專利名稱：抗腫瘤整合素αVβ的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及整合素抗原及其編碼基因與應用，特別是涉及一種整合素αVβ3的抗原及其編碼基因與其在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康的最重要殺手之一。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤的血管形成密切相關，對根治性切除術的術后患者來說，無微血管侵襲的患者5年復發(fā)率為11％，而存在微血管侵襲的患者5年復發(fā)率高達50％。由于腫瘤區(qū)血管具有相同的特點，因此抗血管形成治療適用于多種實體腫瘤。以血管為靶點、抑制血管形成，從而抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移已成為一條新的腫瘤治療途徑。
研究表明，血管的形成不僅取決于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptors，VEGF-R)，同時也受到細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白受體—整合素(integrin)的影響[Kerbel RS.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature，1997，390(6658)335-336.Ellis LM..Angiogenesis and its role incolorectal tumor and metastasis formation[J].Semin Oncol，2004，31(6)3-9.]。其中，VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3與腫瘤血管形成的關系最為密切，可以作為抑制病理性血管形成的直接靶標。
近年來，對血管形成機理的研究已經(jīng)越來越完善。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管的形成不僅取決于內(nèi)皮生長因子及其受體，也受到細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白受體—整合素αVβ3的影響[Stromblad S，Becker JC，Yebra M，et al.Suppression of p53activity and p21WAF1/CIP1expression by vascular cellintegrin alphaVbeta3 during angiogenesis[J].J Clin Invest，1996，98(2)426-433.]。腫瘤組織中新生的血管內(nèi)皮細胞表達高水平的αVβ3，而成人正常血管內(nèi)皮細胞中無表達或某些組織極低水平表達。它可以在內(nèi)皮細胞表面引發(fā)MMP-2降解基質(zhì)的活性，并且抑制內(nèi)皮細胞的p53及其所誘導的p21蛋白的活性，從而表現(xiàn)出抗凋亡效應。大量實驗表明，動物體內(nèi)應用整合素αVβ3拮抗劑，可導致參與生成血管的內(nèi)皮細胞的凋亡；抗αVβ3抗體或αVβ3的拮抗劑能破壞鵪鶉胚胎、鼠視網(wǎng)膜、兔角膜的新生血管生成；腫瘤模型中應用αVβ3的拮抗劑不僅阻止了腫瘤相關的血管生成，而且可以引起腫瘤的退縮。αVβ3是由αV鏈和β3鏈非共價結(jié)合構(gòu)成的一個異二聚體的跨膜糖蛋白，是一個能與ECM廣泛結(jié)合的受體，凡是具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的ECM蛋白均能與其結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤血管形成作用的整合素αVβ3抗原。
本發(fā)明所提供的整合素αVβ3抗原，來源于非洲爪蟾，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №1由142個氨基酸殘基組成。
編碼上述整合素αVβ3抗原的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍，可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №2由426個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-426位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明整合素αVβ3抗原基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增所述抗原基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
與上述整合素αVβ3抗原特異結(jié)合的抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述抗體包括單克隆抗體及多克隆抗體，均可按照常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達上述整合素αVβ3抗原的方法。
本發(fā)明所提供的表達上述整合素αVβ3抗原的方法，是將含有上述整合素αVβ3抗原基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到整合素αVβ3抗原。
用于構(gòu)建所述重組表達載體的出發(fā)載體可為在大腸桿菌中表達外源基因的表達載體，如pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c，優(yōu)選為pGEX-4T-2。
以pGEX-4T-2為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述整合素αVβ3抗原基因的重組表達載體為pGEX-αVβ3。
上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coliTop10等。
