本發(fā)明主要涉及神經(jīng)膠質(zhì)瘤領(lǐng)域，尤其涉及一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備方法及裝置。
背景技術(shù)：
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40-50％，以發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死率高，成為腫瘤治療的難題。傳統(tǒng)治療方法主要是手術(shù)和放化療來提高患者的生存機率。但是位于重要功能區(qū)的膠質(zhì)瘤很難做到全切除。放射治療幾乎是各型膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療，但療效評價不一，除髓母細(xì)胞瘤對放療高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他類型對放療均不敏感?；熕幬锵抻谘X屏障及藥物的毒副作用，療效尚不肯定。近年來，免疫治療成為腦膠質(zhì)瘤繼手術(shù)、放化療后的有效治療手段。與其他方式聯(lián)合應(yīng)用，具體有很強的互補作用，對患者受損的免疫系統(tǒng)能夠起到恢復(fù)與重建的獨特療效，從而進(jìn)一步防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
現(xiàn)有技術(shù)中通過對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)后裂解得到神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原，由于傳統(tǒng)裂解主要采用反復(fù)凍融或輻射等辦法，造成裂解不完全無法獲得全抗原信息，并且培養(yǎng)液中存在一定的微生物污染，以及動物源免疫原性，因此導(dǎo)致獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞制備的抗原穩(wěn)定性較差，特異性較弱，從而通過該抗原所獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗具有穩(wěn)定性差、特異性較弱、殺瘤率不高以及免疫原性弱等缺陷。
在正常的生理機能狀況下細(xì)胞膜能較好地阻礙離子和親水分子的傳輸。但在一定劑量的電脈沖作用下將發(fā)生電穿孔現(xiàn)象,細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜被暫時重新排列形成了一些被稱為微孔的親水性通道,使親水性大分子能順利通過。細(xì)胞膜穿孔時電導(dǎo)率發(fā)生改變,如對鈉離子和鉀離子的電導(dǎo)率通常小于1ms/cm2；當(dāng)跨膜電壓超過膜的絕緣強度時,電導(dǎo)率在較短時間內(nèi)將激增至1s/cm2,導(dǎo)致細(xì)胞膜阻礙微粒滲透能力降低電場取消后,大多數(shù)情況下微孔會關(guān)閉而不會對細(xì)胞造成任何影響,這種在短時電脈沖作用下細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時微孔的物理過程稱為電穿孔即可逆性電擊穿(reb)。電穿孔使細(xì)胞膜滲透性大大增強,由此提出了電穿孔療法。增加電脈沖劑量則細(xì)胞膜出現(xiàn)不可恢復(fù)的破裂使細(xì)胞擊穿,此為不可逆性電擊穿(ireb),且已用于腫瘤細(xì)胞裂解研究中
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，為了解決目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤抗原制備過程中，裂解不充分，污染嚴(yán)重?zé)o法獲得全抗原信息等問題，本發(fā)明基于脈沖擊穿原理，提供了一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備方法及裝置。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備方法及裝置，包括如下步驟：
一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備方法，包括如下步驟：
將新鮮的人腦膠質(zhì)瘤組織用緩沖液洗凈血污，剪切成lmm3大小的膠質(zhì)瘤組織塊備用；
將神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織塊中獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
增殖后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞分離出神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞；
采用無血清培養(yǎng)液對所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行的增殖培養(yǎng)，并獲得對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞；
將對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞放置于預(yù)處理室一、預(yù)處理室二中進(jìn)行預(yù)處理；
將預(yù)處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合放置于裂解處理室一中進(jìn)行脈沖裂解及同步離心處理；
棄上清液，將以上處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合液放置于裂解處理室二中進(jìn)行再次脈沖裂解，即收獲神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
進(jìn)一步，將個數(shù)比為1:2-1:5的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞分別放置于預(yù)處理室一及預(yù)處理室二中進(jìn)行裂解預(yù)處理5-10min；
所述預(yù)處理室一中以co2氣氛完全填充，溫度保持為37℃-45℃，電脈沖參數(shù)設(shè)置為：峰值1-2kv/cm、脈寬100μs、頻率1-4hz，脈沖個數(shù)4-10；
所述預(yù)處理室二中以co2氣氛完全填充，溫度保持為40℃-45℃，電脈沖參數(shù)設(shè)置為：峰值2-5kv/cm、脈寬50μs、頻率4-8hz，脈沖個數(shù)6-10。
