)不同鐮孢種特異的分子標記，對于準確鑒定鐮孢種具有較大的應用價值。

β微管蛋白(β-tubulin)基因廣泛存在于真核生物中，目前尚無針對該靶基因設(shè)計的特異性禾谷鐮孢檢測引物的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可快速、準確地檢測禾谷鐮孢的特異性PCR擴增引物和檢測體系以及含有該引物的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供上述引物及試劑盒在檢測禾谷鐮孢中的應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從Fusarium Center's database at Penn State數(shù)據(jù)庫中下載禾谷鐮孢(F.graminearum)的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KM373925.1)，分析了禾谷鐮孢與其他鐮孢種在β-tubulin基因序列上的差異(圖1)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個高度特異且只存在于禾谷鐮孢中的位點，利用Primer 5軟件設(shè)計出一系列用于特異檢測禾谷鐮孢的引物，從中篩選出特異性最強的引物Fg18TF/Fg18TR，并設(shè)計了巢式外引物HW18TF/HW18TR來提高靈敏度。在此基礎(chǔ)上建立了檢測禾谷鐮孢的PCR反應體系。

本發(fā)明提供的禾谷鐮孢特異性PCR擴增引物，包括(Seq ID No:1-4)：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’

本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測禾谷鐮孢的試劑盒。

前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、標準陽性模板等中的至少一種。

本發(fā)明還提供上述PCR引物或試劑盒在檢測禾谷鐮孢中的應用，包括以下步驟：

1)提取樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR進行單輪PCR擴增反應；或者，

當模板DNA濃度過低導致無法擴增出條帶時，采用巢式PCR；先利用巢式外引物HW18TF和HW18TR進行第一輪PCR擴增反應，然后取1～2μL擴增產(chǎn)物作為模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR進行第二輪PCR擴增反應；

3)分析PCR擴增產(chǎn)物。

前述的PCR反應體系為：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反應緩沖液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

進行單輪PCR擴增反應以及巢式PCR中第二輪PCR擴增反應，所采用的反應程序為：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

巢式PCR中第一輪PCR擴增反應，所采用的反應程序為：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

對上述PCR擴增產(chǎn)物進行1～2％瓊脂糖凝膠電泳，如果電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)大小約為291bp的特征條帶，則表明樣品中含有禾谷鐮孢。

本發(fā)明所述樣品為含有禾谷鐮孢的菌絲、分生孢子的樣品。

本發(fā)明還提供禾谷鐮孢的特異性PCR檢測體系，包括：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反應緩沖液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

本發(fā)明基于禾谷鐮孢與其他鐮孢種的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列差異，設(shè)計出可快速檢測禾谷鐮孢的特異性PCR引物，并在此基礎(chǔ)上建立了PCR快速檢測體系，可從發(fā)病植物組織及土壤中復雜的病原菌環(huán)境快速、準確地檢測出禾谷鐮孢。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可對禾谷鐮孢的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、分生孢子等進行檢測，對禾谷鐮孢疫情的早期預警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明禾谷鐮孢與其他鐮孢種的β-tubulin基因序列部分比對結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實施例2中利用引物Fg18TF/Fg18TR進行PCR擴增的結(jié)果；其中，1：尖鐮孢；2：層出鐮孢；3：黃色鐮孢；4：茄鐮孢；5：禾谷鐮孢；6：擬輪枝鐮孢；7：變紅鐮孢；8：藤倉鐮孢；9：腐霉菌；10：青霉菌；11：黃曲霉菌；12：木霉菌，M為100bp DNA Ladder。

圖3為本發(fā)明實施例2中引物Fg18TF/Fg18TR的PCR擴增反應體系靈敏度檢測結(jié)果，其中，1-8分別代表DNA樣品經(jīng)10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷與10⁸倍稀釋，M為100bp DNA Ladder。

圖4為本發(fā)明實施例2中利用巢式外引物HW18TF/HW18TR和引物Fg18TF/Fg18TR進行兩輪PCR擴增反應體系靈敏度檢測結(jié)果，其中，1-8分別代表DNA樣品經(jīng)10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷與10⁸倍稀釋，M為100bp DNA Ladder。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1用于檢測禾谷鐮孢的特異性PCR引物的合成

從Fusarium Center's database at Penn State數(shù)據(jù)庫中下載禾谷鐮孢的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KX087134.1)，利用DNAMAN等生物學軟件對禾谷鐮孢和其他鐮孢種的β-tubulin基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個高度特異且只存在于禾谷鐮孢中的位點，利用軟件Primer 5設(shè)計出一系列檢測禾谷鐮孢的引物，從中篩選出特異性、靈敏性最強的引物Fg18TF/Fg18TR(表1)，巢式外引物HW18TF/HW18TR(表2)并在此基礎(chǔ)上建立了檢測禾谷鐮孢的PCR反應體系。

