本發(fā)明屬于物理化學領域，具體涉及合成的溫度敏感性三嵌段聚合物、含該三嵌段聚合物的還原和超聲敏感核殼結構微凝膠及其在核殼結構微凝膠制備中的應用。

背景技術：

聚合物膠束是一種新型藥物制劑，由兩親性二嵌段或三嵌段聚合物自組裝形成，具有制備簡單、載藥量高和藥物可控釋放等優(yōu)點，是一種極有前途的藥物載體。一般情況下，聚合物膠束形成核殼納米微球，內(nèi)核疏水，可容納疏水性藥物；外殼親水，確保其在水溶液中的穩(wěn)定性溶解性。還可以通過對外殼進行化學修飾，使其具有某種特定功能。

單一刺激響應性的聚合物膠束難以實現(xiàn)在空間和時間上的更精確的釋藥。因此研究具有多重響應性的聚合物膠束具有很大的意義。elizabethhuynh^[1]在文獻中提到在納米微粒表面接枝卟啉分子，內(nèi)部負載全氟分子，可使其同時具有超聲、光聲響應性。bezagum^[2]也在文獻中提到可以利用超聲波實現(xiàn)對復合液滴自發(fā)反應的高時空控制。本發(fā)明基于以上情況，設計合成了具有溫度敏感性的三嵌段聚合物，將其自組裝后進行交聯(lián)、負載，最終得到具有溫度、還原、超聲多重敏感性的核殼結構微凝膠。該微凝膠用以藥物載體，在外界超聲波刺激下，完成迅速釋放內(nèi)含藥物的目的。

參考文獻：

[1]huynh,e.；leung,b.y.c.；helfield,b.l.,"insituconversionofporphyrinmicrobubblestonanoparticlesformultimodalityimaging."naturenanotechnology.2015,10(4):325-332.

[2]bezagu,m.；errico,c.；chaulot-talmon,v.；monti,f.；tanter,m.；tabeling,p.；cossy,j.；arseniyadis,s.；couture,o.,highspatiotemporalcontrolofspontaneousreactionsusingultrasound-triggeredcompositedroplets.journaloftheamericanchemicalsociety2014,136(20),7205-7208.

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有溫度敏感性的三嵌段聚合物用于微凝膠制備。

本發(fā)明的進一步目的在于提供一種具有溫度、還原、超聲敏感性的核殼結構微凝膠。

本發(fā)明的更進一步目的在于提供所述溫度、還原、超聲敏感性的核殼結構微凝膠在制備控釋藥物上的用途。

本發(fā)明技術方案為：

一種具有溫度敏感性的三嵌段聚合物，其結構為peim-b-pnipamn-b-peim，其中聚合度n:20、50、100、150、300，pei分子量m:600、1800、10000；

所述具有溫度敏感性的三嵌段聚合物由以下方法制備得到：

1)在schlenk瓶中，將單體nipam、鏈轉(zhuǎn)移劑雙(羧甲基)三硫代碳酸酯、引發(fā)劑aibn以n:10:1的摩爾比溶于1，4-二氧六環(huán)中，進行atrp聚合，體系在60-70℃下反應6-8h，得到hooc-pnipamn-cooh；其中n:20、50、100、150、300；

2)將步驟1)中得到的hooc-pnipamn-cooh在40-50℃下旋蒸至粘稠狀，用冰無水乙醚沉降提純，過濾分離，30-40℃下真空干燥過夜，得淡黃色粉末狀產(chǎn)物hooc-pnipamn-cooh；

3)將步驟2)中所得hooc-pnipamn-cooh溶解在mes緩沖液中，向其中加入edc和nhs，室溫下預活化，邊攪拌邊加入支化pei；氮氣氛下，25℃恒溫振蕩水浴反應，反應結束后，離心，除去未反應的hooc-pnipamn-cooh；

4)將反應液升溫至50℃，使產(chǎn)物沉淀，在相同溫度下離心得到產(chǎn)物peim-b-pnipamn-b-peim。

本發(fā)明還提供一種具有溫度敏感性的膠束，由上述具有溫度敏感性的三嵌段聚合物在水溶液中自組裝所得。所述聚合物加入純水中，在溫度高于lcst條件下自組裝1-2h，使用動態(tài)光散射儀測量其粒徑變化，從而確定自組裝成功。

本發(fā)明還提供一種具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠，由上述膠束與交聯(lián)劑bacy加成得到。