可采用構(gòu)建工程菌所用的出發(fā)菌株的常規(guī)培養(yǎng)條件對工程菌進行培養(yǎng)，當所述工程菌為重組大腸桿菌時，需加入IPTG誘導劑，所加入IPTG的濃度為0.8-1.2mmol/L，優(yōu)選為1mmol/L，誘導溫度為35-39℃，優(yōu)選為37℃，誘導時間為2-4小時，優(yōu)選為3小時。
本發(fā)明的整合素αVβ3抗原可用于制備預防和/或治療性腫瘤疫苗，編碼整合素αVβ3抗原的基因可用于制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗。
所述預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗中的整合素αVβ3抗原基因可存在于真核表達載體中。
用于構(gòu)建攜帶有整合素αVβ3抗原基因的真核表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可在哺乳動物中表達外源基因的表達載體，優(yōu)選為pCI-GPI，其物理圖譜見圖18。
以pCI-GPI為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶有整合素αVβ3抗原基因的重組表達載體為pCI-αVβ3。
需要的時候，以血管內(nèi)皮生長因子VEGF-E抗原制備的疫苗中還可以融入顆粒白細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細胞因子的基因或蛋白質(zhì)作為分子免疫佐劑。
本發(fā)明提供了整合素αVβ3的抗原及其編碼基因。以分別含有本發(fā)明整合素αVβ3抗原基因及小鼠中相應區(qū)段的真核表達質(zhì)粒作為免疫原免疫小鼠，結(jié)果與PBS、空載體和同種抗原對照組相比，抗原組小鼠血清中均產(chǎn)生了較高水平的抗體，抗原組小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數(shù)量明顯增加，CD4+/CD8+的比值也明顯升高，且本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應；免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS、空載體和同種抗原對照組相比，抗原組小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原的抑瘤效果更加顯著，抑瘤率可達80％以上。上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明的整合素αVβ3抗原及其編碼基因具有顯著的抑瘤效果，且具有表達量高，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低的優(yōu)點，可制備成預防和/或治療性腫瘤藥物及疫苗。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為用中心模板法分五步PCR擴增整合素αVβ3抗原基因的模式2為PCR擴增整合素αVβ3抗原基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為PCR擴增的mαVβ3基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞mRNA的RT-PCR鑒定結(jié)果圖5為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測結(jié)果圖6為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Western Blotting鑒定結(jié)果圖7為整合素αVβ3抗原基因原核表達載體的構(gòu)建流程8為pCI-αVβ3和pGEX-4T-2質(zhì)粒SalI和NotI雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖9為原核表達及純化的整合素αVβ3抗原的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖10為免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測結(jié)果圖11為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的流式細胞儀測定結(jié)果圖12為免疫小鼠中CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的柱狀13為各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間圖14為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積測量結(jié)果圖15為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤重測量結(jié)果圖16為以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果圖17為皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積圖18為載體pCI-GPI的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有引物合成及測序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。
實施例1、整合素αVβ3抗原的設計及其編碼基因的克隆一、整合素αVβ3抗原的設計通過國內(nèi)外大范圍文獻檢索及序列比較，獲得了一系列整合素αVβ3功能性區(qū)域的氨基酸序列及其在不同物種中的同源性差異。選取非洲爪蟾αVβ3全長中的功能性片段包括自氨基端(N端)第118-131，126-129，217-231，211-221，109-118，99-118，209-220位由142個氨基酸殘基組成的序列，即序列表中的SEQ ID №1。
