本發(fā)明涉及一種A型流感病毒溫度敏感性的關(guān)鍵磷酸化位點及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

A型流感病毒包含8個分節(jié)段的RNA片段，利用這些RNA片段，共能編碼14種病毒蛋白。而病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要由RNP復(fù)合物這一功能單元來完成。病毒感染宿主細胞面臨著2層屏障，4次穿梭。

第一個屏障是病毒進入細胞需要穿過細胞質(zhì)膜，這時病毒利用血凝素蛋白HA和細胞表面的唾液酸受體結(jié)合，進行發(fā)生內(nèi)吞作用入侵到宿主細胞內(nèi)部。

之后基質(zhì)蛋白M1會釋放vRNP復(fù)合物到細胞質(zhì)中，而由于基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要在細胞核內(nèi)進行，此時的vRNP復(fù)合物面臨的第二道屏障，即細胞核膜。vRNP會利用NP蛋白N端的非典型雙向NLS同細胞核運輸受體蛋白importin-α結(jié)合，從而得以穿過核孔復(fù)合物，進入到細胞核內(nèi)部開始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA在細胞質(zhì)得到翻譯，新合成的病毒聚合酶組分又會分別利用自身的NLS進入到細胞核重新組裝成RNP復(fù)合物。

待病毒基因組復(fù)制完畢后，RNP復(fù)合物會利用NP蛋白同M1蛋白和NEP蛋白形成一個大的復(fù)合物，再利用細胞質(zhì)運輸?shù)鞍證RM1蛋白將之運輸?shù)郊毎|(zhì)中，完成再一次的穿梭屏障，然后組裝成完整的病毒粒子。

NP蛋白在兩次穿梭核膜的過程中，發(fā)揮著重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種A型流感病毒溫度敏感性的關(guān)鍵磷酸化位點及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先保護一種重組病毒，命名為病毒W(wǎng)SN-Y385F，是將A型流感病毒基因組中編碼NP蛋白的第385位酪氨酸殘基的密碼子突變?yōu)楸奖彼釟埢拿艽a子得到的重組病毒。病毒W(wǎng)SN-Y385F為溫度敏感型病毒，在37℃可以正常復(fù)制并存活，在33℃不能正常復(fù)制并且不能存活。

所述A型流感病毒具體可為WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

本發(fā)明還保護一種蛋白質(zhì)，命名為蛋白質(zhì)NP-Y385F，是NP蛋白的第385位酪氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼釟埢玫降牡鞍踪|(zhì)。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

編碼蛋白質(zhì)NP-Y385F的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。編碼蛋白質(zhì)NP-Y385F的基因命名為基因NP-Y385F。

基因NP-Y385F具體可為如下(a)或(b)：

(a)編碼區(qū)如序列表的序列10自5’末端第26-1522位核苷酸所示的DNA分子；

(b)序列表的序列10所示的DNA分子。

含有基因NP-Y385F的重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護范圍。

含有基因NP-Y385F的重組質(zhì)粒具體可為重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F。重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F為：在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入基因NP-Y385F得到的重組質(zhì)粒。

含有基因NP-Y385F的重組質(zhì)粒具體可為重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F。重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F為：在載體pcDNA3.0的多克隆位點(例如KpnI和XhoI酶切位點之間)插入基因NP-Y385F得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護一種溫度敏感型重組病毒，其制備方法包括如下步驟：

將質(zhì)粒pHH21-PA、質(zhì)粒pHH21-PB1、質(zhì)粒pHH21-PB2、質(zhì)粒pHH21-HA、質(zhì)粒pHH21-NA、質(zhì)粒pHH21-M、質(zhì)粒pHH21-NS、質(zhì)粒pcDNA3.0-PA、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2、重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F和重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F共轉(zhuǎn)染離體哺乳動物細胞后進行培養(yǎng)得到的重組病毒；

所述質(zhì)粒pHH21-PA為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-PB1為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-PB2具體可為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-HA為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-NA為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-M為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pHH21-NS為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入序列表的序列9所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pcDNA3.0-PA為在載體pcDNA3.0的多克隆位點(例如KpnI和XhoI酶切位點之間)插入序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1為在載體pcDNA3.0的多克隆位點(例如KpnI和XhoI酶切位點之間)插入序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2為在載體pcDNA3.0的多克隆位點(例如KpnI和XhoI酶切位點之間)插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子得到的質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F為在載體pHH21的多克隆位點(例如BsmBI酶切位點)插入基因NP-Y385F得到的質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F為在載體pcDNA3.0的多克隆位點(例如KpnI和XhoI酶切位點之間)插入基因NP-Y385F得到的質(zhì)粒。

