本發(fā)明屬于疫苗研究生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株的構(gòu)建技術(shù)。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，PCV2廣泛分布于世界各地。而豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）是1974年由德國(guó)學(xué)者Tischer從PK15傳代細(xì)胞系中作為一種細(xì)胞污染物而首次發(fā)現(xiàn)的[TischerI,RaschR,TochtermannG,etal.Characterizationofpapovavirusandpicornavirus-likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines[J].ZentralblBakteriolOrigA,1974,226(2):153-167.]，盡管在全球各地流行，但迄今為止并未發(fā)現(xiàn)其具有致病能力。而PCV2是隨后從病豬體內(nèi)分離得到的，其與PCV1非常類似，但在抗原性和基因組序列上有很大差異，因而被命名為豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）。所以，根據(jù)PCV的致病性與基因組核酸序列的不同將PCV分為PCV1與PCV2兩種基因型。因PCV2能夠造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、繁殖障礙、豬呼吸道病復(fù)合征及皮炎和腎病綜合征等多種疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害，因此成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。當(dāng)然，目前研究最多的是PCV2。基于對(duì)PCV2核酸序列的比較，又將其分為PCV2a-PCV2e等5個(gè)基因亞群，我國(guó)目前主要流行的是PCV2b和PCV2d亞群。在20世紀(jì)90年代到2000年流行的基因群主要是PCV2a，2001-2010年流行的主要基因群為PCV2b，2011年至今，主要流行PCV2b和PCV2d基因群[XiaoCT,Halbur,OpriessnigT,etal.Globalmoleculargeneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)sequencesconfirmsthepresenceoffourmainPCV2genotypesandrevealsarapidincreaseofPCV2d.[J].JGenVirol,2015,96:1830-1841.]。為控制豬圓環(huán)病毒病的流行，商品化的亞單位疫苗及全病毒滅活疫苗在世界多地的養(yǎng)豬場(chǎng)得到使用，并取得了一定的效果。PCV2是已知的脊椎動(dòng)物中最小的可自主復(fù)制的無(wú)囊膜病毒，具有1.7kb的單鏈閉合環(huán)狀負(fù)鏈DNA基因組，其中有三個(gè)研究透徹的開(kāi)放閱讀框[WaliaR,DardariR,ChaiyakulM,etal.Porcinecircovirus-2capsidproteininducescelldeathinPK15cells[J].Virology,2014,11:126-132.]。PCV2基因組排列十分緊密，基因組包含11個(gè)潛在ORFs，其閱讀框大小各異，編碼產(chǎn)物大小也相差懸殊。大多數(shù)閱讀框出現(xiàn)重疊，基因組長(zhǎng)度分為兩種，一種1767bp，另一種為1768bp[FenauxM,HalburPG,GillM,etal.Geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirus(PCV2)frompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofNorthAmericaanddevelopmentofadifferentialPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCV1andPCV2[J].JClinMicrobiol,2000,38(7):2494-2503.]。ORF1編碼參與病毒基因組復(fù)制的兩種蛋白質(zhì)，rep和剪接變異體rep'，而ORF2編碼主導(dǎo)免疫原性的cap衣殼蛋白。ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白具有促凋亡蛋白的特征。PCV2基因組有限的編碼容量意味著PCV必須為多功能產(chǎn)物編碼，以確保在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高效地復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。由于PCV2感染危害嚴(yán)重，而疫苗是預(yù)防該病的有效手段之一，疫苗自然成為全世界研究的熱點(diǎn)。Fenaux等（2004）用PCV2的ORF2基因替換非致病性PCV1相應(yīng)的ORF2基因成功構(gòu)建出了PCV1-2感染性克隆，其保留了PCV1的非致病性，同時(shí)還能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性抗體[FenauxM,OpriessnigT,HalburPG,etal.Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCV1inducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,78(12):6297-6303.]。值得強(qiáng)調(diào)的是，上述作者在構(gòu)建PCV1-2時(shí)，采用KpnⅠ不完全酶切方法實(shí)現(xiàn)PCV1-2雙拷貝的構(gòu)建，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室多年、多次驗(yàn)證，這一方法中的不完全酶切條件難以精準(zhǔn)控制，導(dǎo)致構(gòu)建成功率極低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是提出一種嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株。該嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株的保藏號(hào)為CGMCCNo.13592。該材料于2017年1月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），建議的分類命名為：嵌合型豬圓環(huán)病毒1-2b。本發(fā)明第二目的是提出以上嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株的構(gòu)建方法。本發(fā)明方法包括以下步驟：1）構(gòu)建缺失PCV1ORF2基因組的pSK（+）-PCV1ΔORF2：以PCV1全基因組為模板，用引物KpnI-F和引物KpnI-R擴(kuò)增出PCV1全基因組；將PCV1全基因組與pGEM-TEasy質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒T-PCV1，pBluescriptSK（+）載體的酶切及去磷酸化，再通過(guò)T-PCV1基因組的酶切、回收和去磷酸化，將PCV1與pSK（+）載體連接，獲得重組質(zhì)粒pSK（+）-PCV1；以質(zhì)粒pSK（+）-PCV1為模板，用引物HpaI-R和引物NarI-F擴(kuò)增出pSK（+）-PCV1ΔORF2基因；2）構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b：以PCV2b0233株基因組為模板，用引物PsiI-F和引物AclI-R擴(kuò)增出PCV2bORF2的DNA片段；再將pSK（+）-PCV1ΔORF2與PCV2bORF2連接得到重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b；3）構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK（+）-dPCV1-2b：對(duì)重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstBⅠ進(jìn)行雙酶切，得到1563bp的條帶片段；對(duì)重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstEⅡ進(jìn)行雙酶切，得到1543bp的條帶片段；對(duì)重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b用BstBⅠ和BstEⅡ進(jìn)行雙酶切，得到3428bp的條帶片段；將上述1563bp的條帶片段、1543bp的條帶片段和3428bp的條帶片段以1∶1∶3的摩爾比混合，并用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pSK（+）dPCV1-2b，即嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株。