本發(fā)明涉及一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1和udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugpase的基因工程菌及其在制備萊鮑迪甙a中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甜菊糖是一種從甜味菊莖葉中提取的天然甜味劑，其主要成分為甜菊糖甙，它是一種高甜度、低熱值的非發(fā)酵性的天然甜味劑。甜度約為蔗糖的200～300倍，其中提純的萊鮑迪甙a糖的甜度約為蔗糖的450倍，味感更佳。甜菊糖的熱值僅為蔗糖的1/300[1],與蔗糖、葡萄糖等天然甜味劑，甜密素、阿斯巴甜等化學(xué)合成甜味劑相比，甜菊糖具有熱量低、甜度高、味質(zhì)好、耐高溫、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，攝入人體后不被吸收,不產(chǎn)生熱量[2],是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。對(duì)人體安全無(wú)毒，而且還兼有促進(jìn)代謝、治療胃酸的作用，對(duì)肥胖癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化等有輔助療效[3,4,5]。由于甜菊糖苷屬非發(fā)酵性物質(zhì)，具有耐熱、穩(wěn)定、防腐等性能，所以加到食品飲料中不易變性、變質(zhì)。此外，它對(duì)酸堿度的要求不高，保存時(shí)間長(zhǎng)，不易結(jié)塊、褐變。因此，可以被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。甜菊糖是目前世界已發(fā)現(xiàn)并經(jīng)我國(guó)衛(wèi)生部、輕工業(yè)部批準(zhǔn)使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑[6]。是繼甘蔗甜菜糖之外第三種有開(kāi)發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國(guó)際譽(yù)為“世界第三蔗糖”。

甜菊葉中三種最主要的糖苷成分在葉片中的含量通常為：甜菊苷（stevioside，st甙）占葉片干重9.1%，萊鮑迪甙a（rebaudiosidea,ra甙)占3.8%，萊鮑迪苷c占0.6%[7]。近年來(lái)，包括以上三種糖苷組分在內(nèi)，研發(fā)人員已從甜葉菊中分離得到11種糖苷。其中ra甙與其它糖苷相比，其甜度高，且甜味純正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草異味低，穩(wěn)定性好，是一種理想的天然高倍甜味劑產(chǎn)品。因此，提高甜菊糖甙的含量，尤其是提高ra甙的純度，獲得高品質(zhì)的甜菊糖，成為甜菊糖產(chǎn)業(yè)升級(jí)和產(chǎn)品改進(jìn)的重要目標(biāo)和內(nèi)容。

采用分離提純工藝來(lái)分離ra甙與st甙生產(chǎn)ra甙，其中hplc法分離ra甙和st甙的效果最好，但其處理量太小，難以放大化后用于工業(yè)化生產(chǎn)；重結(jié)晶法工藝繁復(fù)，能量消耗大，時(shí)間周期長(zhǎng)，且存在有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題；樹(shù)脂吸附雖然吸附和交換容量大，容易規(guī)?；a(chǎn)，但萊鮑迪甙a(ra甙)與含量高的甜菊甙(st甙)在化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性上非常相近，造成對(duì)ra甙的吸附選擇性比較小，影響分離效果，使得萊鮑迪甙a得率低，在工業(yè)實(shí)際應(yīng)用中存在一定的困難。目前生物酶法合成ra甙的方法需要外加昂貴的udp-葡萄糖為底物，通過(guò)udp-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，催化st甙生成ra甙，致使酶催化st甙合成ra甙的經(jīng)濟(jì)性較差、缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一株能夠高效共表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1和udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugpase的基因工程菌。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方法。

本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述工程菌的應(yīng)用。

一種產(chǎn)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1和udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugpase的基因工程菌，它是將ugt76g1和ugpase編碼基因插入到含有兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子pgk1和tef1的組成型釀酒酵母穿梭質(zhì)粒pesc-leud中，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主釀酒酵母saccharomycescerevisiaeyph499(pesc-leud)中得到的工程菌yph499-pescd-ugt-ugpase。

ugt76g1編碼基因插入載體的酶切位點(diǎn)為salⅰ和xho??；ugpase編碼基因插入載體的酶切位點(diǎn)為spei和saci。

所述的ugt76g1編碼基因?yàn)間enbank,no.genbank:ay345974.1，該基因序列命名為ugt，序列見(jiàn)seq.no.2所示。所述的ugpase編碼基因?yàn)間enbank，geneid:853830，該基因序列命名為ugpase，序列見(jiàn)seq.no.1所示。