所述哺乳動物細胞具體可為HEK 293T/17細胞。

所述培養(yǎng)的條件具體可為37℃培養(yǎng)6-78小時。

本發(fā)明還保護一種抑制A型流感病毒的NP蛋白發(fā)生磷酸化的方法，是將A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

本發(fā)明還保護一種降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是將A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

本發(fā)明還保護一種抑制A型流感病毒的NP蛋白發(fā)生磷酸化的方法，是將A型流感病毒基因組中編碼NP蛋白自N末端第385位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸密碼子突變?yōu)楸奖彼崦艽a子。

本發(fā)明還保護一種降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是將A型流感病毒基因組中編碼NP蛋白自N末端第385位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸密碼子突變?yōu)楸奖彼崦艽a子。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

所述A型流感病毒具體可為WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。

本發(fā)明還保護以上任一所述重組病毒在制備A型流感病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護一種A型流感病毒疫苗，其活性成分為以上任一所述重組病毒。

本發(fā)明對于流感病毒侵染的機理分析，流感病毒的防治等具有重大價值。

附圖說明

圖1為實施例1的步驟一的結(jié)果。

圖2為實施例1的步驟二的結(jié)果。

圖3為實施例2的結(jié)果。

圖4為實施例3的結(jié)果。

圖5為實施例4的結(jié)果。

圖6為實施例5的結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。WSN病毒即流感病毒。實施例中，采用病毒感染液調(diào)整病毒濃度從而實現(xiàn)不同劑量的感染。

載體pHH21：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。

HEK 293T/17細胞(簡稱293T細胞衍生系，人胚腎細胞)：ATCC,CRL-11268。載體pcDNA3.0：上海希匹吉生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品目錄號CPC030。大腸桿菌DH5α：上海北諾生物科技有限公司。A549細胞(人肺腺癌細胞)：上海拜力生物科技有限公司。BALB/c小鼠：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。MDCK細胞：ATCC,CCL-34。

細胞裂解液(pH7.4)：含150mM氯化鈉、20mM HEPES、10％(體積比)甘油、1mM EDTA、1g/100mL NP40、蛋白酶抑制劑(cocktail)，其余為水。

洗脫緩沖液：氯化鈉的濃度為300mM，其它同細胞裂解液。

病毒感染液：含2μg/ml TPCK處理的胰酶(胰酶是以胰酶母液的方式加入的，胰酶母液為用PBS緩沖液配制的胰酶濃度為0.25g/100mL的溶液)、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的無血清DMEM培養(yǎng)基。

堿性磷酸酶：Takara，貨號D2250。蛋白酶抑制劑(cocktail)購自Roche公司。SDM酶：北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，貨號:SDM-15。phos-tag SDS-PAGE中所用的凝膠為Phos-tag Acrylamide，購自Wako(日本)?？沽姿峄野彼峥贵w(鼠單克隆抗體，sc-508)購自Santa Cruz。具有已知分子量的預(yù)先染色的蛋白標準品購自Thermo。氯化鈉、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(簡稱HEPES)、甘油、乙二胺四乙酸(簡稱EDTA)、Nonidet P-40(簡稱NP40)和TPCK處理的胰酶均購自Sigma。牛血清白蛋白(BSA)購自江晨生物。青霉素、鏈霉素購自碧云天公司。十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)、低熔點瓊脂糖購自Amersco公司。

抗NP蛋白的單抗(即抗A型流感病毒NP蛋白的鼠源單克隆抗體)：M-R Yu#,X-L Liu#,Sh Cao,Zh-D Zhao,K Zhang,Q Xie,C-W Chen,Sh-Y Gao,Y-H Bi,L Sun,X Ye,George F.Gao,W-J Liu*.2012.Identification and Characterization of three novel nuclear export signals in influenza A virus nucleoprotein.Journal of Virology,86(9):4970-80。

將質(zhì)粒pHH21-PA、質(zhì)粒pHH21-PB1、質(zhì)粒pHH21-PB2、質(zhì)粒pHH21-HA、質(zhì)粒pHH21-NP、質(zhì)粒pHH21-NA、質(zhì)粒pHH21-M、質(zhì)粒pHH21-NS、質(zhì)粒pcDNA3.0-PA、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2和質(zhì)粒pcDNA3.0-NP共轉(zhuǎn)染HEK 293T/17細胞，培養(yǎng)后得到WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株又稱WSN病毒野生型。