以上方法中采用的各引物為：引物KpnI-F：5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’；引物KpnI-R：5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3’；引物HpaI-R：5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’；引物NarI-F：5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’；引物PsiI-F：5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；引物AclI-R：5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’。本發(fā)明采用特殊方法構(gòu)建一種表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株），通過(guò)其核苷酸、氨基酸序列組成與生物學(xué)特性鑒定，這種活載體疫苗株可用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的主要內(nèi)容在于，通過(guò)對(duì)PCV1-2單拷貝質(zhì)粒（pSK（+）-sPCV1-2b）采用特定的限制性內(nèi)切酶分別進(jìn)行三組雙酶切，然后進(jìn)行常規(guī)的連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)PCV1-2雙拷貝（pSK（+）-dPCV1-2b）的構(gòu)建。發(fā)明的核心避免了國(guó)外研究者使用的KpnⅠ不完全酶切過(guò)程中反應(yīng)條件不可控的缺陷，從而，大大提高了PCV1-2雙拷貝構(gòu)建的成功率；同時(shí)，通過(guò)探索不同的轉(zhuǎn)染方法和篩選、使用特定的無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞系，使得轉(zhuǎn)染后PCV1-2滴度可達(dá)105TCID50/mL以上，高于國(guó)外報(bào)道的104.6TCID50/mL。最終獲得了完全適用于工廠化生產(chǎn)的表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）。附圖說(shuō)明圖1a為pSK（+）-sPCV1-2b（單拷貝）的構(gòu)建示意圖。圖1b為pSK（+）-dPCV1-2b（C1-233雙拷貝）的構(gòu)建示意圖。圖2為KpnⅠ和BstBⅠ雙酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒獲得1563bp左右目的片段的電泳圖。圖3為KpnⅠ和BstEⅡ雙酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒獲得1543bp左右目的片段的電泳圖。圖4為BstBⅠ和BstEⅡ雙酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒獲得3428bp左右目的片段的電泳圖。圖5為BstBⅠ單酶切pSK（+）-dPCV1-2b獲得1767bp與4767bp左右目的片段的電泳圖。圖6為PCV2bORF2特異性條帶的電泳圖。圖7為接種PCV2b0233株的PK-15細(xì)胞的IFA圖。圖8為接種表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的PK-15細(xì)胞的IFA圖。圖9為正常對(duì)照細(xì)胞IFA圖。圖10為試驗(yàn)豬血清熒光抗體消長(zhǎng)情況圖。圖11為試驗(yàn)豬血清中和抗體消長(zhǎng)情況圖。具體實(shí)施方式一、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的構(gòu)建：設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的引物序列如下：表1所需引物及內(nèi)切酶的識(shí)別序列引物名稱引物序列酶KpnI-F:5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’KpnIKpnI-R:5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3’KpnINarI-F:5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’NarIHpaI-R:5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’HpaIPsiI-F:5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’PsiIAclI-R:5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’AclI注：下劃線部分為各內(nèi)切酶的識(shí)別序列1、構(gòu)建缺失PCV1ORF2基因組的pSK（+）-PCV1ΔORF2：如圖1a所示，以PCV1全基因組為模板，用引物KpnI-F和引物KpnI-R擴(kuò)增出PCV1全基因組；將PCV1全基因組與pGEM-TEasy質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒T-PCV1，pBluescriptSK（+）載體的酶切及去磷酸化，再通過(guò)T-PCV1基因組的酶切、回收和去磷酸化，將PCV1與pSK（+）載體連接，獲得重組質(zhì)粒pSK（+）-PCV1；以質(zhì)粒pSK（+）-PCV1為模板，用引物HpaI-R和引物NarI-F擴(kuò)增出長(zhǎng)度為4065bp的pSK（+）-PCV1ΔORF2基因。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK（+）-sPCV1-2b：以PCV2b0233株基因組為模板，用引物PsiI-F和引物AclI-R擴(kuò)增出PCV2bORF2長(zhǎng)度約702bp的DNA片段；將回收純化的pSK（+）-PCV1ΔORF2與PCV2bORF2連接得到長(zhǎng)度為4767bp的pSK（+）-sPCV1-2b。3、構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK（+）-dPCV1-2b：如圖1b所示：（1）對(duì)pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstBⅠ進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到大小分別為204bp，1563bp，3000bp左右的三條條帶片段，如圖2所示。圖2中，M：DL5000DNAMarker；1：pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒；2：KpnⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒獲得3000bp與1767bp左右片段；3：BstBⅠ酶酶切1767bp片段獲得1563bp與204bp左右片段；4：膠回收孔2中1767bp左右目的片段。將孔3中1563bp左右的條帶片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。