所述預(yù)處理室一、預(yù)處理室二采用co2氣氛完全填充，以防止預(yù)處理時外界空氣的進(jìn)入引起污染；預(yù)處理室一、預(yù)處理室二采用低頻脈沖對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行可逆性擊穿，以提升神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞細(xì)胞膜的透過性，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞膨脹的目的。同時預(yù)處理室一、預(yù)處理室二中的溫度控制，可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞細(xì)胞膜變化，加快神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞膨脹過程。
由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞比神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞體積大很多，自身膨脹空間有限，因此本發(fā)明預(yù)處理室一中脈沖頻率要低于預(yù)處理室二中脈沖頻率。
進(jìn)一步，棄上清液，將預(yù)處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合放置于裂解處理室一中進(jìn)行脈沖裂解及同步離心處理4.5-10min；
所述裂解處理室一中以co2氣氛完全填充，溫度設(shè)置為：從37℃每30s上升1℃至45℃；
電脈沖參數(shù)設(shè)置為：20-250v,脈沖寬度1-20ps,重復(fù)頻率10hz-1khz獨立可調(diào)的指數(shù)衰減波形,其脈沖陡度即上升時間90-180ns；
所述離心參數(shù)為：1000r/min上升至5000r/min，5min內(nèi)完成。
同理，裂解處理室一中以co2氣氛完全填充，用于避免裂解過程中受到外界污染；并采用階梯式的溫度提升方式可穩(wěn)定的促進(jìn)膨脹后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞細(xì)胞膜的形態(tài)變化。
裂解處理室一采用陡脈沖對膨脹后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行不可逆的電擊穿，可促使神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞快速的釋放抗原物質(zhì)，同時不可逆脈沖可以滅活污染細(xì)菌，徹底消除污染源。
在進(jìn)行陡脈沖裂解時，離心處理同步進(jìn)行，此操作可以加速神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的裂解，使得抗原物質(zhì)充分釋放與融合，并且離心的同步進(jìn)行可以防止脈沖擊穿時氣泡的堆積，發(fā)生氣體擊穿引起裝置損壞。
同時離心轉(zhuǎn)速由1000r/min上升至5000r/min，5min內(nèi)完成，此設(shè)置使得轉(zhuǎn)速平穩(wěn)提升，有利于保持裂解過程中的均勻性。
進(jìn)一步，棄上清液，將以上處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合液放置于裂解處理室二中進(jìn)行再次脈沖裂解20-30min，直到混合液中ph值波動幅度小于0.05；
其中，所述裂解處理室二中以co2氣氛完全填充，溫度保持為37℃；
電脈沖參數(shù)設(shè)置為：峰值1-2kv/cm、脈寬100μs、頻率1-4hz，脈沖個數(shù)4-10。
所述裂解處理室二中采用低頻脈沖對高頻陡脈沖處理后的混合液進(jìn)行再次的低頻處理，目的是使得混合液中抗原信息的進(jìn)一步釋放。由于細(xì)胞裂解釋放物質(zhì)會引起混合液ph數(shù)值發(fā)生變化，因此本發(fā)明以混合液中ph值波動幅度為參照依據(jù)，判定混合液裂解是否完全充分。
本發(fā)明解決以上技術(shù)問題還提供一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備裝置，包括：微型控制器以及與所述微型控制器連接的電源模塊、控制模塊、預(yù)處理模塊、檢測反饋模塊、裂解處理模塊，所述預(yù)處理模塊連接有預(yù)處理室一、預(yù)處理室二，所述檢測反饋模塊連接有溫度檢測傳感器組、ph檢測傳感器、全反射氣泡檢測器，所述裂解處理模塊連接有裂解處理室一、裂解處理室二、離心器、溫度控制器、抽真空處理器。
所述微型控制器作為本裝置控制中心，用于整個裝置的協(xié)調(diào)控制，所述電源模塊用于本裝置的電力供給，所述控制模塊用于整個裝置的操作控制，所述預(yù)處理模塊用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的膨脹處理及殺菌處理，所述裂解處理模塊用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的裂解及抗原制備。
進(jìn)一步，所述預(yù)處理室一、預(yù)處理室二、裂解處理室一、裂解處理室二中上分別設(shè)置有脈沖發(fā)生器，所述脈沖發(fā)生器設(shè)置有多孔納米電極，所述多孔納米電極設(shè)置于預(yù)處理室一、預(yù)處理室二、裂解處理室一、裂解處理室內(nèi)部。
所述脈沖發(fā)生器用于周期低頻或高頻陡脈沖的發(fā)生，所述多孔納米電極由于多孔結(jié)構(gòu)表面積較大，其產(chǎn)生的電場輻射范圍更廣，有利于預(yù)處理及裂解處理的效率的提升。
進(jìn)一步，所述預(yù)處理室一、預(yù)處理室二、裂解處理室一、裂解處理室中分別設(shè)置有溫度傳感器。所述溫度傳感器用于預(yù)處理室一、預(yù)處理室二、裂解處理室一、裂解處理室二中溫度數(shù)據(jù)的采集，并將采集數(shù)據(jù)發(fā)送至檢測反饋模塊進(jìn)行放大、濾波、數(shù)值轉(zhuǎn)換等處理，最后傳送至微型控制器進(jìn)行分析，并通過溫度控制器進(jìn)行溫度實時控制。
進(jìn)一步，所述裂解處理室一固定設(shè)置于離心器上，用于實現(xiàn)高頻陡脈沖裂解與離心的同步處理，有利于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的加速裂解及氣泡擊穿的發(fā)生。