實施例1、磷酸化NP蛋白的獲得以及磷酸化位點的鑒定

一、磷酸化NP蛋白的獲得

1、將A/WSN/1933(H1N1)毒株以MOI＝0.1的劑量感染HEK 293T/17細胞，37℃培養(yǎng)12-16小時后收獲細胞。

2、將步驟1收獲的細胞用細胞裂解液4℃處理30分鐘，12000rpm離心15min，收集上清液。

3、在步驟2得到的上清液中加入抗NP蛋白的單抗，4℃孵育1小時，然后加入protein G beads 4℃孵育3小時，吸棄上清，將珠子(beads)用洗脫緩沖液在4℃下洗3次(每次10分鐘)，與珠子(beads)結(jié)合的即為NP蛋白。

4、將步驟3獲得的結(jié)合有NP蛋白的珠子用堿性磷酸酶37℃處理2小時(堿性磷酸酶的作用為：使磷酸化蛋白去磷酸化)。

5、將堿性磷酸酶處理前的NP蛋白(步驟3得到的)和堿性磷酸酶處理后的NP蛋白(步驟4得到的)分別進行磷酸化蛋白電泳(phos-tag SDS-PAGE)并銀染顯色。

結(jié)果見圖1。圖1中，泳道1為堿性磷酸酶處理后的NP蛋白，泳道2為堿性磷酸酶處理前的NP蛋白。將堿性磷酸酶處理后的NP蛋白作為標準NP蛋白，堿性磷酸酶處理前的NP蛋白在膠上出現(xiàn)比標準NP蛋白遷移速率慢且對堿性磷酸酶敏感的條帶,即為磷酸化NP條帶。結(jié)果表明，步驟3獲得的NP蛋白為磷酸化蛋白，堿性磷酸酶可以使其發(fā)生去磷酸化反應(yīng)。

二、質(zhì)譜鑒定磷酸化位點

將磷酸化的NP條帶從膠上切下，送樣至中國科學(xué)院動物研究所大型儀器平臺進行樣品處理及質(zhì)譜鑒定(Nano-LC MS/MS,LCQ DECA XP^PLUS Thermo)。

結(jié)果見圖2。B2與b3的核質(zhì)比差值顯示Y385被磷酸化修飾。鑒定結(jié)果顯示，該條帶為A型流感病毒的NP蛋白，且在385位酪氨酸殘基處具有磷酸化修飾。

實施例2、突變蛋白的制備和磷酸化鑒定

一、構(gòu)建重組質(zhì)粒

1、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-PA

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-PA。

2、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-PB1

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-PB1。

3、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-PB2

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-PB2。

4、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-HA

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-HA。

5、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-NP

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-NP。

6、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-NA

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-NA。

7、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-M

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-M。

8、構(gòu)建質(zhì)粒pHH21-NS

在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列9所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pHH21-NS。

9、構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.0-PA

在載體pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位點之間插入序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pcDNA3.0-PA。

10、構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1

在載體pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位點之間插入序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1。

11、構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2

在載體pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位點之間插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2。

12、構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.0-NP

在載體pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位點之間插入序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子，得到質(zhì)粒pcDNA3.0-NP。

13、構(gòu)建重組質(zhì)粒

NP-Y385A-F:5’-ctgagaagcagaGCGtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385A-R:5’-ccttatggcccaCGCtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

NP-Y385F-F:5’-ctgagaagcagaTTCtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385F-R:5’-ccttatggcccaGAAtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

NP-Y385E-F:5’-ctgagaagcagaGAGtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385E-R:5’-ccttatggcccaCTCtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

使用Newpep點突變試劑盒(Cat.No.80111-01,北京諾派生物科技有限公司)按試劑盒說明書構(gòu)建各種重組質(zhì)粒。

(1)以質(zhì)粒pHH21-NP為模板，用NP-Y385A-F和NP-Y385A-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(2)用SDM酶在37℃酶切步驟(1)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385A-Ⅰ(即含有重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pHH21-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱吮彼岬拿艽a子“GCG”。

(4)以pcDNA3.0-NP為模板，用NP-Y385A-F和NP-Y385A-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(5)用SDM酶在37℃酶切步驟(4)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(6)將步驟(5)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385A-Ⅱ(即含有重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pcDNA3.0-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱吮彼岬拿艽a子“GCG”。

(7)以質(zhì)粒pHH21-NP為模板，用NP-Y385F-F和NP-Y385F-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(8)用SDM酶在37℃酶切步驟(7)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(9)將步驟(8)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385F-Ⅰ(即含有重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pHH21-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱吮奖彼岬拿艽a子“TTC”；也就是說，在載體pHH21的BsmBI酶切位點插入序列表的序列10所示的雙鏈DNA分子。