表1禾谷鐮孢特異性PCR檢測引物Fg18TF/Fg18TR信息

表2巢式PCR外引物HW18TF/HW18TR信息

引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

PCR反應體系為：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反應緩沖液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

單輪PCR擴增反應所采用的反應程序為：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

當模板DNA濃度過低導致無法擴增出條帶時，采用巢式PCR。

巢式PCR的反應程序為：

第一輪PCR擴增反應：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

第二輪PCR擴增反應：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

實施例2利用PCR引物Fg18TF/Fg18TR和HW18TF/HW18TR檢測禾谷鐮孢的特異性和靈敏度分析

1.1樣本來源：

本實施例中采用的病原菌包括尖鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、茄鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢、變紅鐮孢、藤倉鐮孢、腐霉菌、青霉菌、黃曲霉菌、木霉菌，均由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供。

1.2鐮孢菌基因組DNA提?。?/p>

將經(jīng)單孢分離的不同鐮孢菌分離物分別轉(zhuǎn)移到不同PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，刮取菌絲晾干后裝于2.0mL離心管中。用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)提取DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和UV-VIS spectrophotometer Q5000紫外-可見分光光度計(Quawell，USA)雙重檢測其含量和純度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3樣品DNA的梯度稀釋：

用UV-VIS spectrophotometer Q5000紫外-可見分光光度計(Quawell，USA)檢測上述提取的禾谷鐮孢樣品的DNA濃度，為1089μg/mL。將DNA樣品進行10倍梯度稀釋，共稀釋8次，最高稀釋至10⁸倍，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴增反應：

擴增反應在Biometra T3000熱循環(huán)儀中進行。PCR反應體系及反應程序同實施例1所述。

1.5結(jié)果：

反應結(jié)束后，將2μL上樣緩沖液(pH8.0的10mmol/L EDTA、98％去離子甲酰胺、0.025％二甲苯青FF)與PCR擴增產(chǎn)物充分混合，取5μL在加有核酸染料的1％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，電壓為50-100V，30min后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄，根據(jù)100bp DNA Ladder估測條帶大小。電泳檢測結(jié)果如圖2所示，泳道5為禾谷鐮孢樣品，能擴增出約291bp的特征條帶，而其他鐮孢種中未出現(xiàn)擴增條帶。上述結(jié)果表明引物Fg18TF/Fg18TR的特異性強，利用該引物能將禾谷鐮孢與其他真菌明顯區(qū)分開來。

分別以上述8個濃度梯度稀釋的DNA樣品為模板進行單輪PCR擴增反應。PCR擴增程序和擴增產(chǎn)物檢測方法同上。結(jié)果如圖3所示，當稀釋至100倍時，條帶不明顯。因此，該引物對的靈敏度可達100μg/mL，檢測靈敏度相對較低。

分別以上述8個濃度梯度稀釋的DNA樣品為模板利用巢式PCR引物HW18TF/HW18TR先進行一輪PCR擴增，再取1μL反應產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增，PCR擴增程序和擴增產(chǎn)物檢測方法同上。結(jié)果如圖4所示，當稀釋至10⁸倍時，條帶不明顯。因此，利用巢式PCR可將引物靈敏度提升至100fg/mL，檢測靈敏度非常高。

利用本發(fā)明的PCR反應體系，可對不同禾谷鐮孢染病樣品進行定性分子檢測，應用該方法可準確預測大田禾谷鐮孢消長動態(tài)和疫情發(fā)展趨勢，便于及時確定病害最佳防控時期，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，達到高效治理禾谷鐮孢病害的目的。隨著PCR技術(shù)的普及，應用PCR技術(shù)檢測病害比起傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法其操作更加的簡單，快速，成本低。且本發(fā)明利用了巢式PCR，其靈敏度達到了100fg/mL，相對于ZL201410456539.8基于LAMP方法檢測的下限為100pg，本方法檢測的靈敏度提高了1000倍，可廣泛用于檢測更低濃度的病原菌。

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對PCR引物擴增完整的片段，由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增有效避免了第二輪PCR產(chǎn)物因引物配對特異性不強而造成的非特異性擴增現(xiàn)象，因此巢式PCR特異性非常強。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所

<120> 禾谷鐮孢的特異性PCR擴增引物及檢測體系與應用

<130> KHP171111649.1TQ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtaagtgt tttcctctga cct 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaaagcagc accgatttgg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacatgcgtg agattgtaag tgtt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taaacaccat tgctgtcgag a 21