二、整合素αVβ3抗原基因及其鼠源相應基因的克隆根據(jù)步驟一設計的整合素αVβ3抗原的氨基酸序列推導出編碼該序列的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №2，由426個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-426位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將全基因分成兩段，利用中心模板法分5步合成該基因，同時克隆出小鼠αVβ3相應的片段作為對照，簡稱mαVβ3，具體方法如下1、整合素αVβ3抗原基因的克隆根據(jù)推導的整合素αVβ3抗原基因的核甘酸序列設計PCR擴增引物，并在引物F5、R5兩端分別添加限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR V識別位點，引物序列如下前段F1 5’-ATGATTTAATTAAGATCCAAACCCTGGGCACTAGTTTGTCAGAGA-3’前段R1 5’-ATCCGCAGGTTACTAGTTAGCCGGCGCATCCTCTCTGACAAACTA-3’前段F2 5’-ACCTTATGGACCTTTCCTATTCCATGAAGGATGATTTAATTAAGA-3’前段R2 5’-ATCGGCTTGTCAACGAATGCACCAAATCCAATCCGCAGGTTACTA-3’前段F3 5’-AAGTAGAAGACTATCCTGTGGACATATACTACCTTATGGACCTTT-3’前段R3 5’-TCAGGAGGTGACATGAACATGTACGGTGACATCGGCTTGTCAACG-3’前段F4 5’-GTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAGTAGAAGACTATC-3’前段R4 5’-ATAGCATGGGTTCTTGATGACTTCAGGAGGTGACATG-3’后段F1 5’-GCACGTCTTGACTTTGACAGAGGAAGTCTTGCTGTTTAACGAGGAGGT-3’后段R1 5’-GAGAATCCCGGTTTCGGGAGACCTTCTGTTTCTGGACCTCCTCGTTAA-3’后段F2 5’-TCAATACCGAGTGCATGCCGACATTCGGATATAAGCACGTCTTGACTT-3’后段R2 5’-GCTGCCTGTAGCACCGCATCAAATCCACCCTCTGGAGAATCCCGGTTT-3’后段F3 5’-CCTGAAGTCATCAAGAATCCATGCTATGAATTCAATACCGAGTGC-3’后段R3 5’-ATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCGCATACTGCTGCCTGTAGCAC-3’F5 5’-GCCTCGAGGTCTTCAACCTACAGGTGAGGCAAG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點)R5 5’-GCGATATCATTTCTCCAGCCAATCTTCTCGTCG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRV識別位點)采用中心模板法分五步PCR擴增目的基因，合成模式圖見圖1(F上游引物，R下游引物)，將全基因分成前、后兩段，兩片段均用四步PCR合成法獲得目的基因，然后利用PCR方法將前后兩端拼接起來，具體方法如下第一步擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，引物R1、F1(20μM)各1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共5個循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸10min。
第二步、第三步和第四步擴增均以上一步PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作模板進行。擴增體系同上，只是引物第二步PCR擴增選用引物和F2，第三步選用引物R3和F3，第四步選用引物R4和F4。PCR反應條件為94C 1min，55C1min，72C 1min，共30個循環(huán)。四次PCR擴增后所得的兩段目的基因，分別命名為前段和后段。
最后一步PCR擴增體系為10×PCR緩沖液5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)F5和R5各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，稀釋50倍后的前段1μl，稀釋50倍后的后段1μl，加去離子水至50μl。PCR反應條件同步驟二至四。五次PCR擴增后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1-4.前段分步PCR產(chǎn)物；泳道5.αVβ3的PCR終產(chǎn)物(426bp)；泳道6-8.后段分步PCR產(chǎn)物)，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為426bp的基因片段(圖2中箭頭所指片段)，與預期結(jié)果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結(jié)果擴增片斷具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，擴增序列正確。
2、小鼠中相應基因片斷的擴增1)設計引物根據(jù)GeneBank中小鼠的整合素αVβ3基因序列(序列號L-13591)設計擴增相應區(qū)域(將該片段命名為mαVβ3)的引物，并在上、下游引物的兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶Xho I和EcoR V的識別位點，引物序列如下F6(上游引物)5’-GCGCTAGCATCTTCTCACTTCAAGTGCGGCAGGT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Xho I識別位點)R6(下游引物)5’-GCGATATCATTCCTCCAGCCAATTTTTTCATCAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR V識別位點)。