(10)以質(zhì)粒pcDNA3.0-NP為模板，用NP-Y385F-F和NP-Y385F-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(11)用SDM酶在37℃酶切步驟(10)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(12)將步驟(11)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385F-Ⅱ(即含有重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pcDNA3.0-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱吮奖彼岬拿艽a子“TTC”；也就是說，在載體pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位點之間插入了序列表的序列10所示的雙鏈DNA分子。

(13)以質(zhì)粒pHH21-NP為模板，用NP-Y385E-F和NP-Y385E-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(14)用SDM酶在37℃酶切步驟(13)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(15)將步驟(14)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385E-Ⅰ(即含有重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385E的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385E進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pHH21-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱斯劝彼岬拿艽a子“GAG”。

(16)以質(zhì)粒pcDNA3.0-NP為模板，用NP-Y385E-F和NP-Y385E-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(突變質(zhì)粒)。

(17)用SDM酶在37℃酶切步驟(16)的PCR擴增產(chǎn)物2小時(消化模板質(zhì)粒)。

(18)將步驟(17)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞，得到重組菌Y385E-Ⅱ(即含有重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385E的大腸桿菌)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385E進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pcDNA3.0-NP中的編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子“tac”突變?yōu)榱斯劝彼岬拿艽a子“GAG”。

二、突變蛋白的制備

1、Y385F突變蛋白的制備

(1)將質(zhì)粒pHH21-PA、質(zhì)粒pHH21-PB1、質(zhì)粒pHH21-PB2、質(zhì)粒pHH21-HA、重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F、質(zhì)粒pHH21-NA、質(zhì)粒pHH21-M、質(zhì)粒pHH21-NS、質(zhì)粒pcDNA3.0-PA、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2和重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F以等質(zhì)量的配比通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HEK 293T/17細胞，37℃培養(yǎng)6小時。

(2)更換步驟(1)的細胞的培養(yǎng)基為病毒感染液，37℃培養(yǎng)72小時后收獲細胞。

(3)將步驟(2)收獲的細胞用細胞裂解液4℃處理30分鐘，12000rpm離心15min，收集上清液。

(4)在步驟(3)得到的上清液中加入抗NP蛋白的單抗，4℃孵育1小時，然后加入protein G beads 4℃孵育3小時，吸棄上清，將珠子(beads)用洗脫緩沖液在4℃下洗3次(每次10分鐘)，與珠子(beads)結(jié)合的即為Y385F突變蛋白。

2、NP蛋白的制備

用質(zhì)粒pHH21-NP代替重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F并且用質(zhì)粒pcDNA3.0-NP代替重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F，其它同步驟1，與珠子(beads)結(jié)合的即為NP蛋白。

3、Western Blot檢測

將步驟1和步驟2得到的蛋白分別進行western blot，采用的一抗為抗磷酸化酪氨酸抗體，采用的二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG。

結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，與NP蛋白相比Y385F突變蛋白的磷酸化水平顯著下降，即NP蛋白第385位的酪氨酸殘基為主要的磷酸化位點。

實施例3、病毒拯救

1、將HEK 293T/17細胞接種于60mm平皿，每皿1×10⁶個細胞，培養(yǎng)12小時。

2、完成步驟1后，對HEK 293T/17細胞進行分組處理如下：

第一組：將質(zhì)粒pHH21-PA、質(zhì)粒pHH21-PB1、質(zhì)粒pHH21-PB2、質(zhì)粒pHH21-HA、重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A、質(zhì)粒pHH21-NA、質(zhì)粒pHH21-M、質(zhì)粒pHH21-NS、質(zhì)粒pcDNA3.0-PA、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB1、質(zhì)粒pcDNA3.0-PB2和重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A各0.5μg通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HEK 293T/17細胞，37℃培養(yǎng)6小時后更換培養(yǎng)基為病毒感染液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后收獲細胞。

第二組：與第一組的差異僅在于用重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385F代替重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A并且用重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385F代替重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

第三組：與第一組的差異僅在于用重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385E代替重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A并且用重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385E代替重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

第四組：與第一組的差異僅在于用質(zhì)粒pHH21-NP代替重組質(zhì)粒pHH21-NP-Y385A并且用質(zhì)粒pcDNA3.0-NP代替重組質(zhì)粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

3、完成步驟2后，各組分別收獲培養(yǎng)上清。

第四組得到的培養(yǎng)上清中含WSN病毒野生型，因此該將培養(yǎng)上清命名為WSN-WT病毒液。

第一組得到的培養(yǎng)上清中含有WSN病毒突變型(突變病毒基因組中編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子突變?yōu)榱吮彼岬拿艽a子，將該突變病毒命名為WSN-Y385A病毒)，因此該將培養(yǎng)上清命名為WSN-Y385A病毒液。