（2）對(duì)pSK（+）-sPCV1-2b用KpnⅠ和BstEⅡ進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到大小分別為224bp，1543bp，3000bp左右的三個(gè)條帶片段，如圖3所示：M：DL5000DNAMarker；1：pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒；2：KpnⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒獲得3000bp與1767bp左右片段；3：膠回收孔2中1767bp左右目的片段；4：BstBⅠ酶酶切1767bp獲得1543bp與224bp左右片段。將孔4中1543bp左右的條帶片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。（3）對(duì)pSK（+）-sPCV1-2b用BstBⅠ和BstEⅡ進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到大小分別為1339bp與3428bp左右的兩個(gè)條帶片段，如圖4所示：M：DL5000DNAMarker；1：pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒；2：BstBⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2b質(zhì)粒；3：BstEⅡ酶第二次酶切獲得3428bp與1339bp左右片段。將孔3中3428bp左右的條帶片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。（4）將上述分別回收的目的1563bp的條帶片段、1543bp的條帶片段和3428bp的條帶片段以1∶1∶3的摩爾比混合，用T4DNA連接酶于16℃環(huán)境中過(guò)夜進(jìn)行連接以獲得長(zhǎng)度為6534bp的重組質(zhì)粒pSK（+）dPCV1-2b。鑒定：將獲得的重組質(zhì)粒pSK（+）dPCV1-2b連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并用AIX平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)其中的白色單菌落用BstBⅠ或BstEⅡ進(jìn)行單酶切，采用電泳條帶圖鑒定，如圖5所示：M：DL5000DNAMarker；1：BstBⅠ單酶切pSK（+）-sPCV1-2b獲得4767bp左右目的片段；2：BstBⅠ單酶切pSK（+）-dPCV1-2b獲得1767bp與4767bp左右目的片段。由圖5可見(jiàn)：酶切鑒定重組質(zhì)粒（pSK（+）-dPCV1-2b）中有1767bp和4767bp左右大小的兩條條帶；而同樣的方法酶切單拷貝質(zhì)粒（pSK（+）-sPCV1-2b）只能獲得4767bp左右目的片段，說(shuō)明：采用以上方法獲得了長(zhǎng)度為6534bp的重組質(zhì)粒pSK（+）dPCV1-2b。該材料于2017年1月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），建議的分類命名為：嵌合型豬圓環(huán)病1-2b，保藏號(hào)為CGMCCNo.13592。二、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的生物學(xué)特性鑒定：材料：重組質(zhì)粒pSK（+）-dPCV1-2b（即PCV1-2b）、篩選獲得的無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞系。豬源PCV2陽(yáng)性血清（商品化血清或自制血清）。1、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PCR檢測(cè)：將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pSK（+）-dPCV1-2b電轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)狀態(tài)良好的無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞，經(jīng)過(guò)5次傳代后PCR方法檢測(cè)到PCV2ORF2特異性條帶，電泳圖如圖6所示，而正常的細(xì)胞則未出現(xiàn)條帶。圖6為：M：200bpDNAMarker；1：PCV2bORF2特異性目的片段。2、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)：在熒光顯微鏡下觀察到，經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的PK-15細(xì)胞中檢測(cè)到明顯的特異熒光（如圖7所示）；接種PCV2陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞同樣出現(xiàn)了特異熒光（如圖8所示），而正常對(duì)照細(xì)胞中則未出現(xiàn)熒光（如圖9所示），可見(jiàn)轉(zhuǎn)染表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗（C1-233株）的細(xì)胞能夠表達(dá)PCV2Cap蛋白。3、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗（C1-233株）的TCID50測(cè)定：將長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞吹勻，分裝96孔板，100μl/孔（2×104個(gè)細(xì)胞/孔），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，DMEM培養(yǎng)基將表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋（10-1~10-6稀釋），每個(gè)稀釋度8孔，100μl/孔，設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。接種96孔板后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5小時(shí)后更換含2%胎牛血清（FBS）的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)60h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，每次5min，拍干后冷甲醇-20℃固定20min，棄去固定液，PBS洗3遍，每次5min，吸水紙上拍干。加入用PBS稀釋的豬源PCV2陽(yáng)性血清（1:1000）50μl/孔，37℃孵育1h，PBS同上洗滌，拍干。避光加入25μl的1:200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豬熒光二抗（IgG），避光孵育45min，PBS同上洗滌，拍干。進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）觀察，病毒TCID50按Reed-Muench二氏法計(jì)算。經(jīng)檢測(cè)，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的TCID50為105.5/ml，滿足制備疫苗的要求。三、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的免疫效力試驗(yàn)：1、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）免疫試驗(yàn)分組及處理：收獲C1-233病毒液，IFA檢測(cè)病毒滴度，用PBS將病毒液稀釋至104.0TCID50/mL作為免疫用活疫苗。22頭商品豬隨機(jī)分為5組，免疫組和攻毒對(duì)照組各5頭，健康對(duì)照組2頭，試驗(yàn)分組及處理方法見(jiàn)表2。表2試驗(yàn)分組及處理情況注：a1頭豬在免疫后第2周采血死亡。2、實(shí)驗(yàn)豬在增重、死淘率及其他生產(chǎn)性能方面與對(duì)照豬的差異：攻毒前后對(duì)接種豬和對(duì)照豬分別測(cè)量體溫，稱重，計(jì)算各組的平均值，觀察有無(wú)差異；同時(shí)，在整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)實(shí)驗(yàn)豬、對(duì)照豬的各種副反應(yīng)、發(fā)病、死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。