該基因工程菌在組成型表達(dá)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶ugt的重組菌基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugpase，增加糖基化反應(yīng)的糖基供體量。

上述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1）用限制性內(nèi)切酶salⅰ和xhoⅰ雙酶切ugt基因片段和pescd載體，連接ugt基因片段純化產(chǎn)物與pescd載體，得到重組質(zhì)粒pescd-ugt；

2）用限制性內(nèi)切酶speⅰ和sacⅰ雙酶切ugpase基因片段和pescd-ugt載體，連接ugpase基因片段純化產(chǎn)物與pescd-ugt載體，得到重組質(zhì)粒pescd-ugt-ugpase；

3）將鑒定后的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母saccharomycescerevisiaeyph499中，得到基因工程菌yph499-pescd-ugt-ugpase。

上述基因工程菌的產(chǎn)酶方法，具體來(lái)說(shuō)，是將基因工程菌yph499-pescd-ugt-ugpase按1~5%的接種量接種到碳源為20g/l葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)上，培養(yǎng)16~32h；培養(yǎng)基配方為：6.7g/lynb，20g/l葡萄糖，0.1g/l腺嘌呤，0.1g/l半胱氨酸，0.1g/l精氨酸，0.1g/l尿嘧啶，0.1g/l蘇氨酸，0.1g/l賴氨酸，0.1g/l色氨酸，0.05g/l組氨酸，0.05g/l天冬氨酸，0.05g/l甲硫氨酸，0.05g/l異亮氨酸，0.05g/l苯丙氨酸，0.05g/l絲氨酸，0.05g/l脯氨酸，0.05g/l酪氨酸，0.05g/l纈氨酸。

上述基因工程菌在生產(chǎn)萊鮑迪甙a中的應(yīng)用。建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系，將甜菊甙轉(zhuǎn)化為萊鮑迪甙a。以共表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1和葡萄糖焦磷酸化酶的基因工程菌為全細(xì)胞催化劑，菌用量濃度為1~10g/l；葡萄糖用量20~120g/l；底物甜菊糖甙的用量為1~20g/l，底物甜菊糖甙的純度為55~95%；其它參與反應(yīng)的物質(zhì)分別為：改善細(xì)胞通透性的有機(jī)溶劑，調(diào)節(jié)代謝途徑的物質(zhì)，反應(yīng)得到萊鮑迪甙a。

優(yōu)選為：菌用量濃度2g/l；葡萄糖的用量40g/l；底物甜菊糖甙1~20g/l。

所述通透劑為表面活性劑或者螯合劑。所述表面活性劑為sds、f-68或者tritonx-100；所述螯合劑為edta。所述通透劑的濃度分別為：sds：濃度0.2~2%；f-68：濃度0.5~2%；tritonx~100：濃度0.5~2%；螯合劑：edta,濃度0.2~2%。

所述的調(diào)節(jié)代謝途徑的物質(zhì)為檸檬酸鈉，用量為0.5~10g/l，優(yōu)選2g/l；

所述的反應(yīng)在磷酸鉀緩沖液體系中完成，反應(yīng)ph6.8~8.0，濃度50-100mm，優(yōu)選ph8.0、濃度100mm，鎂離子濃度1~10g/l，反應(yīng)溫度25~42℃，優(yōu)選30℃，反應(yīng)時(shí)間8~96h，優(yōu)選24h。

添加一定量的檸檬酸鈉，ra甙產(chǎn)量最高達(dá)到1650.3mg/l；說(shuō)明添加適量濃度的檸檬酸鈉，對(duì)調(diào)節(jié)酵母代謝途徑從而促進(jìn)udpg生成起到較大作用，這種有效的轉(zhuǎn)化結(jié)果可能是由于檸檬酸鈉是糖酵解途徑中6-磷酸果糖激酶的有效抑制劑，即在一定程度上抑制了糖酵解途徑，促使6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成1-磷酸葡萄糖，進(jìn)而提高了udpg的合成量。