第二組得到的培養(yǎng)上清中含有WSN病毒突變型(突變病毒基因組中編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子突變?yōu)榱吮奖彼岬拿艽a子，將該突變病毒命名為WSN-Y385F病毒)，因此該將培養(yǎng)上清命名為WSN-Y385F病毒液。

第三組得到的培養(yǎng)上清中含有WSN病毒突變型(突變病毒基因組中編碼NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密碼子突變?yōu)榱斯劝彼岬拿艽a子，將該突變病毒命名為WSN-Y385E病毒)，因此該將培養(yǎng)上清命名為WSN-Y385E病毒液。

4、取步驟3得到的各個病毒液，通過噬斑鑒定檢測病毒滴度。

噬斑鑒定的方法：(1)將MDCK細胞接種于12孔板中，每孔約1×10⁵個細胞，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；(2)用PBS緩沖液洗去細胞表面的培養(yǎng)基，將待測的病毒液用病毒感染液梯度稀釋后分別加入各孔中，每個稀釋度設(shè)置三個重復(fù)孔，37℃孵育1小時；(3)吸棄上清并用PBS緩沖液清洗細胞，每孔加入1毫升混合溶液(混合溶液的制備方法：將1體積份融化后降溫至37℃左右的3％低熔點瓊脂糖與1體積份預(yù)熱到37℃的無酚紅DMEM培養(yǎng)基等體積混合，且混合物中加入TPCK處理的胰酶、青霉素和鏈霉素，使得胰酶濃度為2μg/ml，青霉素和鏈霉素的濃度均為100U/ml)；(4)將12孔板4℃放置15分鐘以上，待瓊脂凝固后，將孔板翻轉(zhuǎn)過來倒置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細胞病變情況，培養(yǎng)3天(實際應(yīng)用中，2-4天均可)后，將12孔板從培養(yǎng)箱中取出，計數(shù)空斑數(shù)。

WSN-WT病毒液的滴度為6.512log₁₀PFU/ml。WSN-Y385F病毒液的滴度為7.179log₁₀PFU/ml。WSN-Y385A病毒液的滴度為0，即不能使MDCK產(chǎn)生噬斑。WSN-Y385E病毒液的滴度為0，即不能使MDCK產(chǎn)生噬斑。

5、完成步驟2后，各組分別收獲細胞，將細胞破碎后進行western blot(檢測各主要病毒蛋白的表達)。

Western Blot中：用于檢測NP蛋白的一抗購自Thermo Scientific公司，產(chǎn)品目錄號：PA5-32242；用于檢測M1蛋白的一抗為抗M1蛋白的單抗。

結(jié)果見圖4。各組重組系統(tǒng)中流感病毒的兩種重要蛋白(NP蛋白、M1蛋白)均能夠正常表達。

實施例4、細胞水平下不同溫度下病毒生長曲線的差異

1、將A549細胞接種于10cm平皿，每皿1×10⁸個細胞，培養(yǎng)12小時。

2、完成步驟1后，對A549細胞進行分組處理如下：

第一組：將實施例3制備的WSN-WT病毒液(病毒劑量為10⁶PFU)接種A549細胞，接種后1小時換液為病毒感染液；37℃培養(yǎng)，分別于接種12、24、36、48、60、72小時后收取上清液，通過噬斑鑒定檢測病毒滴度。

第二組：將實施例3制備的WSN-Y385F病毒液(病毒劑量為10⁶PFU)接種A549細胞，接種后1小時換液為病毒感染液；37℃培養(yǎng)，分別于接種12、24、36、48、60、72小時后收取上清液，通過噬斑鑒定檢測病毒滴度。

第三組：與第一組的差異僅在于培養(yǎng)溫度由37℃改為33℃。

第四組：與第二組的差異僅在于培養(yǎng)溫度由37℃改為33℃。

噬斑鑒定的方法同實施例3。

每組設(shè)置10個重復(fù)處理，結(jié)果取平均值。

結(jié)果見圖5。圖5中，A為第三組和第四組的結(jié)果，B為第一組和第二組的結(jié)果。

33℃培養(yǎng)過程中，WSN-WT病毒均能正常復(fù)制，病毒滴度保持相對穩(wěn)定、緩慢上升的趨勢。33℃培養(yǎng)24小時后，WSN-Y385F病毒滴度為0，即WSN-Y385F病毒在33℃不能復(fù)制。37℃培養(yǎng)過程中，WSN-WT病毒和WSN-Y385F病毒均能正常復(fù)制，病毒滴度均保持相對穩(wěn)定、緩慢上升的趨勢。結(jié)果表明，WSN-Y385F病毒為溫度敏感性病毒。