攻毒前各試驗(yàn)組豬體溫均在正常范圍。攻毒后免疫組豬無(wú)明顯臨床癥狀，體溫?zé)o明顯變化，攻毒對(duì)照組有3頭豬出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，連續(xù)3d體溫升高（40.5℃-41.6℃）。攻毒前平均相對(duì)日增重（ADWG）在0.26-0.51kg之間，攻毒后ADWG在0.37-0.89kg之間，各組間差異不顯著，見(jiàn)表3。表3各試驗(yàn)組豬體溫及ADWG情況（試驗(yàn)豬的分組見(jiàn)表2）3、血清熒光抗體效價(jià)：免疫前試驗(yàn)豬血清PCV2熒光抗體效價(jià)均小于1:10。免疫后14d表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）滅活疫苗組有2頭豬血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)性（1:100，1:200），表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗組有4頭豬血清中檢測(cè)到較高抗體（1:400，1:400，1:400，1:1600）。免疫后21d各組試驗(yàn)豬均可檢測(cè)到較高的PCV2的抗體（1:1600-1:6400）。表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）滅活疫苗組豬血清抗體35d達(dá)峰值（平均值1:15680）；表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗組豬血清抗體42d達(dá)峰值（平均值1:20480），隨后開(kāi)始下降。商品化PCV2b全病毒滅活疫苗組試驗(yàn)豬，21d檢測(cè)到血清抗體，28d達(dá)峰值（平均值1:5600）。攻毒對(duì)照組試驗(yàn)豬攻毒后14d可檢測(cè)到較高水平的抗體（平均值1:880）。健康對(duì)照組豬整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中血清PCV2抗體均為陰性，見(jiàn)圖10。由圖10可見(jiàn)：表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗免疫組，與該毒株滅活疫苗免疫組以及商品化滅活疫苗免疫組相比，盡管前者單頭豬所接受的疫苗病毒的量為2×104.0TCID50，而后者為2×105.0TCID50的滅活疫苗病毒，但無(wú)論在熒光抗體產(chǎn)生的速度、滴度，還是高抗體水平的持續(xù)時(shí)間，活疫苗均顯著優(yōu)于滅活疫苗。這一結(jié)果意義重大，一是豬圓環(huán)病毒（包括嵌合型豬圓環(huán)病毒）培養(yǎng)的滴度低，直接導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒病疫苗是迄今所有豬用疫苗中單價(jià)最高的疫苗。因此就單頭豬而言，在降低疫苗病毒的免疫劑量前提下，其免疫效果卻大為提高，意義不言而喻；二是活疫苗未使用任何佐劑，而作為對(duì)照的滅活疫苗均使用了進(jìn)口油乳劑，撇開(kāi)進(jìn)口佐劑的成本不說(shuō)，單就活疫苗幾無(wú)免疫副反應(yīng)，而即使采用進(jìn)口油乳劑制成的滅活疫苗，亦具固有、公認(rèn)的免疫副反應(yīng)，從而給免疫豬的生產(chǎn)性能帶來(lái)不可避免的副作用。因此，上述兩方面決定了表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗具有現(xiàn)有商品化滅活疫苗無(wú)可比擬的優(yōu)越性。4、血清中和抗體效價(jià)：免疫前試驗(yàn)豬血清均無(wú)中和抗體滴度，免疫后14d可檢測(cè)到明顯的中和抗體效價(jià)（1:4-1:8）。免疫后35d、42d、49d，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗組血清中和抗體均高于該毒株滅活疫苗組，兩組試驗(yàn)豬血清中和抗體42d達(dá)峰值（平均值分別為1:57.6和1:51.2），高水平中和抗體一直維持到免疫后49d，如圖11所示。由圖11可見(jiàn)：表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗免疫組，與該毒株滅活疫苗免疫組以及商品化滅活疫苗免疫組相比，中和抗體的滴度以及高水平中和抗體的持續(xù)時(shí)間，活疫苗免疫組均顯著優(yōu)于滅活疫苗免疫組。與熒光抗體水平相比，中和抗體更能代表疫苗的免疫效果，再次表明，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）活疫苗顯著優(yōu)于現(xiàn)有商品化滅活疫苗。四、表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的核苷酸、氨基酸序列：經(jīng)對(duì)表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）基因組全序列分析，獲得的C1-233株的基因組、ORF2基因序列及其與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a中ORF2基因的序列比較如下：1、本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株基因組核酸序列：ccgaaggccgatttgaagcagtggacccaccctgtgcccttttcccatataaaataaatt60actgagtcttttttgttatcacatcgtaatggtttttatttttatttaagggttaagtgg120ggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattc180ctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagt240agtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagt300ggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttat360ggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttac420aaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcgg480ggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacaga540gcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtc600caccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtatatccgaaggtgcggga660gaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacggtggcgggggtggac720gagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttct780ccggtaacgcctccttggatacgtcattcatcctataaaagtgaaagaagtgcgctgctg840tagtattaccagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcgtcagtgaaaatgccaa900gcaagaaaagcggcccgcaaccccataagaggtgggtgttcacccttaataatccttccg960aggaggagaaaaacaaaatacgggagcttccaatctccctttttgattattttgtttgcg1020gagaggaaggtttggaagagggtagaactcctcacctccaggggtttgcgaattttgcta1080agaagcagacttttaacaaggtgaagtggtattttggtgcccgctgccacatcgagaaag1140cgaaaggaaccgaccagcagaataaagaatactgcagtaaagaaggccacatacttatcg1200agtgtggagctccgcggaaccaggggaagcgcagcgacctgtctactgctgtgagtaccc1260ttttggagacggggtctttggtgactgtagccgagcagttccctgtaacgtatgtgagaa1320atttccgcgggctggctgaacttttgaaagttagcgggaagatgcagcagcgtgattgga1380agacagctgtacacgtcatagtgggcccgcccggttgtgggaagagccagtgggcccgta1440attttgctgagcctagcgacacctactggaagcctagtagaaataagtggtgggatggat1500atcatggagaagaagttgttgttttggatgatttttatggctggttaccttgggatgatc1560tactgagactgtgtgaccggtatccattgactgtagagactaaagggggtactgttcctt1620ttttggcccgcagtattttgattaccagcaatcaggccccccaggaatggtactcctcaa1680ctgctgtcccagctgtagaagctctctatcggaggattactactttgcaattttggaaga1740ctgctggagaacaatccacggaggtac17672、C1-233株和國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a中ORF2的核苷酸序列為：本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株中ORF2的核苷酸序列為：ttaagggttaagtggggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttac60acggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtg120gtctacatttccagtagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttg180gaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtagga240gaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggc300tgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtc360accctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagta420ttcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatatt480gaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtata540tccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacg600gtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggg660gcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcat702國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a[FenauxM,HalburPG,GillM,etal.Geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirus(PCV-2)frompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofNorthAmericaanddevelopmentofadifferentialPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCV-1andPCV-2[J].JClinMicrobiol,2000,38(7):2494-2503.]中ORF2的核苷酸數(shù)量也為702bp。將構(gòu)建的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株的ORF2進(jìn)行核苷酸序列比較，結(jié)果兩者ORF2核苷酸同源性為93%。ORF2基因編碼豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白，該蛋白為PCV2主要免疫保護(hù)性抗原。C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株中ORF2核苷酸序列同源性為93%，說(shuō)明：（1）本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株所用ORF2基因來(lái)自PCV2b0233株，該毒株分離自我國(guó)發(fā)病豬，由于ORF2為保護(hù)性抗原基因，預(yù)示與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a相比，本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株對(duì)我國(guó)豬圓環(huán)病毒病的保護(hù)效果更好。（2）本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株ORF2核苷酸序列同源性有明顯差異（7%），其意義在于：一方面ORF2中7%的核苷酸差異，可以作為本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株間相互區(qū)分的分子標(biāo)記；另一方面，證明C1-233株為本發(fā)明獨(dú)立構(gòu)建。C1-233株和國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a中ORF2的氨基酸序列的比較：C1-233株ORF2推導(dǎo)的氨基酸序列為：MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro151015ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal202530HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe354045AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrIleLysLysThr505560ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn657075IleAsnAspPheLeuProProGlyGlyGlyGerAsnProArgGer808590ValProPheGluTyrTyrArgIleArgLysValLysValGluPhe95100105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer110115120GerGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla125130135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle140145150ThrGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro155160165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg170175180AsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGlyAsnValAspHis185190195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnGlu200205210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn215220225LeuLysAspProProLeuLysPro230國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2aORF2推導(dǎo)的氨基酸序列為：MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro151015ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal202530HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe354045AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrValLysGlaThr505560ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn657075IleAspAspPheValProProGlyGlyGlyThrAsnLysIleGer808590IleProPheGluTyrTyrArgIleArglysValLysValGluPhe95100105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer110115120ThrGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla125130135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle140145150ProGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro155160165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg170175180AsnGlnLeuTrpMetArgLeuGlnThrGerArgAsnValAspHis185190195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnAsp200205210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn215220225LeuLysAspProProLeuLysPro230將構(gòu)建成功的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a對(duì)應(yīng)Cap蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果兩者Cap蛋白的氨基酸同源性為93%。如前所述，ORF2基因編碼豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白，該蛋白為PCV2主要免疫保護(hù)性抗原。C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株中Cap蛋白的氨基酸同源性為93%，同樣說(shuō)明：（1）與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a相比，本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株對(duì)我國(guó)豬圓環(huán)病毒病的保護(hù)效果更好。（2）本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株Cap蛋白的氨基酸同源性有明顯差異（7%），同樣可以作為本發(fā)明構(gòu)建的C1-233株與國(guó)外構(gòu)建的PCV1-2a株間相互區(qū)分的分子標(biāo)記；另一方面，證明C1-233株為本發(fā)明獨(dú)立構(gòu)建。以上結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)PCV1-2單拷貝質(zhì)粒采用特定的限制性內(nèi)切酶分別進(jìn)行三組雙酶切，然后常規(guī)連接實(shí)現(xiàn)PCV1-2雙拷貝的構(gòu)建，大大提高了PCV1-2雙拷貝構(gòu)建的成功率。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）滴度可達(dá)105TCID50/mL以上，構(gòu)建的活病毒效價(jià)滿足制備疫苗的要求。熒光顯微鏡觀察到，經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗株（C1-233株）的PK-15細(xì)胞中檢測(cè)到了明顯的特異熒光，該毒株免疫組豬血清熒光抗體42d達(dá)峰值（平均值1:20480）；該毒株免疫豬高水平中和抗體一直維持到免疫后49d。因此，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2b型ORF2基因的重組豬圓環(huán)病毒1型活載體疫苗（C1-233株）可作為基因工程疫苗使用，為深入研究PCV1與PCV2病毒基因的功能與致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為其他類似病毒的研究提供了借鑒。<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株及其構(gòu)建方法<160>10<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>1tttggtacccgaaggccgatt<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>2attggtacctccgtggattgttct<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>3gaagttaaccctaaatgaataaaaataaaaaccattacg<210>4<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>4ggtggcgcctccttggatacgtcatcctataaaagtg<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>5aggttataagtggtggggggtctttaagattaa<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>6ggaaacgttaccgcagaagaagacacc<210>7<211>1767<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的C1-233株基因組核酸序列<400>7ccgaaggccgatttgaagcagtggacccaccctgtgcccttttcccatataaaataaatt60actgagtcttttttgttatcacatcgtaatggtttttatttttatttaagggttaagtgg120ggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattc180ctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagt240agtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagt300ggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttat360ggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttac420aaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcgg480ggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacaga540gcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtc600caccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtatatccgaaggtgcggga660gaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacggtggcgggggtggac720gagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttct780ccggtaacgcctccttggatacgtcattcatcctataaaagtgaaagaagtgcgctgctg840tagtattaccagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcgtcagtgaaaatgccaa900gcaagaaaagcggcccgcaaccccataagaggtgggtgttcacccttaataatccttccg960aggaggagaaaaacaaaatacgggagcttccaatctccctttttgattattttgtttgcg1020gagaggaaggtttggaagagggtagaactcctcacctccaggggtttgcgaattttgcta1080agaagcagacttttaacaaggtgaagtggtattttggtgcccgctgccacatcgagaaag1140cgaaaggaaccgaccagcagaataaagaatactgcagtaaagaaggccacatacttatcg1200agtgtggagctccgcggaaccaggggaagcgcagcgacctgtctactgctgtgagtaccc1260ttttggagacggggtctttggtgactgtagccgagcagttccctgtaacgtatgtgagaa1320atttccgcgggctggctgaacttttgaaagttagcgggaagatgcagcagcgtgattgga1380agacagctgtacacgtcatagtgggcccgcccggttgtgggaagagccagtgggcccgta1440attttgctgagcctagcgacacctactggaagcctagtagaaataagtggtgggatggat1500atcatggagaagaagttgttgttttggatgatttttatggctggttaccttgggatgatc1560tactgagactgtgtgaccggtatccattgactgtagagactaaagggggtactgttcctt1620ttttggcccgcagtattttgattaccagcaatcaggccccccaggaatggtactcctcaa1680ctgctgtcccagctgtagaagctctctatcggaggattactactttgcaattttggaaga1740ctgctggagaacaatccacggaggtac<210>8<211>702<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的C1-233株中ORF2的核苷酸序列<400>8ttaagggttaagtggggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttac60acggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtg120gtctacatttccagtagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttg180gaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtagga240gaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggc300tgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtc360accctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagta420ttcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatatt480gaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtata540tccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacg600gtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggg660gcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcat<210>9<211>233<212>PRT<213>人工序列<220><223>C1-233株ORF2推導(dǎo)的氨基酸序列<400>9MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrIleLysLysThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75IleAsnAspPheLeuProProGlyGlyGlyGerAsnProArgGer90ValProPheGluTyrTyrArgIleArgLysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120GerGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle150ThrGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGlyAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnGlu210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro<210>10<211>233<212>PRT<213>人工序列<220><223>PCV1-2aORF2推導(dǎo)的氨基酸序列<400>10MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrValLysGlaThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75IleAspAspPheValProProGlyGlyGlyThrAsnLysIleGer90IleProPheGluTyrTyrArgIleArglysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120ThrGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle150ProGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpMetArgLeuGlnThrGerArgAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnAsp210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗C1-233株及其構(gòu)建方法<160>10<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>1tttggtacccgaaggccgatt<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>2attggtacctccgtggattgttct<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>3gaagttaaccctaaatgaataaaaataaaaaccattacg<210>4<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>4ggtggcgcctccttggatacgtcatcctataaaagtg<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>5aggttataagtggtggggggtctttaagattaa<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)pSK（+）-sPCV1-2b基因序列設(shè)計(jì)<400>6ggaaacgttaccgcagaagaagacacc<210>7<211>1767<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的C1-233株基因組核酸序列<400>7ccgaaggccgatttgaagcagtggacccaccctgtgcccttttcccatataaaataaatt60actgagtcttttttgttatcacatcgtaatggtttttatttttatttaagggttaagtgg120ggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattc180ctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagt240agtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagt300ggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttat360ggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttac420aaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcgg480ggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacaga540gcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtc600caccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtatatccgaaggtgcggga660gaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacggtggcgggggtggac720gagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttct780ccggtaacgcctccttggatacgtcattcatcctataaaagtgaaagaagtgcgctgctg840tagtattaccagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcgtcagtgaaaatgccaa900gcaagaaaagcggcccgcaaccccataagaggtgggtgttcacccttaataatccttccg960aggaggagaaaaacaaaatacgggagcttccaatctccctttttgattattttgtttgcg1020gagaggaaggtttggaagagggtagaactcctcacctccaggggtttgcgaattttgcta1080agaagcagacttttaacaaggtgaagtggtattttggtgcccgctgccacatcgagaaag1140cgaaaggaaccgaccagcagaataaagaatactgcagtaaagaaggccacatacttatcg1200agtgtggagctccgcggaaccaggggaagcgcagcgacctgtctactgctgtgagtaccc1260ttttggagacggggtctttggtgactgtagccgagcagttccctgtaacgtatgtgagaa1320atttccgcgggctggctgaacttttgaaagttagcgggaagatgcagcagcgtgattgga1380agacagctgtacacgtcatagtgggcccgcccggttgtgggaagagccagtgggcccgta1440attttgctgagcctagcgacacctactggaagcctagtagaaataagtggtgggatggat1500atcatggagaagaagttgttgttttggatgatttttatggctggttaccttgggatgatc1560tactgagactgtgtgaccggtatccattgactgtagagactaaagggggtactgttcctt1620ttttggcccgcagtattttgattaccagcaatcaggccccccaggaatggtactcctcaa1680ctgctgtcccagctgtagaagctctctatcggaggattactactttgcaattttggaaga1740ctgctggagaacaatccacggaggtac<210>8<211>702<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的C1-233株中ORF2的核苷酸序列<400>8ttaagggttaagtggggggtctttaagattaaattctctgaattgtacatacatggttac60acggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtg120gtctacatttccagtagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttg180gaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtagga240gaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggc300tgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtc360accctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagta420ttcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatatt480gaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgttctgactgtggttttcttgatagtata540tccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacg600gtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggg660gcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcat<210>9<211>233<212>PRT<213>人工序列<220><223>C1-233株ORF2推導(dǎo)的氨基酸序列<400>9MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrIleLysLysThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75IleAsnAspPheLeuProProGlyGlyGlyGerAsnProArgGer90ValProPheGluTyrTyrArgIleArgLysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120GerGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle150ThrGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGlyAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnGlu210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro<210>10<211>233<212>PRT<213>人工序列<220><223>PCV1-2aORF2推導(dǎo)的氨基酸序列<400>10MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgPro15ArgGerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuVal30HisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePhe45AsnThrArgLeuGerArgThrPheGlyTyrThrValLysGlaThr60ThrValArgThrProGerTrpGlaValAspMetMetArgPheAsn75IleAspAspPheValProProGlyGlyGlyThrAsnLysIleGer90IleProPheGluTyrTyrArgIleArglysValLysValGluPhe105TrpProCysGerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlyGer120ThrGlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysGlaThrGla135LeuThrTyrAspProTyrValAsnTyrGerGerArgHisThrIle150ProGlnProPheGerTyrHisGerArgTyrPheThrProLysPro165ValLeuAspGerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg180AsnGlnLeuTrpMetArgLeuGlnThrGerArgAsnValAspHis195ValGlyLeuGlyThrGlaPheGluAsnGerIleTyrAspGlnAsp210TyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPheAsn225LeuLysAspProProLeuLysPro當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3