所述的催化反應(yīng)，反應(yīng)8-24h結(jié)束，優(yōu)選ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖洗菌兩遍，加入上述營(yíng)養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基10-100ml，30℃、200rpm搖床活化菌2-3h。用所述緩沖清洗活化的菌兩次，檢驗(yàn)催化劑的重復(fù)利用率。結(jié)果顯示細(xì)胞重復(fù)利用五次，轉(zhuǎn)化效率仍在30%以上。

有益效果：本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，獲得可以將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1和udp-葡萄糖焦磷酸化ugpase共表達(dá)的重組菌，利用胞內(nèi)udpg的合成途徑，提高胞內(nèi)udpg糖基共體量，避免其額外添加、實(shí)現(xiàn)再生循環(huán)，實(shí)現(xiàn)萊鮑迪甙a合成量的增加。

本發(fā)明使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子替換了常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，酵母的培養(yǎng)和重組酶的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行，且無(wú)需使用半乳糖來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)目的基因，這一工作縮短了重組菌培養(yǎng)及重組酶表達(dá)的周期，組成型強(qiáng)啟動(dòng)子增加酶的表達(dá)量及其活性，無(wú)需誘導(dǎo)劑，有利于降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明采用全細(xì)胞催化，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)酶系的穩(wěn)定及其細(xì)胞的重復(fù)利用，重復(fù)利用五次，萊鮑迪甙a相對(duì)產(chǎn)量可達(dá)30%以上。尤其是采用sds作為透性化試劑，應(yīng)用于全細(xì)胞催化反應(yīng)，無(wú)毒性，降低細(xì)胞損害，改善細(xì)胞穩(wěn)定性，sds通透效果較其它表面活性劑能力強(qiáng),萊鮑迪甙a產(chǎn)量可達(dá)1238.2mg/l。

本發(fā)明提供的共表達(dá)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1、葡萄糖焦磷酸化酶ugp的重組釀酒酵母，催化能力強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)不同品質(zhì)甜菊糖（純度55~95%）的轉(zhuǎn)化，提高萊鮑迪甙a的含量，混合糖甙中萊鮑迪甙a含量可達(dá)60%以上。

本發(fā)明簡(jiǎn)化了全細(xì)胞催化合成萊鮑迪甙a時(shí)對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行通透化處理的繁瑣程序，向反應(yīng)體系中直接加入通透試劑，分離反應(yīng)液得到產(chǎn)物。采用該重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，以混合糖甙為底物，反應(yīng)后萊鮑迪甙a含量從10%提高到63%以上。

附圖說(shuō)明

圖1ugt76g1催化stevioside(st甙)生成rebaudiosidea(ra甙)的過(guò)程；

圖2pescd-ugt-ugpase質(zhì)粒示意圖；

圖3細(xì)胞內(nèi)udpg合成途徑；

圖4全細(xì)胞催化合成萊鮑迪甙a的產(chǎn)量；

圖5檸檬酸鈉對(duì)催化反應(yīng)的影響；

圖6透性化試劑處理的細(xì)胞對(duì)合成萊鮑迪甙a的影響；

圖7通透劑對(duì)細(xì)胞完整性的影響；

圖8細(xì)胞重復(fù)利用率。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：重組酵母的構(gòu)建

1、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt基因的獲取:

根據(jù)ay345974.1基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列命名為ugt，并由南京金思瑞公司完成基因合成，序列見(jiàn)seq.no.2。

根據(jù)ugt基因序列設(shè)計(jì)引物

上游引物（-sense含sal?。閜1：

5’-cactatagggcccgggcgtcgacatgtctgaaaataagactgaaact-3’

下游引物（-sense含xho?。閜2：

5’-tcttagctagccgcggtaccaagcttactcgagttataatgatgaaat-3’

所有引物由上海申能博彩公司合成。

基因的pcr條件(50ul體系):

pcr體系：50μl

ddh2o：19μl

p1：2μl

p2：2μl

模板：2μl

2×phantamastermix：25μl

94℃變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min。最后72℃延伸l0min。

2、udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugpase基因的獲取

ugpase基因來(lái)源于釀酒酵母saccharomycescerevisiaeyph499，序列見(jiàn)seq.no.1所示。

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi和cloneezpcrcloningkit設(shè)計(jì)引物：

上游引物（-sense含spe?。閜3：

5’-attacaagcggccgcactagtatgtccactaagaagcacaccaaaacac

at-3’