本發(fā)明還提供一種上述具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠的制備方法如下：

1)將peim-b-pnipamn-b-peim溶解在超純水中，氮氣氛下，在溫度高于lcst的條件下磁力攪拌；

2)加入交聯(lián)劑bacy，磁力攪拌反應，得到核殼結構微凝膠。

進一步，所述的具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠，所述核殼結構微凝膠為可以載藥的微凝膠。

本發(fā)明還提供一種上述述的具有溫度、還原雙重敏感性的可以載藥的核殼結構微凝膠的制備方法如下：

1)25℃下，將權利要求3所述的核殼結構微凝膠和dox分散在磷酸鹽緩沖液中攪拌；

2)將分散液離心，并用pbs緩沖液洗滌，然后真空冷凍干燥，得到載了藥的核殼結構微凝膠。

本發(fā)明還提供一種具有溫度、還原、超聲多重敏感性核殼結構微凝膠，由上述微凝膠負載全氟分子得到，其中的全氟分子選自全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷。

本發(fā)明還提供一種上述述具有溫度、還原、超聲多重敏感性核殼結構微凝膠的制備方法如下：

1)冰水浴條件下，向裝有權利要求5或6所述的核殼結構微凝膠的棕色羅口瓶中逐滴滴加全氟分子；

2)蓋緊瓶蓋后，冰水浴下超聲后，將其轉(zhuǎn)移到pbs緩沖液中，室溫下輕微攪拌。

本發(fā)明還提供具有溫度、還原、超聲多重敏感性核殼結構微凝膠在制備控釋藥物上的用途。

產(chǎn)品驗證：(1)具有溫度敏感性的三嵌段聚合物，——核磁共振¹hnmr、紅外(2)具有溫度敏感性的膠束，——dls測量其粒徑(3)具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠，——tem、dls測量其粒徑(4)具有溫度、還原雙重敏感性的可以載藥的核殼結構微凝膠，——tem、dls測量其粒徑(5)具有溫度、還原、超聲多重敏感性核殼結構微凝膠。上述(1)-(5)所述的產(chǎn)品都可以通過dls測量其zeta的變化。

發(fā)明詳述：

本發(fā)明者設計了一種具有溫度敏感性的三嵌段聚合物，其結構為peim-b-pnipamn-b-peim，其中聚合度n:20、50、100、150、300，pei分子量m:600、1800、10000。

本發(fā)明提供的這種具有溫度敏感性的三嵌段聚合物具有兩親性，兩端為親水性支化pei，中間是溫度敏感的pnipam。

本發(fā)明提供了這種三嵌段聚合物的制備方法。

本發(fā)明的三嵌段聚合物，其由如下方法制得：

1)在schlenk瓶中，將單體nipam、鏈轉(zhuǎn)移劑雙(羧甲基)三硫代碳酸酯、引發(fā)劑aibn以n:10:1的摩爾比溶于1，4-二氧六環(huán)中，進行atrp聚合，體系在60-70℃下反應6-8h，得到hooc-pnipamn-cooh。(n:20、50、100、150、300)

2)將步驟1)中所述hooc-pnipamn-cooh在40-50℃下旋蒸至粘稠狀，用冰無水乙醚沉降提純3次。過濾分離、30-40℃下真空干燥過夜，得淡黃色粉末狀產(chǎn)物hooc-pnipamn-cooh。

3)將步驟2)中所得hooc-pnipamn-cooh溶解在50mlmes緩沖液中(0.1m，ph5.6)，向其中加入edc和nhs，室溫下預活化10min，邊攪拌邊加入支化pei。氮氣氛下，25℃恒溫振蕩水浴反應24h。32℃下離心10min，除去未反應的hooc-pnipamn-cooh。

4)將反應液升溫至50℃，使產(chǎn)物沉淀，相同溫度下離心得到產(chǎn)物peim-b-pnipamn-b-peim。

本發(fā)明還提供一種具有溫度敏感性的膠束，由上述三嵌段聚合物在水溶液中自組裝所得。

本發(fā)明還提供一種具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠，由上述膠束與交聯(lián)劑bacy加成得到，其制備步驟如下：

1)將peim-b-pnipamn-b-peim溶解在20ml超純水中。氮氣氛下，在溫度高于lcst的條件下磁力攪拌30分鐘。

2)加入交聯(lián)劑bacy，磁力攪拌反應48h，得到核殼結構微凝膠。

本發(fā)明還提供上述具有溫度、還原雙重敏感性的核殼結構微凝膠，所述核殼結構微凝膠是可以載藥的微凝膠，其制備方法如下：

1)25℃下，將權利要求3所述的核殼結構微凝膠和dox分散在20ml磷酸鹽緩沖液中攪拌12h。

2)將分散液離心得到載了藥的核殼結構微凝膠，并用pbs緩沖液洗滌3次，然后真空冷凍干燥48h，得到載了藥的核殼結構微凝膠。

本發(fā)明所述的具有溫度、還原、超聲多重敏感性核殼結構微凝膠在制備控釋藥物上的用途。

本發(fā)明還提供一種具有溫度、還原、超聲敏感性的核殼結構微凝膠，由分子結構為peim-b-pnipamn-b-peim的溫度敏感性聚合物自組裝后通過交聯(lián)、負載全氟分子得到。