2)制備鼠胚組織勻漿斷頸處死孕鼠，浸泡于75％乙醇中5min；無菌取出子宮及其中的胚胎、胎盤，用剪刀盡量剔除脂肪和結(jié)締組織并剪碎；將剪碎的組織放于研缽中加液氮研細至粉末狀，收集于冰預冷的玻璃勻漿器中，加入1mL Trizol，勻漿至透明；組織勻漿迅速轉(zhuǎn)入無菌RNase-free EP管中備用。
3)Trizol法提取組織勻漿的總RNA收獲組織勻漿的EP管中加入氯仿200μl，立即顛倒混勻15s，室溫靜置5min；4℃/12000rpm，離心15min；小心將上層液相移入另一新的無菌RNase-free的1.5mL EP管中，加入等量的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；4℃、12000rpm離心10min；棄上清，加入75％的乙醇1mL，顛倒混勻，4℃、7500rpm離心5min，棄上清；重復上步后徹底棄上清，將沉淀自然干燥，加入DEPC水10μl溶解沉淀，直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應。
4)逆轉(zhuǎn)錄反應將步驟3)提取的小鼠胚組織的總RNA為模板，以olig(dT)20為引物，用美國Invitrogen的SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase并參照產(chǎn)品說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
5)mαVβ3的PCR擴增以步驟4)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，在引物F6和R6的引導下進行PCR擴增，100μl PCR反應體系為2×GC緩沖液I(TaKaRa公司La Taq附帶)50.0μl，dNTPs混合物(2.5mM)16.0μl，TaKaRa La Taq(5U/μl)1.0μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μl，F(xiàn)6(20μM)2.0μl，R6(20μM)2.0μl，用滅菌去離子水補充總體積至100μl。PCR反應條件先94℃預變性5分鐘；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分鐘，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道1為DL-2000Marker；泳道2為擴增基因)，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為426bp的基因片段，與預期結(jié)果相符。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化該目的片段，將其克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)中，對含有回收片斷的重組載體進行測序，結(jié)果擴增序列正確。
實施例2、整合素αVβ3抗原基因真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定一、整合素αVβ3抗原基因真核表達載體的構(gòu)建將實施例1擴增的整合素αVβ3抗原基因用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR V進行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pCI-GPI[在Promega公司的真核表達質(zhì)粒pCI-neo+基礎上構(gòu)建而成。主要是在pCI-neo+原多克隆位點Nhe I和Xba I酶切位點之間插入通用序列構(gòu)建而成。通用序列的基因順序為5’-Nhe I-信號肽-Xho I-EcoR V-EcoRI-IgG Fc-GPI-Xba I-3’，外源免疫分子基因可以在Nhe I-EcoR I之間選擇合適的酶切位點插入。pCI-GPI除含有人IgG Fc段(GenBank號Z17370)和糖基化磷脂酰肌醇GPI(GenBank號XM676434)編碼序列外，還含有pCI載體的主要骨架結(jié)構(gòu)，如CMV早期啟動子、嵌合內(nèi)含子、Neo篩選標記、SV40增強子和氨芐抗性基因Ampr+等，物理圖譜見圖18]在16℃下連接12-24小時，連接體系為10×T4DNA連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，PCR純化產(chǎn)物4μl，pCI-GPI載體1μl，加滅菌雙蒸水至10μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選。然后挑取在抗性平板上長出的單菌落進行菌落PCR鑒定將單菌落接種于3mL含100mg/mL氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)3h。培養(yǎng)結(jié)束后，取1μl菌液用100μl水稀釋，煮沸10min，12000rpm離心3min，取上清做模板，在引物F5和R5的引導下進行PCR擴增，25μl PCR反應體系為上清5μl，引物F5和R5各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應條件先94℃預變性5分鐘；然后94℃30s，60℃30s，72℃2分鐘，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)PCR擴增可獲得長度約為426bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經(jīng)PCR鑒定出的陽性重組子的質(zhì)粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結(jié)果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了血管內(nèi)皮生長因子受體VEGF-R2抗原基因的真核表達載體，命名為pCI-αVβ3。同時用相同方法將實施例1擴增的小鼠mαVβ3基因片段也連接入載體pCI-GPI中，得到mαVβ3的真核表達載體，命名為pCI-mαVβ3。