下游引物（-sense含sac?。閜4：

3’-agaattgttaattaagagctcatgtccactaagaagcacaccaaaacac

at-3’

pcr條件(50ul體系):

pcr體系：50μl

ddh2o：19μl

p3：2μl

p4：2μl

模板：2μl

2×phantamastermix：25μl

94℃變性5min。按如下參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min。最后72℃延伸l0min。

3、重組工程菌yph499(pescd-ugt-ugpase)獲得:

用上述pcr擴(kuò)增ugt、ugp基因，雙酶切后并用核酸膠純化回收。純化后的片段分別與pmd18-tvector載體（takara）連接，連接條件：t4連接酶16℃、反應(yīng)8h。將10u1的連接物產(chǎn)物pmd18-t-ugt、pmd18-t-ugpase熱擊轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化物涂布于含有含100ug/mlap的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆。獲得正確序列的克隆載體pmd18-t-ugt和pmd18-t-ugpase。

分別用salⅰ和xhoⅰ雙酶切克隆載體pmd18-t-ugt和pescd。膠回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出表達(dá)載體pescd-ugt。挑出鑒定后正確的陽(yáng)性克隆載體pescd-ugt。

分別用speⅰ和sacⅰ雙酶切克隆載體pmd18-t-ugpase和pescd-ugt。膠回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出表達(dá)載體：質(zhì)粒pescd-ugt-ugpase與saccharomycescerevisiaeyph499感受態(tài)混勻，電擊法轉(zhuǎn)化完畢后，加入1ml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，將菌體懸液涂布于sc-l篩選培養(yǎng)基平板上至于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。

實(shí)施例2：重組釀酒酵母菌共表達(dá)ugt和ugpase

菌種活化：在無(wú)菌環(huán)境中，將甘油管保存菌種涂布于ypda平板上，30℃生長(zhǎng)24-36小時(shí)。挑取ypda平板上的單菌落三區(qū)劃線涂布于sc篩選性培養(yǎng)基，30℃生長(zhǎng)24-36小時(shí)。

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)：挑取sc篩選性平板上單菌落轉(zhuǎn)接到液體sc培養(yǎng)基中，30℃生長(zhǎng)16-20小時(shí)，6000rpm，離心5min，并用磷酸鉀緩沖洗菌體兩遍。

其中，營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基ypda配方為：10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，0.75g/l腺嘌呤。篩選型培養(yǎng)基sc配方為：6.7g/lynb，20g/l葡萄糖，0.1g/l腺嘌呤，0.1g/l半胱氨酸，0.1g/l精氨酸，0.1g/l尿嘧啶，0.1g/l蘇氨酸，0.1g/l賴氨酸，0.1g/l色氨酸，0.05g/l組氨酸，0.05g/l天冬氨酸，0.05g/l甲硫氨酸，0.05g/l異亮氨酸，0.05g/l苯丙氨酸，0.05g/l絲氨酸，0.05g/l脯氨酸，0.05g/l酪氨酸，0.05g/l纈氨酸。

實(shí)施例3:酶活測(cè)定方法的確立

將離心收集的重組釀酒酵母細(xì)胞，用0.1mm磷酸鉀緩沖液(ph8.0)洗滌兩次，高壓破碎細(xì)胞。然后4°c，6000r/min離心30min收集酶粗提液備用。

測(cè)定ugt酶活力反應(yīng)體系：

在3ml的反應(yīng)體系中(1.2mmst甙、4mmudpg、3mmmgcl2、0.89mg粗酶、ph=8.0)，加入酶粗提液進(jìn)行反應(yīng)，30°c室溫3h后，加入水飽和正丁醇漩渦震蕩終止反應(yīng)。用正丁醇萃取得到的上清液用高效液相色譜(hplc)進(jìn)行分析。對(duì)照菌作相同處理。

測(cè)定ugp酶活力反應(yīng)體系：

利用ugp可逆反應(yīng)，其催化反應(yīng)生成1-磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將nadp轉(zhuǎn)化為nadph，在340nm的吸光值增加速率反映了ugp活性。

ugt酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，30°c，1min催化形成1μmol萊鮑迪甙a所需要的酶量為1個(gè)活力單位(u)。

ugp酶活力單位定義為：每毫克細(xì)胞蛋白每分鐘消耗1nmol的nadp為一個(gè)酶活力單位。

hplc法色譜分析條件如下:

色譜柱：lichrosphernh2柱(250mmx4.6mm,5um)；流動(dòng)相為乙睛：水20；v:v)；流速：1ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。

采用上述方法測(cè)定實(shí)施例2中重組釀酒酵母菌的酶活，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1酵母菌株表達(dá)酶的活力

實(shí)施例4:建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系

取實(shí)施例2中的沉淀轉(zhuǎn)移至用50m1小三角瓶中，建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系。此反應(yīng)體系為20ml，其中菌體2.0g/l，底物st甙2g/l；葡萄糖40g/l；mgcl26g/l；sds2g/l；用磷酸鉀緩沖液定容至20ml，ph調(diào)節(jié)為8.0，200rpm,30℃，反應(yīng)48h后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20℃?zhèn)溆谝合喾治觥Ｍㄟ^(guò)加入葡萄糖，過(guò)表達(dá)ugp增加碳流量向合成糖基供體udpg方向進(jìn)行，從而增加萊鮑迪甙a的產(chǎn)量，其產(chǎn)量達(dá)到1238.2mg/l。催化反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞催化劑進(jìn)行表面活性劑處理，增加了細(xì)胞通透性，提高了細(xì)胞的穩(wěn)定性，產(chǎn)量增加顯著。

實(shí)施例5：代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)檸檬酸鈉的影響

基因工程菌濃度2.0g/l，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50m1小三角瓶中，加入終濃度為40g/l的葡萄糖，底物st甙2g/l,mgcl26g/l，sds2g/l，并加入檸檬酸；用磷酸鉀緩沖液定容至l0ml,ph調(diào)至8.0。取五份平行樣，加入的檸檬酸鈉濃度分別為0g/l,1g/l,2g/l,5g/l,10g/l,30°c,200rpm，反應(yīng)48h后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20℃?zhèn)溆谝合喾治觥幟仕徕c濃度0～2g/l時(shí)，ra甙的生成量逐漸增加；在2g/l時(shí)，ra甙產(chǎn)量達(dá)到最高；當(dāng)濃度在2～5g/l時(shí)，ra甙量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。檸檬酸鈉濃度為2g/l時(shí)，ra甙的產(chǎn)量最高為1650.3mg/l。

實(shí)施例6：底物濃度的影響

濕菌體濃度2.0g/l，按照實(shí)例4的方法，轉(zhuǎn)移至用50m1小三角瓶中，加入終濃度為40g/l的葡萄糖，mgcl26g/l，sds2g/l，用磷酸鉀緩沖液定容至20ml,ph調(diào)至8.0。按上述方法，取四份平行樣，加入的底物st甙濃度分別為1g/l、2g/l、4g/l、10g/l、12g/l，30°c,200rpm，反應(yīng)48h后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20℃?zhèn)溆谝合喾治觥＞w催化底物所得ra甙的產(chǎn)率隨著st甙濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在st甙濃度為2g/l的時(shí)ra甙產(chǎn)率達(dá)到最高，為89.2%。st甙為4g/l時(shí)，ra甙的產(chǎn)量最高為2783.5mg/l。

實(shí)施例7：sds濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為40g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl2，用量2g/l，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)，用ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖定容至20ml。反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。取四份平行樣，加入sds的濃度分別為1g/l、2g/l、5g/l、1g/l，反應(yīng)24小時(shí)，取反應(yīng)液離心取上清，放于4℃?zhèn)湟合鄼z測(cè)分析。其中，當(dāng)sds濃度為2g/l，萊鮑迪甙a最大產(chǎn)量為1347.4mg/l；當(dāng)sds濃度為5g/l，萊鮑迪甙a產(chǎn)量為1106.1mg/l；當(dāng)sds濃度為1g/l，萊鮑迪甙a最低產(chǎn)量為976.4mg/l。

實(shí)施例8：f-68濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為80g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl2，用量2g/l，用ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖定容至20ml，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。取三份平行樣，加入f-68的濃度分別為5g/l、10g/l、15g/l，反應(yīng)24小時(shí)，取反應(yīng)液離心取上清，放于4℃?zhèn)湟合鄼z測(cè)分析。其中，當(dāng)f-68濃度為15g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最低產(chǎn)量為464.7mg/l；當(dāng)f-68濃度為10g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最高產(chǎn)量為695.8mg/l。