實施例5、動物水平下不同溫度下病毒生長曲線的差異

36只體重約17g的6-8周齡BALB/c小鼠經(jīng)過乙醚麻醉后隨機分為三組，每組12只，分別進行如下處理：

第一組：利用鼻吸法吸入50μl實施例3制備的WSN-WT病毒液(病毒滴度為10⁴PFU/ml)；

第二組：利用鼻吸法吸入50μl實施例3制備的WSN-Y385F病毒液(病毒滴度為10⁴PFU/ml)；

第三組：利用鼻吸法吸入50μl滅菌后的PBS緩沖液。

完成上述處理后開始計時，分別于第1天、第3天、第5天、第7天時解剖小鼠(每個時間點每組取3只小鼠)，獲得小鼠肺臟和鼻甲骨(鼻甲骨和肺的溫度不同，鼻甲骨溫度較低、約為33℃，肺部溫度較高、約為37℃)。

取0.1g鮮重的肺臟或鼻甲骨，加入1ml冰浴的pH7.2的PBS緩沖液，采用QIAGEN TissueLyser II進行組織勻漿(勻漿參數(shù)：30循環(huán)/s,共計4min)，然后5000g離心10min，收集上清液。

通過噬斑鑒定檢測上清液中的病毒滴度(噬斑鑒定方法同實施例3)。

結(jié)果見圖6。圖6中，A為肺臟結(jié)果，B為鼻甲骨的結(jié)果。

鼻甲骨中，WSN-WT病毒均能正常復(fù)制，病毒滴度保持相對穩(wěn)定、緩慢下降的趨勢。鼻甲骨中，WSN-Y385F病毒滴度為0，即WSN-Y385F病毒在33℃不能復(fù)制。肺臟中，WSN-WT病毒和WSN-Y385F病毒均能正常復(fù)制，病毒滴度均保持相對穩(wěn)定、緩慢下降的趨勢。結(jié)果表明，WSN-Y385F病毒為溫度敏感性病毒。

序列表

<110> A型流感病毒溫度敏感性的關(guān)鍵磷酸化位點及其應(yīng)用

<120> 中國科學(xué)院微生物研究所

<130> GNCYX170081

<160> 10

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Thr Lys Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met

20 25 30

Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Arg Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Thr Met Val Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Ser Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val

340 345 350

Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ser Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Asp Arg Pro Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Leu Met

435 440 445

Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120

gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcggggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

caaaatgctc ttaatgggaa cggagatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300

aggaagctta agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatagcact cagttattct 360

gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420

gaagtggcat ttggcctggt atgcgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480

tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540

ctagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600

gaggccatgg atattgctag tcaggccagg caaatggtgc aggcgatgag aaccgttggg 660

actcatccta gctccagtgc tggtctaaaa gatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720

cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacga ttcaagtgat cctctcgtca ttgcagcaaa 780

tatcattgga atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840

ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgccagagtc 900

tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960

tgtcaacata gagctggagt aaaa 984

<210> 3

<211> 2202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgattcaaa atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc 60

ggaaaaggca atgaaagagt atggagagga cctgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc 120

aatatgcact cacttggaag tgtgcttcat gtattcagat tttcacttca tcgatgagca 180

aggcgagtca atagtcgtag aacttggcga tccaaatgca cttttgaagc acagatttga 240

aataatcgag ggaagagatc gcacaatagc ctggacagta ataaacagta tttgcaacac 300

tacaggggct gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaaga agaatagatt 360

catcgaaatt ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa 420

aattaaatct gagaagacac acatccacat tttctcattc actggggagg aaatggccac 480

aaaggccgac tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca ggctattcac 540

cataagacaa gaaatggcta gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg 600

cgaagagaca attgaagaaa gatttgaaat cacaggaaca atgcgcaagc ttgccgacca 660

aagtctcccg ccaaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga 720

accgaacggc tacattgagg gcaagctttc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat 780

tgaacctttt ttgaaatcaa caccacgacc acttagactt ccggatgggc ctccctgttc 840

tcagcggtcc aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca 900

tgagggagag gggataccgc tatatgatgc aatcaaatgc atgagaacat tctttggatg 960

gaaggaaccc aatgttgtta aaccacacga aaagggaata aatccaaatt atcttctgtc 1020

atggaagcaa gtactggcag aactgcagga cattgagaat gaggagaaaa ttccaaggac 1080

taaaaatatg aagaaaacga gtcagttaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccaga 1140