二、真核表達質(zhì)粒的鑒定1、瞬時轉(zhuǎn)染RenCa細胞將步驟一獲得的分別攜帶有真核表達載體pCI-αVβ3和pCI-mαVβ3的陽性克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)12-24小時，用QIAGEN公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒并參照產(chǎn)品說明書提取質(zhì)粒，然后用QIAGEN公司的轉(zhuǎn)染試劑SuperFectTransfection Reagent并參照產(chǎn)品說明書將pCI-αVβ3和pCI-mαVβ3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎癌細胞系RenCa，以pCI-neo(Promega公司)為對照。
2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選將轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)約48小時至細胞密度達到50-70％融合時，棄培養(yǎng)液，換用含有G-418(400μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)進行抗性細胞篩選培養(yǎng)，同時用未轉(zhuǎn)染的RenCa細胞作對照。當對照細胞幾乎全部死亡時，G-418濃度可降至200μg/mL以維持篩選作用。兩周后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸增大后，用0.25％(質(zhì)量百分濃度)的胰酶將細胞消化下來，用有限稀釋法挑取單克隆并進行擴大培養(yǎng)。
3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的鑒定1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞mRNA的RT-PCR鑒定用0.25％的胰酶將擴大培養(yǎng)的單克隆細胞消化制成單細胞懸液，收集于玻璃離心管中，1000rpm離心5min，棄上清；PBS洗三次后完全吸棄上清；重懸細胞并計數(shù)，使細胞的終密度為1×106/mL；取1mL細胞懸液加1mL Trizol混勻，提取細胞總RNA，然后用引物F5和R5對轉(zhuǎn)染有pCI-αVβ3質(zhì)粒的細胞進行RT-PCR鑒定，用引物F6和R6對轉(zhuǎn)染有pCI-mαVβ3質(zhì)粒的細胞進行RT-PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.αVβ3；泳道2.mαVβ3)，經(jīng)擴增均獲得了長度約為426bp的片段，表明整合素αVβ3基因在轉(zhuǎn)染有pCI-αVβ3質(zhì)粒的RenCa細胞中已在mRNA水平上表達，mαVβ3基因在轉(zhuǎn)染有pCI-mαVβ3質(zhì)粒的RenCa細胞中也已在mRNA水平上表達。
2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測將步驟1)鑒定的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(以pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞和RenCa細胞為對照)用0.25％的胰酶消化制備成單細胞懸液；PBS洗3次后，封閉劑(3％BSA)室溫封閉20-30分鐘；去除封閉劑，加入熒光素標記的鼠抗人IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司)，4℃避光孵育12-24小時；PBS洗3次，調(diào)整細胞濃度至5×105/mL；細胞懸液滴到載玻片上，封片劑(購自北京中杉金橋技術有限公司)封片。檢測結(jié)果如圖5所示(1.pCI-αVβ3轉(zhuǎn)染細胞；2.pCI-mαVβ3轉(zhuǎn)染細胞；3.pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞；4.RenCa細胞)，表明整合素αVβ3抗原基因、mαVβ3基因分別在各自的轉(zhuǎn)染細胞中獲得表達。
3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Western Blotting鑒定將步驟2)鑒定的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(以pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞和RenCa細胞為對照)用0.25％胰酶消化，收集細胞，PBS洗滌兩次；用含1％Triton X-100的TBS(50mMTris-Cl，pH7.6，150mM NaCl)裂解細胞30min；4℃、12000rpm離心10min收集上清；對待測樣品進行15％SDS-PAGE電泳分離后，用半干轉(zhuǎn)移儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(電壓15V，轉(zhuǎn)移1小時)；用含5％脫脂奶粉的TBST(TBS+0.05％Tween 20)室溫封閉1小時；用HRP標記的鼠抗人IgG單克隆抗體(購自北京中杉金橋技術有限公司，按1∶500比例稀釋)4℃孵育12-24小時；TBST洗滌后，加辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司，按1∶2000比例稀釋)室溫孵育2小時；TBST洗滌后，用ECL進行曝光顯色。檢測結(jié)果如圖6所示(泳道1.pCI-αVβ3轉(zhuǎn)染細胞；泳道2.pCI-mαVβ3轉(zhuǎn)染細胞；泳道3.pCI-neo+轉(zhuǎn)染細胞；泳道4.RenCa細胞)，進一步證明整合素αVβ3抗原基因、mαVβ3基因分別在各自的轉(zhuǎn)染細胞中獲得表達。