本發(fā)明的溫度、還原、超聲敏感性的膠束中，所用交聯(lián)劑為bacy，所用全氟分子選自全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷。

本發(fā)明提供了這種核殼結構微凝膠的制備方法。

本發(fā)明的核殼結構微凝膠，其由如下方法制得：

1)將peim-b-pnipamn-b-peim溶解在20ml超純水中。氮氣氛下，在溫度高于lsct的條件下磁力攪拌30分鐘。

2)加入交聯(lián)劑bacy，磁力攪拌反應48h，得到核殼結構微凝膠。

3)25℃下，將步驟2)所述的核殼結構微凝膠和dox分散在20ml磷酸鹽緩沖液中攪拌12h。

4)將步驟3)中溶液離心得到載了藥的微凝膠，并用pbs緩沖液洗滌3次，然后真空冷凍干燥48h，得到載了藥的核殼結構微凝膠。

5)冰水浴條件下，向裝有步驟4)中所述的核殼結構微凝膠的20ml棕色羅口瓶中逐滴滴加500μl全氟分子。

6)蓋緊瓶蓋后，冰水浴下超聲60s。然后將其轉(zhuǎn)移到10mlpbs緩沖液中，室溫下輕微攪拌12h。得到負載了藥物和全氟分子的核殼結構微凝膠。

附圖說明

圖1是核殼結構微凝膠的透射電子顯微鏡(tem)圖。

圖2是核殼結構微凝膠在37℃下的藥物釋放圖，gsh:還原劑谷胱甘肽，us:超聲，cumulativerelease：累積釋放，time：時間。

圖3是支化pei、hooc-pnipamn-cooh、peim-b-pnipamn-b-peim的紅外光譜圖，wavelength：波數(shù)。

圖4是交聯(lián)劑bacy的核磁共振氫譜，δ：化學位移。

圖5是peim-b-pnipamn-b-peim的核磁共振氫譜，δ：化學位移。

圖6是交聯(lián)的核殼結構微凝膠的核磁共振氫譜，δ：化學位移。

本發(fā)明設計合成了一種具有溫度敏感性的三嵌段聚合物。所述聚合物具有兩親性，兩端為親水性支化pei，中間是溫度敏感的pnipam。nipam的聚合物可為20、50、100、150、300，pei的分子量可為600、1800、10000。

將具有溫度敏感性的三嵌段聚合物自組裝后通過bacy交聯(lián)得到微凝膠作為藥物載體具有一定的溫度、還原敏感性，載藥之后再進行全氟分子的負載，又可以使其具有超聲敏感性，從而具備多重敏感性，可以實現(xiàn)高時空控制的釋藥。

從圖1的透射電子顯微鏡圖可見核殼結構微凝膠的粒徑在100nm左右。

本發(fā)明的微凝膠使用bacy作為交聯(lián)劑，從而帶有可以被還原性試劑選擇性分解的二硫鍵。從圖2可以看出，當加入還原劑gsh后，釋藥速率明顯加快，最終釋放量接近100％，相比于沒有加gsh時40-50％的釋放量有顯著提升。當使用超聲波刺激后，由于所負載的全氟分子的氣化膨脹，破壞了微凝膠的整體結構，使得藥物可以更快的釋放。從圖2可以看出，加入gsh并超聲之后，釋藥速率明顯加快，3h左右即接近100％釋放，相比于只加gsh時需要接近24h才可接近100％釋放有著顯著提升。

由于癌細胞中gsh濃度是正常細胞的10倍，在正常細胞中不會被分解的二硫鍵可以在癌細胞中得到有效分解，從而破壞外殼的整體結構，從而達到釋藥的目的。輔助以超聲手段，還可以實現(xiàn)藥物高時空控制的突釋。

因此，本發(fā)明還提供微凝膠在制備靶向藥物上的用途。

本發(fā)明提供的多重敏感性的微凝膠在藥物釋放方面具有優(yōu)良表現(xiàn)。

具體實施方式

以下用實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發(fā)明最佳實施方式的描述，并不對本發(fā)明的范圍有任何限制。