aaaggtagac tttgacgatt gtaaagatgt aggcgatttg aagcaatatg atagtgatga 1200

accagaattg aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag ttcaacaagg catgtgaact 1260

gaccgattca agctggatag agctcgatga gattggagaa gatgcggctc caattgaaca 1320

cattgcaagc atgagaagga attatttcac agcagaggtg tctcattgca gagccacaga 1380

atacataatg aagggggtgt acatcaatac tgccttgctt aatgcatcct gtgcagcaat 1440

ggatgatttc caattgattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa 1500

gaccaatttg tacggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgatgt 1560

ggtaaacttt gtgagcatgg agttttccct cactgaccca agacttgaac cacacaaatg 1620

ggagaagtac tgtgttcttg aggtaggaga tatgcttcta agaagtgcca taggccatgt 1680

gtcaaggcct atgttcttgt atgtgaggac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg 1740

ggggatggaa atgaggcgtt gcctccttca gtcacttcaa caaatcgaga gtatgattga 1800

agctgagtcc tctgtcaagg agaaagacat gaccaaagag ttctttgaaa acaaatcaga 1860

aacatggccc gttggagagt cccccaaagg agtggaggaa ggttccattg ggaaggtctg 1920

cagaacttta ttggcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactggaagg 1980

attttcagct gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga 2040

acctgggacc tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga 2100

tccctgggtt ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc ctcacacatg cattgagata 2160

gttgtggcaa tgctactatt tgctatccat actgtccaaa aa 2202

<210> 4

<211> 2303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttgaatgg atgtcaatcc gactttactt ttcttaaaag tgccagcaca aaatgctata 60