實施例3、整合素αVβ3抗原基因的原核表達一、整合素αVβ3抗原基因原核表達載體的構(gòu)建參見圖7構(gòu)建整合素αVβ3抗原基因的原核表達載體，具體方法為將純化的pCI-αVβ3質(zhì)粒和pGEX-4T-2(Pharmacia公司)分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I進行雙酶切，對酶切產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖8所示(泳道M1.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-15000；泳道M2.DNA相對分子質(zhì)量標準DL-2000；泳道1.pGEX-4T-2酶切前；泳道2.pGEX-4T-2酶切后；泳道3.pCI-αVβ3的酶切片段)，用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化線形化的pGEX-4T-2及426bp的pCI-αVβ3的酶切片段(圖8中箭頭所指片段)，然后將純化的目的片段和線性化pGEX-4T-2載體16℃連接12-24小時，連接體系為10×連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl，目的基因4μl，pGEX-4T-2載體1μl，用雙蒸水補充反應體系至10μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選，然后挑取在抗性平板上長出的單菌落并在引物F5和R5的引導下進行菌落PCR鑒定，經(jīng)PCR擴增可獲得長度約為426bp的DNA片段的為陽性重組子。提取經(jīng)PCR鑒定出的陽性重組子的質(zhì)粒，用測序方法作進一步鑒定，測序結(jié)果表明目的基因的序列及在載體中的位置均正確，得到了整合素αVβ3抗原基因的原核表達載體，命名為pGEX-αVβ3。
二、工程菌的獲得及包涵體的大量制備將pGEX-αVβ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用與步驟一相同的方法篩選出陽性重組菌株，然后按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨芐青霉素的1000mL LB液體培養(yǎng)基中在37℃下進行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加入化學誘導劑IPTG至終濃度為1mmol/L，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，4℃、6000rpm離心15min收集菌體，用100mL TE緩沖液(20mmol/L，pH8.0)重懸菌體沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室溫磁力攪拌10min；冰浴中超聲波(30s/開，20s/停，15個循環(huán))破碎菌體；4℃、12000rpm離心20min分別收集包涵體沉淀和上清。將包涵體沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗滌1次，4℃、12000rpm離心20min以去除包涵體中的雜蛋白，棄上清后再用TE緩沖液洗滌2次，4℃、12000rpm離心20min收集沉淀，用下述步驟進行純化。
三、目的蛋白的純化用8mol/L的脲溶解包涵體，20℃、12000rpm離心10min后添加巰基乙醇至1％(體積百分濃度)；將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(購自Pharmacia公司)用6mol/L脲的TE緩沖液平衡后上樣；用6moI/L脲的TE緩沖液洗脫出穿過峰后，用不同濃度(濃度為0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.5M和1M)的NaCl(6mol/L脲的TE緩沖液配制)洗脫，收集相關洗脫峰；每個峰取樣進行SDS-PAGE鑒定，根據(jù)電泳結(jié)果，將43KD的目的蛋白組分再進行S-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱和SephardexG-50柱(購自Pharmacia公司)進行純化，最后對經(jīng)純化的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖9所示，表明獲得了43KD經(jīng)純化的目的蛋白，即整合素αVβ3抗原。
實施例4、整合素αVβ3抗原的抑瘤活性檢測一、動物的分組與免疫6周齡Balb/c小鼠分為5組，每組9只。A組為空白對照組；B組為PBS對照組；C組為pCI-neo+空載體組；E-1組為pCI-m αVβ3組，E-2組為pCI-αVβ3組。
將三種質(zhì)粒DNA(pCI-neo、pCI-mαVβ3(實施例2構(gòu)建)、pCI-αVβ3(實施例2構(gòu)建))分別與轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE按1∶1(m∶v)的比例混合，輕輕振蕩后室溫放置15分鐘，得到LipofectAMINE-質(zhì)粒DNA復合物，作為免疫用DNA。免疫采用股四頭肌肌肉多點注射，100μg/只首先注射100μl 0.25％布比卡因預處理接種部位，72h后在相同部位初次免疫，分別于第3周和第6周各加強免疫1次。