1、術語說明

nipan:n-異丙基丙烯酰胺；

pei:聚乙烯亞胺；

aibn:偶氮二異丁腈；

mes:2-(n-嗎啉)乙磺酸一水合物；

nhs:n-羥基琥珀酰亞胺；

edc:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；

dox：鹽酸阿霉素；

bacy:n,n-雙(丙烯酰)胱胺；

gsh:谷胱甘肽；

tcep:三(2-羧乙基)膦；

tdd:二硫蘇糖醇；

pbs:磷酸鹽緩沖液；

lcst:低臨界溶解溫度。

2、試劑說明

nipan:百靈威科技有限公司，純度99％；

edc:百靈威科技有限公司，純度99％；

dox：百靈威科技有限公司，純度98％；

aibn:百靈威科技有限公司，純度99％；

pei:上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度99％；

mes:麥克林公司，純度99％；

nhs:麥克林公司，純度98％；

gsh:麥克林公司，純度98％；

bacy：sigma公司，純度98％；

全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷：百靈威科技有限公司，純度>98％；

無水乙醚：國藥集團化學試劑有限公司，純度>99％；

1，4-二氧六環(huán)：麥克林公司，純度99％。

3、儀器說明

zetasizernanos型動態(tài)光散射(dls，英國馬爾文公司)；

紫外可見分光光度計(uv1601pc，日本島津公司)；

紅外光譜儀(nicolet6700，賽默飛世爾科技公司)；

核磁共振譜儀(avanceiii500，德國brucker儀器有限公司)；

ph計(phs-3d，上海精密科學儀器有限公司)；

真空干燥器(dzg-602，上海森信實驗儀器有限公司)；

透射電子顯微鏡(jem-1400，日本jeol公司)；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(n-1001，上海愛朗儀器有限公司)；

高頻數(shù)控超聲波(昆山市超聲儀器有限公司)；

磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；

超聲波信號發(fā)生器(上海比朗儀器制造有限公司)。

實施例1

三嵌段聚合物pei1800-b-pnipam100-b-pei1800自組裝核殼結構微凝膠的制備

聚合物的合成

1)在schlenk瓶中，將單體nipam、鏈轉(zhuǎn)移劑雙(羧甲基)三硫代碳酸酯、引發(fā)劑aibn以100:10:1的摩爾比溶于20ml1，4-二氧六環(huán)中，進行atrp聚合，體系在70℃下反應8h，得到hooc-pnipam100-cooh。

2)將步驟1)中所述hooc-pnipam100-cooh在50℃下旋蒸至粘稠狀，用冰無水乙醚沉降提純3次。過濾分離、30℃下真空干燥過夜，得淡黃色粉末狀產(chǎn)物hooc-pnipam100-cooh。

3)將1g步驟2)中所得hooc-pnipam100-cooh溶解在50mlmes緩沖液中(0.1m，ph5.6)，向其中加入edc(23.7mg，123.6nmol)和nhs(2.7mg，23.5nmol)，室溫下預活化10min，邊攪拌邊加入支化pei(315.8mg，175.4nmol，分子量1800)。氮氣氛下，25℃恒溫振蕩水浴反應24h。32℃下離心10min，除去未反應的hooc-pnipam100-cooh。

4)將反應液升溫至50℃，使產(chǎn)物沉淀，相同溫度下離心得到產(chǎn)物pei1800-b-pnipam100-b-pei1800。

核殼結構微凝膠的制備

1)將40mgpei1800-b-pnipam100-b-pei1800聚合物溶解在20ml超純水中。氮氣氛下，在40℃下磁力攪拌30分鐘。

2)加入4mg交聯(lián)劑bacy，反應48h，得到核殼結構微凝膠。

3)25℃下，將10mg步驟2)所述的核殼結構微凝膠和4mgdox分散在20ml磷酸鹽緩沖液(ph與后續(xù)釋藥時pbs緩沖液ph保持一致)中攪拌12h。

4)將步驟3)中溶液離心得到載了藥的核殼結構微凝膠，并用pbs緩沖液洗滌3次，然后真空冷凍干燥48h，得到載了藥的核殼結構微凝膠。

5)冰水浴條件下，向裝有10mg步驟4)中所述的核殼結構微凝膠的20ml棕色羅口瓶中逐滴滴加500μl全氟己烷。

6)蓋緊瓶蓋后，冰水浴下超聲60s。然后將其轉(zhuǎn)移到10mlpbs緩沖液中，室溫下輕微攪拌12h。得到負載了藥物和全氟己烷的核殼結構微凝膠。

實施例2

三嵌段聚合物pei10000-b-pnipam50-b-pei10000自組裝殼交聯(lián)膠束的制備

聚合物的合成

1)在schlenk瓶中，將單體nipam、鏈轉(zhuǎn)移劑雙(羧甲基)三硫代碳酸酯、引發(fā)劑aibn以50:10:1的摩爾比溶于20ml1，4-二氧六環(huán)中，進行atrp聚合，體系在70℃下反應8h，得到hooc-pnipam50-cooh。