agcacaactt tcccttatac tggagaccct ccttacagcc atgggacagg aacaggatac 120

accatggata ctgtcaacag gacacatcag tactcagaaa ggggaagatg gacaacaaac 180

accgaaactg gagcaccgca actcaacccg attgatgggc cactgccaga agacaatgaa 240

ccaagtggtt atgcccaaac agattgtgta ttggaagcaa tggccttcct tgaggaatcc 300

catcctggta tctttgagac ctcgtgtctt gaaacgatgg aggttgttca gcaaacacga 360

gtggacaagc tgacacaagg ccgacagacc tatgactgga ctctaaatag gaaccagcct 420

gctgcaacag cattggccaa cacaatagaa gtgttcagat caaatggcct cacggccaat 480

gaatctggaa ggctcataga cttccttaag gatgtaatgg agtcaatgaa caaagaagaa 540

atggagatca caactcattt tcagagaaag agacgagtga gagacaatat gactaagaaa 600

atggtgacac agagaacaat aggtaaaagg aagcagagat tgaacaaaag gagttatcta 660

attagggcat taaccctgaa cacaatgacc aaagatgctg agagagggaa gctaaaacgg 720

agagcaattg caaccccagg gatgcaaata agggggtttg tatactttgt tgagacacta 780

gcaaggagta tatgtgagaa acttgaacaa tcaggattgc cagttggagg caatgagaag 840

aaagcaaagt tggcaaatgt tgtaaggaag atgatgacca attctcagga cactgaaatt 900

tctttcacca tcactggaga taacaccaaa tggaacgaaa atcagaaccc tcggatgttt 960

ttggccatga tcacatatat aaccagaaat cagcccgaat ggttcagaaa tgttctaagt 1020

attgctccaa taatgttctc aaacaaaatg gcgagactgg gaaaggggta catgtttgag 1080

agcaagagta tgaaacttag aactcaaata cctgcagaaa tgctagcaag catcgatttg 1140

aaatacttca atgattcaac tagaaagaag attgaaaaaa tccggccgct cttaatagat 1200

gggactgcat cattgagccc tggaatgatg atgggcatgt tcaatatgtt aagtactgta 1260

ttaggcgtct ccatcctgaa tcttggacaa aagagacaca ccaagactac ttactggtgg 1320

gatggtcttc aatcttctga tgattttgct ctgattgtga atgcacccaa tcatgaaggg 1380

attcaagccg gagtcaacag gttttatcga acctgtaagc tacttggaat taatatgagc 1440

aagaaaaagt cttacataaa cagaacaggt acatttgaat tcacaagttt tttctatcgt 1500

tatgggtttg ttgccaattt cagcatggag cttcccagct ttggggtgtc tgggatcaac 1560

gagtctgcgg acatgagtat tggagttact gtcatcaaaa acaatatgat aaacaatgat 1620

cttggtccag caaccgctca aatggccctt cagctgttca tcaaagatta caggtacacg 1680

taccggtgcc atagaggtga cacacaaata caaacccgaa gatcatttga aataaagaaa 1740

ctgtgggagc aaacccattc caaagctgga ctgctggtct ccgacggagg cccaaattta 1800

tacaacatta gaaatctcca cattcctgaa gtctgcttga aatgggaatt aatggatgag 1860

gattaccagg ggcgtttatg caacccactg aacccatttg tcaaccataa agacattgaa 1920

tcagtgaaca atgcagtgat aatgccagca catggtccag ccaaaaacat ggagtatgat 1980

gctgttgcaa caacacactc ctggatcccc aaaagaaatc gatccatctt gaatacaagc 2040

caaagaggaa tacttgaaga tgaacaaatg taccaaaagt gctgcaactt atttgaaaaa 2100

ttcttcccca gcagttcata cagaagacca gtcgggatat ccagtatggt ggaggctatg 2160

gtttccagag cccgaattga tgcacgaatt gatttcgaat ctggaaggat aaagaaagag 2220

gagttcactg agatcatgaa gatctgttcc accattgaag agctcagacg gcaaaaatag 2280

tgaatttagc ttgtccttca tga 2303

<210> 5

<211> 2290

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggaaagaa taaaagaact aaggaatcta atgtcgcagt ctcgcactcg cgagatactc 60

acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120

aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180

aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcagg gacaaacttt atggagtaaa 240

atgaatgacg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300

aggaatggac cagtgacaag tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360

aaagtcgaaa ggttaaaaca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420

atacgtcgaa gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa agaggcacag 480

gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540

tcgcaactaa cgacaaccaa agagaagaaa gaagaactcc agggttgcaa aatttctcct 600

ctgatggtgg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660

gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgacccaagg aacatgctgg 720

gaacagatgt acactccagg aggggaggcg aggaatgatg atgttgatca aagcttaatt 780

attgctgcta gaaacatagt aagaagagcc acagtatcag cagatccact agcatcttta 840

ttggagatgt gccacagcac gcagattggt ggagtaagga tggtaaacat ccttaggcag 900

aacccaacag aagagcaagc cgtggatatt tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960

tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020

gaggaagagg tgcttacggg caatcttcag acattgaaga taagagtgca tgagggatat 1080

gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagctatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140

ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200

gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag ttagaggtga cctgaatttc 1260

gtcaataggg cgaatcagcg attgaatccc atgcaccaac ttttgagaca ttttcagaag 1320

gatgcaaagg tgctctttca aaattgggga attgaatcca tcgacaatgt gatgggaatg 1380

atcgggatat tgcccgacat gactccaagc accgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440

agcaaaatgg gggtagatga gtattccagc gcggagaaga tagtggtgag cattgaccgt 1500

tttttgagag ttagggacca acgtgggaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560

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ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat cagtggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680

aaaattcagt ggtcccagaa tcctacaatg ctgtacaata aaatggaatt tgagccattt 1740

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caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgctc agataataaa acttcttccc 1860

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accactaaaa gactcacagt tctcggaaag gatgctggcc ctttaactga agacccagat 2040

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<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaaaatgaa ggcaaaacta ctggtcctgt tatatgcatt tgtagctaca gatgcagaca 60

caatatgtat aggctaccat gcgaacaact caaccgacac tgttgacaca atattcgaga 120

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gtaaattaaa aggaatagcc ccactacaat tggggaaatg taacatcatc ggatggctct 240

tgggaaatcc agaatgcgac tcactgcttc cagcgagatc atggtcctac attgtagaaa 300

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agggatctat aaacagcaat ctccctttcc agaatataca cccagtcaca ataggagagt 960

gcccaaaata tgtcaggagt accaaattga ggatggttac aggactaaga aacatcccat 1020

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cttatgatta tccaaaatat tcagaagaat caaagttgaa cagggaaaag atagatggag 1560

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<210> 7

<211> 1526

<212> DNA

<213> 人工序列

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aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga ctgcttcaaa acagccaagt 960

atacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag agtcaactgg tgtggatggc 1020

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ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt gcttccaatg aaaacatgga 1140

gactatggaa tcaagtaccc ttgaactgag aagcagattc tgggccataa ggaccagaag 1200

tggagggaac accaatcaac agagggcttc ctcgggccaa atcagcatac aacctacgtt 1260

ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag accaaccatt atggcagcat tcactgggaa 1320

tacagagggg agaacatctg acatgagaac cgaaatcata aggctgatgg aaagtgcaag 1380

accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag ctctcggacg aaaaggcaac 1440

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