二、血清抗體效價的ELISA檢測每組小鼠于每次免疫后2周經(jīng)尾靜脈取血，室溫放置3h后3000rpm離心10min，取上層血清用ELISA法檢測抗體滴度，以驗證抗原的體液免疫反應，同時設立免疫前鼠血清的陰性對照和PBS空白對照，ELISA檢測方法如下將實施例3制備的蛋白用包被液稀釋至終濃度為5μg/mL，包被ELISA板，4℃靜置12-24小時；PBST洗滌甩棄ELISA板孔中的包被液，PBST洗滌1次；用2％酪蛋白液室溫封閉4h，棄去封閉液，拍干ELISA板；將免疫鼠血清用PBS倍比稀釋后加入各孔，100ul/孔，37℃靜置30min；用PBST洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(購自北京中杉金橋技術有限公司)，37℃反應20min；PBST洗滌后，用TMB顯色10min，2M硫酸終止反應；最后用SPECTRAIII酶聯(lián)儀檢測450nm的OD值。結(jié)果判定待測樣品的OD值與陰性對照的OD值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)為陽性，顯示陽性結(jié)果的最大抗體稀釋度為免疫小鼠血清的抗體效價。免疫小鼠血清中的抗體效價檢測結(jié)果如表1所示，表1免疫小鼠血清中的抗體效價

注※與PBS、pCI-neo+和小鼠來源的同物種抗原對照組相比，該組小鼠均產(chǎn)生特異性抗體(P＜0.05)※※兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價(P＜0.05)與PBS和空載體對照組相比，抗原組(E-1組、E-2組)小鼠血清中均產(chǎn)生了較高水平的抗體，兩次加強免疫可明顯增強免疫小鼠血清的抗體效價，此外，本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
三、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測
1、免疫小鼠脾淋巴細胞的分離每組免疫小鼠各取三只，無菌分離脾淋巴細胞，方法為斷頸處死小鼠，75％乙醇中滅菌5min，隨即放入超凈臺內(nèi)成右側(cè)臥位；無菌取出脾臟，放于平皿(內(nèi)裝預冷的8mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液)中，盡量剔除脂肪和結(jié)締組織，于200目不銹鋼網(wǎng)上用研磨棒輕輕擠壓脾組織；將脾細胞懸液8mL緩慢沿管壁緩慢加入裝有4mL Ficoll淋巴細胞分離液(購自Pharmacia公司)的透明離心管中，2000rpm水平離心20min；小心吸取白膜層，用10mL預冷的培養(yǎng)基洗2次(1000rpm、10min)，將細胞重懸于含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL。
2、免疫小鼠的IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測對步驟1分離的免疫小鼠的脾淋巴細胞用Murine IFNγ和IL-4ELISPOT試劑盒并參照試劑盒說明書進行IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測，檢測結(jié)果見表2和圖10所示，表2免疫小鼠IFN-γ和IL-4的ELISPOT檢測

注※與B、C對照組比較，ELISPOT檢測該組小鼠斑點數(shù)增多P＜0.05，※※P＜0.01與PBS和空載體對照組相比，抗原組(E-1組、E-2組)小鼠脾細胞中分泌IFN-γ和IL-4的T淋巴細胞數(shù)量與對照組比均明顯增加，且本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
四、免疫小鼠脾淋巴細胞的T細胞亞群測定取小鼠脾細胞1×106/mL-2×106/mL，PBS洗兩次；分別加入PE標記的抗CD4+mAb和FITC標記的抗CD8+mAb(購自北京晶美生物有限公司)各20ul，混勻后4℃避光反應30min；PBS洗兩次后，加入0.5mL熒光保存液(0.15mol/L PBS，20g/L葡萄糖，10g/L甲醛及1g/L NaN3)重懸細胞，用流式細胞儀分析T細胞亞群，免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數(shù)比例的流式細胞儀測定結(jié)果如表3和圖11、圖12所示。
表3流式細胞儀測定的免疫小鼠CD4+和CD8+T細胞數(shù)的比例


注※與B、C對照組比較，該組小鼠CD4+/CD8+的比值顯著增高P＜0.05，※※P＜0.01與PBS和空載體對照組相比，抗原組(E-1組、E-2組)小鼠脾細胞中CD4+/CD8+的比值明顯升高，且本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原更能激發(fā)小鼠的體液免疫反應。
五、檢測免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的保護作用末次免疫后一周對各組余下6只免疫小鼠進行皮下移植瘤攻擊。收獲對數(shù)生長期的RenCa細胞，制備單細胞懸液，用生理鹽水洗兩次，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，于小鼠背部右側(cè)皮下接種100μl細胞懸液即1×106/只。皮下移植瘤攻擊后，觀察小鼠移植瘤的生長情況。待腫瘤結(jié)節(jié)形成后(可捫及，長徑約2-3mm)，記錄每組小鼠的成瘤時間，同時觀察小鼠的存活狀況。于腫瘤細胞攻擊后50天處死小鼠，拍照；用游標卡尺測量腫瘤的垂直長徑(a)和垂直短徑(b)，依照公式計算移植瘤體積；稱取瘤重，依照公式計算腫瘤的抑制率。
各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間見表4和圖13，皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況、在體瘤體積和體外瘤體積見圖17(從左到右依次是小鼠存活情況、在體顯示腫瘤體積、離體顯示腫瘤體積)，其中存活率統(tǒng)計結(jié)果見表5，瘤體積測量結(jié)果見表6和圖14，瘤重測量結(jié)果見圖15，各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果見表7，其中以B組為對照組的各組免疫小鼠的抑腫瘤率統(tǒng)計結(jié)果的柱狀圖見圖16，表4各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時間