2)將步驟1)中所述hooc-pnipam50-cooh在50℃下旋蒸至粘稠狀，用冰無水乙醚沉降提純3次。過濾分離、30℃下真空干燥過夜，得淡黃色粉末狀產(chǎn)物hooc-pnipam50-cooh。

3)將1g步驟2)中所得hooc-pnipam50-cooh溶解在50mlmes緩沖液中(0.1m，ph5.6)，向其中加入edc(47.3mg，246.7nmol)和nhs(5.1mg，86.8nmol)，室溫下預活化10min，邊攪拌邊加入支化pei(1754.4mg，175.4nmol，分子量10000)。氮氣氛下，25℃恒溫振蕩水浴反應24h。32℃下離心10min，除去未反應的hooc-pnipam50-cooh。

4)將反應液升溫至50℃，使產(chǎn)物沉淀，相同溫度下離心得到產(chǎn)物pei10000-b-pnipam50-b-pei10000。

核殼結構微凝膠的制備

1)將40mgpei10000-b-pnipam50-b-pei10000共聚物溶解在20ml超純水中。氮氣氛下，在40℃下磁力攪拌30分鐘。

2)加入6mg交聯(lián)劑bacy，反應48h，得到核殼結構微凝膠。

3)25℃下，將10mg步驟2)所述的微凝膠和4mgdox分散在20mlpbs緩沖液(注：pbs緩沖液的ph在整個合成到釋藥過程中保持一致)中攪拌12h。

4)將步驟3)中溶液離心得到載了藥的微凝膠，并用pbs緩沖液洗滌3次，然后真空冷凍干燥48h，得到載了藥的核殼結構微凝膠。

5)冰水浴條件下，向裝有10mg步驟4)中所述的殼交聯(lián)膠束的20ml棕色羅口瓶中逐滴滴加500μl全氟戊烷。

6)蓋緊瓶蓋后，冰水浴下超聲60s。然后將其轉(zhuǎn)移到10mlpbs緩沖液中，室溫下輕微攪拌12h。得到負載了藥物和全氟戊烷的核殼結構微凝膠。

實施例3

核殼結構微凝膠釋藥

1.處理透析袋：剪一段10-20cm的截留分子量為3500的透析袋，用純水煮沸后冷卻備用。

2.釋藥：分別取1ml載了藥的核殼結構微凝膠溶液加入3個3500透析袋中，然后分別放入裝有25mlph7.4pbs緩沖液、25mlph6.5pbs緩沖液、25ml含有10mmgsh的ph6.5pbs緩沖液的離心管中。置入37℃，轉(zhuǎn)速150rpm的搖床。每隔1小時取樣測量其紫外吸光度，測完后樣液倒回離心管。

從圖1的透射電子顯微鏡圖可見核殼結構微凝膠的粒徑在100nm左右。

從圖2可見，環(huán)境溫度為37℃時，載藥微凝膠在不同條件下的30小時釋藥情況。當緩沖液中沒有gsh，并不使用超聲時，在ph6.5和7.4條件下釋藥量在40％-50％；當加入gsh的情況下，釋藥量在5h即達到90％左右，最終釋藥量接近100％；當加入gsh且超聲的情況下，釋藥速率明顯加快，3h左右即接近100％釋放。

從圖3可知，對pnipam兩端羧基化后，羧基相互之間締合，出現(xiàn)1715.14cm^-1的羰基峰。說明兩端確實成功修飾了羧基。當加入支化pei合成三嵌段聚合物后，原本的羰基峰消失，證明確實發(fā)生了反應。結合圖5可知，在化學位移2-3處有支化pei上亞甲基氫和端位甲基氫的峰，證明確實得到了三嵌段聚合物peim-b-pnipamn-b-peim。

結合圖4-6分析可知，交聯(lián)劑中二硫鍵邊上亞甲基氫峰化學位移為3.51，其在圖6中同樣出峰，化學位移為3.27。證明交聯(lián)劑確實與聚合物發(fā)生了反應，形成了核殼結構微凝膠。