實(shí)施例9：tritonx-100濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為80g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl2，用量2g/l，用ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖定容至20ml，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。取四份平行樣，加入tritonx-100的濃度分別為5g/l、10g/l、15g/l，反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)液離心取上清，放于4℃?zhèn)湟合鄼z測(cè)分析。其中，當(dāng)tritonx-100濃度為15g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最低產(chǎn)量為534.2mg/l；當(dāng)tritonx-100濃度為10g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最高產(chǎn)量為806.7mg/l。

實(shí)施例10：edta濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

基因工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為40g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl2，用量2g/l，用ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖定容至20ml，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。取四份平行樣，加入edta的濃度分別為2g/l、5g/l、10g/l，15g/l反應(yīng)24小時(shí)，取反應(yīng)液離心取上清，放于4℃?zhèn)湟合鄼z測(cè)分析。其中，當(dāng)edta濃度為2g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最低產(chǎn)量為97.9mg/l；當(dāng)edta濃度為5g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最低產(chǎn)量為410.6mg/l；當(dāng)edta濃度為10g/l時(shí)，萊鮑迪甙a最高產(chǎn)量為575.3mg/l。

實(shí)施例11：催化細(xì)胞的重復(fù)利用率

第一次反應(yīng)體系：基因工程菌的用量按濕菌體計(jì)為2.0g/l，葡萄糖的用量為40g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl22g/l，通透劑sds2g/l，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。取反應(yīng)液離心取上清，放于4℃?zhèn)湟合鄼z測(cè)分析。第二次反應(yīng)體系：第一次反應(yīng)結(jié)束后，用ph8.0、100mm的磷酸鉀緩沖清洗菌體，并用sc選擇性培養(yǎng)基10ml，30℃、200rpm搖床活化2小時(shí)。使用第一次反應(yīng)條件。如此條件，重復(fù)反應(yīng)五次。結(jié)果見(jiàn)圖8所示，細(xì)胞重復(fù)利用3次產(chǎn)量可以達(dá)到60%，細(xì)胞重復(fù)利用五次萊鮑迪甙a相對(duì)產(chǎn)量都在30%以上。

實(shí)施例12：低純度甜菊糖甙的轉(zhuǎn)化

基因工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為40g/l，鎂離子使用mgcl2用量2g/l，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)，通透劑sds劑1%，甜菊糖的用量為10g/l，其中甜菊糖甙含量分別為80.24%、25.31%、60.64%，萊鮑迪甙a含量在40%。經(jīng)過(guò)反應(yīng)轉(zhuǎn)化混合糖甙中萊鮑迪甙a含量有大幅度提高，含量達(dá)到67%。

實(shí)施例13：透性化試劑對(duì)細(xì)胞穩(wěn)定性的影響

基因工程菌的用量按濕菌體濃度2.0g/l添加，葡萄糖的用量為40g/l，甜菊糖的用量為2g/l，鎂離子使用mgcl2，用量2g/l，反應(yīng)溫度30℃、200rpm搖床反應(yīng)24小時(shí)。建立四個(gè)反應(yīng)樣，通透劑分別為sds濃度為2g/l、f-68濃度為10g/l時(shí)、tritonx-100濃度為10g/l、edta濃度為10g/l。反應(yīng)12小時(shí)取反應(yīng)液離心取菌泥，用10mmtris–hcl(ph7)洗菌泥兩遍。測(cè)定細(xì)胞穩(wěn)定反應(yīng)體系：包含0.25ｕg溶菌酶(100t)，并用10mmtris–hcl(ph7)調(diào)節(jié)菌量od6000.2~0.4。酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600nm下，每10min測(cè)定一次吸光值，測(cè)定60min。經(jīng)過(guò)sds處理的細(xì)胞，前30min吸光值變化幅度小，說(shuō)明細(xì)胞壁通透性強(qiáng)；而經(jīng)過(guò)f-68處理的細(xì)胞，前30min吸光值變化幅度小，說(shuō)明細(xì)胞壁通透性小。

sequencelisting

<110>南京工業(yè)大學(xué)；興化格林生物制品有限公司

<120>一種基因工程菌及其在制備萊鮑迪甙a中的應(yīng)用

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