注※與B、C對照組比較該組小鼠成瘤潛伏期延長(P＜0.05)表5皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的存活情況


注※與B、C對照組比較該組小鼠存活率明顯增加(P＜0.05)表6皮下移植瘤攻擊后50天各組免疫小鼠的瘤體積

注※與B、C對照組比較該組小鼠腫瘤體積明顯縮小(P＜0.001)表7各組免疫小鼠對腫瘤的抑制作用

注※與對照組相比，該組小鼠對腫瘤的抑制作用非常顯著(P＜0.01)；※※P＜0.001免疫小鼠接受皮下移植瘤攻擊后，與PBS和空載體對照組相比，抗原組(E-1組、E-2組)小鼠的成瘤時間延長、腫瘤生長緩慢且瘤體積縮小、抑瘤率明顯提高，且本發(fā)明的整合素αVβ3抗原較小鼠的相應抗原的抑瘤效果更加顯著。
序列表<160>2<210>1<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Val Phe Asn Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile1 5 10 15Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Ile Lys20 25 30Ile Gln Thr Leu Gly Thr Ser Leu Ser Glu Arg Met Arg Arg Leu Thr35 40 45Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Met Ser50 55 60Pro Tyr Met Phe Met Ser Pro Pro Glu Val Ile Lys Asn Pro Cys Tyr65 70 75 80Glu Phe Asn Thr Glu Cys Met Pro Thr Phe Gly Tyr Lys His Val Leu85 90 95Thr Leu Thr Glu Glu Val Leu Arg Phe Asn Glu Glu Val Gln Lys Gln100 105 110Lys Val Ser Arg Asn Arg Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Val115 120 125Leu Gln Ala Ala Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn130 135 140
<210>2<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtcttcaacc tacaggtgag gcaagtagaa gactatcctg tggatatcta ctaccttatg 60gacctttcct attccatgaa ggatgattta atcaagatcc aaaccctggg cactagttta 120tcagaaagga tgcgccggct aactagtaac ctgcggattg gatttggtgc atttgttgac 180aagcctatgt caccgtacat gtttatgtca cctcctgaag tcatcaaaaa cccctgctat 240gaatttaaca ccgagtgcat gcccactttt ggatataaac acgtcttgac tttgacagag 300gaagtcttga gatttaacga ggaggtccag aaacagaagg tctcccgaaa ccgggattct 360ccagagggtg gatttgatgc ggtgctacag gcagcagtat gcgacgagaa gattggctgg 420agaaat 42權(quán)利要求
1.整合素αVβ3抗原，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述整合素αVβ3抗原的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
5.一種表達整合素αVβ3抗原的方法，是將含有權(quán)利要求2或3所述整合素αVβ3抗原基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到整合素αVβ3抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述重組表達載體的出發(fā)載體為pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c；以pGEX-4T-2為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述整合素αVβ3抗原基因的重組表達載體為pGEX-αVβ3；所述宿主為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。
7.與權(quán)利要求1所述整合素αVβ3抗原特異結(jié)合的抗體。
8.權(quán)利要求1所述的整合素αVβ3抗原在制備預防和/或治療性腫瘤疫苗及藥物中的應用。
9.權(quán)利要求2或3所述的整合素αVβ3抗原基因在制備預防和/或治療性腫瘤DNA疫苗及藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述DNA疫苗中的整合素αVβ3抗原基因存在于真核表達載體中；所述攜帶有整合素αVβ3抗原基因的真核表達載體為pCI-αVβ3。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗腫瘤整合素αVβ
文檔編號A61K39/395GK1903875SQ200610089098
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者于繼云, 閻瑾琦, 陳興, 劉穎, 賈銳, 劉國棟, 王浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所