進(jìn)一步，所述全反射氣泡檢測器設(shè)置于裂解處理室一內(nèi)部，所述ph檢測傳感器設(shè)置于裂解處理室二內(nèi)部，由于高頻擊穿過程中很容易產(chǎn)生電離氣體，所述全反射氣泡檢測器利用全反射原理用于對裂解處理室一中氣泡產(chǎn)生量的數(shù)據(jù)采集，并將采集數(shù)據(jù)傳送至檢測反饋模塊進(jìn)行放大、濾波、數(shù)值轉(zhuǎn)換等處理，最后傳送至微型控制器進(jìn)行分析，若氣泡流量達(dá)到預(yù)設(shè)值，微型控制器啟動抽真空處理器進(jìn)行抽氣加壓處理，使得裂解混合液中氣體被排除。所述ph檢測傳感器用于裂解處理室二中ph數(shù)值變化的采集，并將采集數(shù)據(jù)傳送至檢測反饋模塊進(jìn)行放大、濾波、數(shù)值轉(zhuǎn)換等處理，最后傳送至微型控制器進(jìn)行分析，若裂解處理室二中混合液ph值波動幅度小于0.05ph，微型控制器判定整個裂解完成。
進(jìn)一步，所述抽真空處理器通過氣管與裂解處理室一連通，用于實現(xiàn)裂解處理室一中抽氣處理。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明采用低頻及高頻陡脈沖實現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞分階段處理與裂解，操作簡單，裂解更加充分、快速，可獲得更加完整的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤抗原。
附圖說明
圖1本發(fā)明一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原制備裝置結(jié)構(gòu)圖。
具體實施方式
以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備
實施例1
將新鮮的人腦膠質(zhì)瘤組織用緩沖液洗凈血污，剪切成lmm3大小的膠質(zhì)瘤組織塊備用；將神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織塊中獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；增殖后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞分離出神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞；采用無血清培養(yǎng)液對所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行的增殖培養(yǎng)，并獲得對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞；將個數(shù)比為1:2的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞分別放置于預(yù)處理室一及預(yù)處理室二中進(jìn)行裂解預(yù)處理5-10min；所述預(yù)處理室一中以co2氣氛完全填充，溫度保持為37℃，電脈沖參數(shù)設(shè)置為：峰值1kv/cm、脈寬100μs、頻率1hz，脈沖個數(shù)10；所述預(yù)處理室二中以co2氣氛完全填充，溫度保持為40℃，電脈沖參數(shù)設(shè)置為：峰值2kv/cm、脈寬50μs、頻率8hz，脈沖個數(shù)10。棄上清液，將預(yù)處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合放置于裂解處理室一中進(jìn)行脈沖裂解及同步離心處理4.5-10min；所述裂解處理室一中以co2氣氛完全填充，溫度設(shè)置為：從37℃每30s上升1℃至45℃；電脈沖參數(shù)設(shè)置為：250v,脈沖寬度20ps,重復(fù)頻率1khz獨立可調(diào)的指數(shù)衰減波形,其脈沖陡度即上升時間180ns；所述離心參數(shù)為：1000r/min上升至5000r/min，5min內(nèi)完成。
實施例2
實驗一體外殺瘤實驗
將靶細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)接種于96孔板中(三復(fù)孔),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)100h后用絲裂霉素c處理。取共培養(yǎng)后的效應(yīng)細(xì)胞按效靶比為1:1、5:1、10:1、20:1、40:l加入96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后以krp緩沖處理后加入lml含0.5μc/ml[甲基-3h]-胸腺嘧啶核苷37℃孵育12-18小時,以預(yù)冷的含10mmol/l葡萄糖的pbs快速沖洗10次中止反應(yīng)。取細(xì)胞裂解液,gamma-5500液閃計數(shù)測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。
根據(jù)公式殺傷率(％)＝[靶對照組cpm一(效靶組cpm一效應(yīng)對照組cpm)/靶對照組cpm]×100％計算殺傷率。
結(jié)果：實驗組較對照組具有更強的殺傷能力。效靶比60:1時,實驗組疫苗能殺傷86.91％士6.79％神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞樣細(xì)胞和80.82％士6.36％干細(xì)胞樣細(xì)胞,而對照組僅能殺傷25.7％士7.25％神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞樣細(xì)胞和50.15％士4.69％干細(xì)胞樣細(xì)胞。
實施例3
實驗二體內(nèi)殺瘤實驗
實驗步驟：將荷瘤小鼠隨機分為三組：實驗組、對照組和空白組，空白組尾根部皮下注射生理鹽水；對照組尾根部皮下注射現(xiàn)有神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗(105個/ml,0.3ml)；實驗組尾根部皮下注射該發(fā)明實施例1中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗(105個/ml,0.3ml)疫苗；觀察50d內(nèi)各組小鼠的生存周期。
結(jié)果：經(jīng)生存周期分析發(fā)現(xiàn):各實驗組大鼠的中位生存期分別為:對照組18d天,實驗組為33d空白對照組6d。
實驗動物外周血ifn-γ檢測結(jié)果:各組大鼠外周血ifn-γ濃度分別為:現(xiàn)有疫苗組120.12士2.13pg/ml,實驗組181.76士6.95pg/ml,空白組為78.98士5.74pg/ml。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。